MỞ ĐẦU Nấm nội sinh là những vi sinh vật sống trong tế bào cây mà không gây ra bất kì tác động tiêu cực nào. Trong nhiều trƣờng hợp, nấm nội sinh có chức năng bảo vệ cây chống lại các loài gây bệnh bên ngoài. Có hai cơ chế liên quan đến khả năng bảo vệ cây này, hoặc các loài nấm nội sinh trực tiếp sản xuất ra các sản phẩm trao đổi chất để tấn công các loài ngoại lai xâm nhập, hoặc chúng sẽ kích thích cơ chế phòng vệ của cây chủ. Nấm nội sinh còn có thể kích thích tăng trƣởng cây bằng cách sản xuất ra hormone thực vật, tổng hợp siderophore, cố định nito, hòa tan các chất khoáng, ức chế ethylene, hoặc trợ giúp quá trình phytoremediation.
Nấm nội sinh có thể đƣợc truyền đi từ thế hệ này sang thế hệ khác thông qua mô cây, hạt, hoặc các phƣơng thức truyền giống thực vật khác. Trong số hơn 300 ngàn loài cây thực vật bậc cao, mỗi cây là vật chủ của một hoặc nhiều loài nấm nội sinh. Tƣơng tác giữa nấm nội sinh và cây chủ tƣơng ứng liên quan đến quá trình đồng sản xuất các phân tử có hoạt tính sinh học, tuy nhiên ngƣời ta vẫn chƣa hiểu hết đƣợc bản chất sự tƣơng tác này. Điều quan trọng là bản chất mối quan hệ cộng sinh xác định rằng các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm nội sinh đều không hại đến tế bào cây và không gây độc, do đó việc ứng dụng chúng trong y tế, chữa trị bệnh cho con ngƣời có tiềm năng rất cao.
Hợp chất tự nhiên là các chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên có hoạt tính sinh học hoặc có tác dụng dƣợc học dùng để làm thuốc. Các hợp chất thiên nhiên đóng vai trò quan trọng trong việc đáp ứng nhu cầu trên thế giới đối với các chất có hoạt tính sinh dƣợc. Những loài nấm nội sinh sống cộng sinh bên trong tế bào thực vật, chúng hiện nay đang đƣợc nghiên cứu sâu và rộng trên thế giới và đƣợc coi nhƣ là nguồn tài nguyên vô tận chƣa khám phá hết với ngành công nghệ sinh học - dƣợc phẩm. Những nghiên cứu về nấm nội sinh có nguồn gốc từ biển đã tìm thấy hơn 270 các hợp chất mới từ những năm 1990 tới giữa năm 2002 (2/3 trong số đó là từ tảo biển và cây 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ngập mặn).
Chỉ trong khoảng 5 năm từ 2002 tới 2006, đã tìm ra hơn 330 các hợp chất mới (là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của nấm nội sinh). Các hợp chất trao đổi chất bậc hai do vi sinh vật sống sản sinh ra là con đƣờng quan trọng để giải quyết nhu cầu thuốc mới trong y tế ngày càng tăng vì giá thành sản xuất rẻ, sự phong phú về cấu trúc, và tính mới. Các loài nấm sống nội sinh trong tế bào cây có thể sản sinh các hợp chất tƣơng tự, hoặc cùng một loại hợp chất sản xuất bởi cây chủ. Cũng có trƣờng hợp nấm có thể sản sinh ra các chất mà ngƣời ta không chiết ra đƣợc từ cây.
Thông qua quá trình lên men vi sinh ở quy mô lớn, các loài nấm nội sinh có thể sản xuất một số lƣợng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học với giá thành rẻ để cung cấp cho ngành công nghiệp sản xuất dƣợc phẩm. Điều quan trọng nữa là khi sử dụng vi sinh vật nội sinh sẽ tránh đƣợc việc khai thác cạn kiệt nguồn tài nguyên thực vật, làm mất sự đa dạng sinh học và đe dọa tuyệt chủng các loài cây, gây hậu quả xấu tới môi trƣờng tự nhiên. Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), thân rễ nghệ vàng chứa tinh dầu, ngoài ra còn có chất curcumin. Theo y học cổ truyền, nghệ vàng đƣợc phân làm hai vị thuốc.
Thân rễ to đƣợc gọi là khƣơng hoàng, các củ nhỏ mọc ra từ thân rễ đƣợc gọi là uất kim. Uất kim thƣờng có màu đỏ hơn. Nghệ không chỉ làm gia vị để tạo màu cho món ăn mà đặc biệt nghệ còn dùng để làm thuốc, có nhiều loại nghệ nhƣng công dụng nhất là loại nghệ vàng. Nghệ vàng có vị đắng cay, có mùi thơm hắc, tính ấm, có tác dụng hành khí phá ứ, thông kinh chỉ thống.
Nghệ vàng dùng để chữa các bệnh: kinh nguyệt không đều, viêm loét dạ dày, ung nhọt, phong thấp, tay chân đau nhức, đặc biệt Nghệ vàng còn dùng để điều trị ung thƣ, HIV, tiểu đƣờng, Alzheimer, viêm gan B, C, kháng nấm, chống oxy hóa, sử dụng trong Mỹ phẩm và Thực phẩm [1]. Hoạt chất Curcumin trong c Nghệ (Curcuma longa L.): Curcumin là thành phần chính của Curcuminoit – một chất trong củ Nghệ, có tên khoa 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com học là (1E,6E)-1,7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5- dione. Curcumin có dạng bột màu vàng đƣợc mệnh danh nhƣ một loại thần dƣợc có khả năng phòng chống và chữa đƣợc rất nhiều loại bệnh: tác dụng chuyển hóa lipid, hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thƣ - cảm ứng apoptosis, chống tăng sinh mạch máu ở khối u, giúp tăng cƣờng miễn dịch, chống đông máu, hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về cây nghệ, nhƣng đối tƣợng nấm nội ký sinh trong cây nghệ thì vẫn chƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu.
Vì vậy phân lập nấm nội ký sinh từ cây nghệ là một hƣớng mới trong nghiên cứu khoa học nói chung và trong lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên nói riêng. Để tìm hiểu về những vấn đề trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh”. Mục tiêu chính của đề tài là tìm ra các chủng nấm nội sinh trong cây nghệ và nghiên cứu thành phần hóa học của chúng. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên từ nấm nội sinh.
3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Nấm nội sinh. Khái niệm và quan hệ giữa nấm nội sinh và thực vật. Nấm nội sinh (Endophytes fungal, Endophytic fungi) là những vi sinh vật sống ở mô sâu thực vật nhƣng không gián tiếp hoặc trực tiếp gây bất lợi cho cây [32].
Endophytes cũng có thể thúc đẩy tăng trƣởng thực vật thông qua các cơ chế khác nhau nhƣ sản xuất phytohormones [10], tổng hợp siderophores [21], cố định đạm [23], hay qua hỗ trợ phytoremediation [24]. Endophytes có thể đƣợc truyền từ một thế hệ kế tiếp thông qua các mô của vật chủ, hạt giống hoặc mầm thực vật [9]. Nghiên cứu đã cho thấy rằng các sản phẩm tự nhiên thu đƣợc từ vi khuẩn endophytic có chống vi khuẩn, chống ung thƣ, chống oxy hóa, chống tiểu đƣờng, ức chế miễn dịch, chống huyết khối, chống viêm và chống bệnh Alzheimer và một số bệnh khác [26]. Giữa nấm nội sinh và thực vật có mối quan hệ cộng sinh hoặc tƣơng sinh, nấm nội sinh xuất phát từ một số bệnh lý thực vật trong quá trình tiến hóa của cây.
Sự tƣơng tác giữa cây chủ và vi sinh vật gây bệnh trong suốt quá trình phát triển lâu dài dẫn đến việc xuất hiện những đột biến gen từ những vi sinh vật gây bệnh để cho ra những chủng nấm nội sinh hữu ích. Chúng đƣợc xem nhƣ là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh [7,32]. Nấm nội sinh thúc đẩy khả năng thích nghi sinh thái của thực vật chủ. Ở một số loài cây cỏ có nấm nội sinh sống, ngƣời ta nhận thấy chúng có khả năng gia tăng sức chịu đựng khô hạn hoặc chịu đƣợc độc tính của nhôm trong nguồn nƣớc, trong môi trƣờng sống… Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi cho kí chủ nhƣ động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều sản phẩm tự nhiên đƣợc sinh ra từ nấm nội sinh cũng đã đƣợc quan sát, theo dõi và đƣợc kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mô thực vật.
Trƣớc thực tế này, một câu hỏi đƣợc đặt ra 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com rằng: các hoạt chất quí giá này do chính cây sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ tƣơng sinh của các nấm nội sinh có ích trong mô thực vật và cây chủ sinh ra [7]. Phân lập nấm nội sinh: Trên thế giới có khoảng 300 nghìn loài thực vật. Đó là một số lƣợng quá lớn mà ta không thể thử nghiệm hết cũng nhƣ không thể chọn lựa một cách ngẫu hứng khi đƣa vào nghiên cứu. Do đó, việc chọn thực vật để phân lập nấm nội sinh cũng cần phải dựa trên những đối tƣợng cây có đặc điểm sinh học.
Một số nguyên tắc cơ bản sau đây thƣờng đƣợc áp dụng: Với thực vật sống trong môi trƣờng sinh học bất thƣờng, môi trƣờng bất thƣờng và các điều kiện tự nhiên khắc nghiệt bắt buộc cây muốn tồn tại thì cần có yếu tố đặc biệt nào đó giúp cây có khả năng chống chịu cao. Và ngƣời ta mong đợi nhân tố đó chính là các nấm nội sinh có ích. Ví dụ: Rhyncholacis penicillata là một loài cây sống dƣới nƣớc ở Tây Nam Venezuela, nơi mà môi trƣờng nƣớc rất khắc nghiệt, cây luôn bị va đập bởi tác dụng nƣớc cuốn, mảnh vụn, đá sỏi…làm cho cây bị tổn thƣơng. Từ đó các nấm gây bệnh thực vật có thể xâm nhập, nhƣng cây vẫn khỏe mạnh, vì cây đƣợc sự bảo vệ bởi các nấm nội sinh có trong cây.
Dựa vào đặc điểm sinh học này, chủng Serratia marcescens đƣợc phân lập từ cây R. penicillata có khả năng sản xuất ra oocydin A, một hợp chất kháng nấm mới [30]. Một số loài thực vật dƣợc liệu dân gian đã đƣợc sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, từ đời này sang đời khác để chữa lành vết thƣơng, kháng nấm, kháng khuẩn…ví dụ nhƣ, Kennedia nigriscans, một loài cây leo ở Úc đã đƣợc dân gian sử dụng sáp nhựa để trị vết thƣơng, sát trùng. Từ cây này đã phân lập đƣợc chủng Streptomyces sp.
NRRL 30562 sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng đƣợc nấm gây bệnh thực vật, vi khuẩn và Plasmodium [11]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Các thực vật có tính đặc thù về sinh thái: tuổi thọ cao bất thƣờng, phát triển trong các vùng có biến đổi sinh học lớn, hay sống trong khu vực đất đai cổ xƣa…cũng là những đối tƣợng nghiên cứu rất lý tƣởng để cung cấp các nấm nội sinh mới lạ. Nấm nội sinh có mặt ở khắp nơi trong thế giới thực vật, số lƣợng của chúng tìm thấy thay đổi tùy thuộc vào bộ phận cây, chủng loại cây và môi trƣờng sống của nó.