MỞ ĐẦU Sự ra đời của một loại thuốc mới có khả năng tiêu diệt và ngăn chặn sự phát triển của tế bào ác tính và đồng thời không hoặc gây độc tính thấp với các mô lành sẽ mở ra cơ hội cứu sống hàng chục triệu người trên thế giới đang phải chống chọi với căn bệnh ung thư hiểm nghèo. Với mục tiêu đó, quy trình sàng lọc dược phẩm tại tất cả các phòng thí ngiệm, viện nghiên cứu, công ty sản xuất dược phẩm trên thế giới đều phải tuân theo những quy định và tiêu chuẩn nghiêm ngặt của các cơ quan và tổ chức kiểm nghiệm dược phẩm. Một quy trình kiểm ngiệm thuốc chống ung thư nói riêng và các loại thuốc khác nói chung có thể kéo dài từ 10-30 năm, gồm nhiều giai đoạn khác nhau, từ phát hiện thuốc, sàng lọc tiền lâm sàng, lâm sàng …với số lượng chất, đối tượng, mục đích thử nghiệm khác nhau nhằm đảm bảo các loại thuốc khi đã trở thành thương phẩm sẽ đạt được hiệu quả điều trị cao và có ít tác dụng phụ nhất cho người bệnh. Sàng lọc tiền lâm sàng trên các dòng tế bào nuôi cấy đơn lớp in vitro (2D) đóng một vai trò không thể thay thế trong giai đoạn đầu tiên của kiểm nghiệm thuốc.
Với số lượng chất có thể lên tới hàng vạn, mô hình nuôi cấy tế bào đơn lớp cho phép nhanh chóng tìm ra nhóm chất có hiệu quả điều trị tốt nhất. Tuy nhiên, thực tế cho thấy rất nhiều chất có độc tính trên mô hình đơn lớp lại không có tác dụng khi thử nghiệm trên đối tượng động vật và do đó không thể tiếp tục phát triển thành thuốc điều trị. Vấn đề này bắt nguồn từ việc các tế bào đơn lớp thiếu hầu hết các đặc điểm của các khối mô ung thư in vivo như cấu trúc không gian, tương tác tế bào, tương tác môi trường… Chính vì vậy, việc phát triển một mô hình in vitro mới mô phỏng được chính xác hơn cấu trúc và các đặc tính của các khối u trong cơ thể sẽ làm tăng đáng kể hiệu quả sàng lọc, hạn chế số lượng thuốc phải thử nghiệm trên động vật thí nghiệm cũng như trên người tình nguyện, từ đó giảm tối thiểu thời gian và chi phí cho việc phát triển một loại Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn cao học thuốc mới cũng như tránh được những trở ngại liên quan tới đạo đức khoa học với các tổ chức bảo vệ động vật, tổ chức nhân quyển, tổ chức y khoa. Để góp phần thực hiện được những mục tiêu đó tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tạo khối cầu đa bào ung thư biểu mô tuyến vú dòng MCF-7” Với các mục tiêu: Tạo khối cầu đa bào ung thư từ dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MCF-7.
Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái, cấu trúc, động học tăng trưởng của các khối cầu đa bào ung thư MCF-7 đã gây tạo. Sử dụng mô hình khối cầu đa bào ung thư MCF-7 để kiểm tra độc tính của hệ thuốc nano (Ptx-Cur)-Co. Nghiên cứu sự xâm nhập và phân bố của hệ thuốc (Ptx-Cur)-Co vào bên trong khối cầu đa bào ung thư MCF-7. Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn cao học 1.Sàng lọc thuốc 1.Quy trình sàng lọc thuốc 1.Quy trình sàng lọc thuốc tiêu chuẩn Tất cả các loại thuốc từ phòng thí nghiệm đến khi trở thành một sản phẩm thương mại đều phải trải qua quy trình đánh giá nghiêm ngặt của các tổ chức kiểm nghiệm dược phẩm với mục đích đảm bảo sự an toàn và hiệu quả trong điều trị.
Đây là con đường duy nhất và có thể kéo dài qua nhiều giai đoạn với thời gian từ vài năm cho tới vài chục năm. Dưới đây là quy trình sàng lọc chung nhất theo quy chuẩn của các cơ quan kiểm nghiệm dược phẩm uy tín thế giới (Hình 1) [72-74]. Bước đầu tiên để các công ty dược hay các viện nghiên cứu phát triển một loại thuốc là tiến hành sàng lọc các hợp chất có tiền năng từ hàng vạn các hợp chất ban đầu trên các mô hình in vitro (drug discovery). Tiếp đó, các hợp chất này sẽ được đưa vào thử nghiệm tiền lâm sàng (pre-clinical) trên mô hình động vật với các cấp độ tăng dần.
Trong giai đoạn này, các tổ chức kiểm nghiệm dựa trên các kết quả kiểm tra tiền lâm sàng để quyết định các chất trên có được phép để đưa vào thử nghiệm trên người hay không. Toàn bộ giai đoạn này diễn ra trong khoảng 6-7 năm. Khi một loại thuốc đã được cho phép để tiến hành sàng lọc trên người bệnh hay còn gọi là sàng lọc lâm sàng (clinical), nó sẽ phải trải qua 3 giai đoạn thử nghiệm với quy mô tăng dần trong thời gian khoảng 6 năm: Giai đoạn I: được tiến hành ở những người khỏe mạnh nhằm kiểm tra các tác dụng phụ của thuốc cũng như sự chuyển hóa và bài tiết của thuốc trong cơ thể. Giai đoạn II: được tiến hành với mục đích kiểm tra hiệu quả và thu thập số liệu sơ bộ về hoạt động của thuốc trên người bệnh.
Bệnh nhân điều trị với loại thuốc đang Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn cao học thử nghiệm sẽ được so sánh với các bệnh nhân không được điều trị hoặc điều trị với một loại thuốc khác song song với đánh giá các tác dụng phụ. Giai đoạn III: các kiểm tra về tính an toàn cũng như hiệu quả sẽ được tiếp tục tiến hành trên các nhóm người bệnh khác nhau, liều lượng thuốc khác nhau cũng như khi kết hợp điều trị cùng với các thuốc khác. Khi đã đạt yêu cầu của cả ba giai đoạn trên, các loại thuốc được thử nghiệm sẽ phải hoàn thành một số thủ tục pháp lý và khoa học trong khoảng thời gian một năm ruỡi để có thể chính thức trở thành một sản phẩm thương mại. Thời gian trung bình cho một quy trình phát triển thuốc.
Quá trình sàng lọc dược phẩm có thể diễn ra trong vài năm tới vài chục năm, từ hàng vạn chất ban đầu tuyển chọn ra một hoặc vài chất đạt yêu cầu kiểm định[74].Quy trình sàng lọc thuốc tiền lâm sàng Sàng lọc tiền lâm sàng là một giai đoạn quan trọng trong toàn quy trình, với mục đích xác định hiệu quả điều trị, độc tính, các dữ liệu dược động học, được tiến hành trên hai đối tượng chính là các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro và trên chuột mang khối Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn cao học u hình thành từ các dòng tế bào ung thư người. Quá trình sàng lọc tiền lâm sàng đối với các chất có hoạt tính chống ung thư gồm các giai đoạn sau [72]: Giai đoạn 1: Các loại thuốc trước tiên sẽ được thử nghiệm với ba dòng tế bào ung thư người với nồng độ thử nghiệm duy nhất trong 48h. Những chất có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một hay nhiều dòng tế bào sẽ được lựa chọn cho giai đoạn tiếp theo. Giai đoạn 2: Trong giai đoạn này, các thuốc thử nghiệm sẽ được tiếp xúc với khoảng 60 dòng tế bào ung thư người với phổ rất rộng bao gồm ung thư phổi, đại tràng, tuyến tiền liệt, buồng trứng, vú, thận với năm nồng độ cách biệt.
Nếu thuốc có khả năng tiêu diệt chọn lọc một dòng tế bào ung thư nhất định hoặc nhiều dòng tế bào khác nhau với cùng một cơ chế tác động hay có hiệu quả gây độc ở nồng độc rất thấp thì sẽ được chuyển sang giai đoạn tiếp theo. Giai đoạn 3: Ở pha cuối cùng của sàng lọc tiền lâm sàng, các chất có tiềm năng sẽ được sử dụng để điều trị cho chuột mang các khối u rắn dưới da. Những loại thuốc có khả năng tiêu diệt hoặc làm chậm quá trình phát triển của các khối u với độc tính và tác dụng phụ thấp nhất cho đối tượng thí nghiệm sẽ được đưa lên sàng lọc trên người bệnh (lâm sàng).Các mô hình sàng lọc thuốc tiền lâm sàng Các mô hình đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc sàng lọc dược phẩm. Tùy vào từng giai đoạn của quá trình sàng lọc thuốc, các mô hình này sẽ được lựa chọn một cách thích hợp nhằm đảm bảo các thử nghiệm được tiến hành nhanh chóng, hiệu quả nhất mà vẫn đảm bảo được các vấn đề đạo đức trong khoa học.
Với số lượng chất phải sàng lọc tại khâu đầu tiên có thể lên tới hàng vạn thì việc sử dụng các mô hình in vitro như trên tế bào đơn lớp, cơ quan nuôi cấy là rất cần thiết để có thể nhanh chóng khu trú được các nhóm chất có hiệu quả cũng như thu thập các số liệu sơ bộ về độc tính, các tác dụng Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn cao học không mong muốn của chúng trước khi đưa lên các mô hình ở cấp độ cao hơn. Từ những kết quả thu được ban đầu, các kiểm tra tiếp theo trên mô hình động vật – mô hình in vivo sẽ tiết kiệm thời gian, kinh phí hơn rất nhiều thông qua giảm thiểu được số lượng chất, số lượng động vật tham gia các thử nghiệm.Mô hình in vitro Mô hình nuôi cấy cơ quan Đây là loại mô hình nuôi cấy cổ điển nhất được sử dụng từ những năm 1950. Các cơ quan được tách ra khỏi cơ thể, đem nuôi cấy in vitro. Sau đó, chúng được tương tác với các hợp chất cần thử.
Ưu điểm của mô hình này là duy trì được tính nguyên vẹn của mô cũng như mối quan hệ giữa tế bào với tế bào, nhờ vậy mà nó có tính tương đồng hơn với điều kiện in vivo. Tuy nhiên, do những khó khăn khác biệt về mẫu vật mà việc đánh giá hiệu quả của thuốc có nhiều sai số, do vậy việc sử dụng mô hình này bị hạn chế, và khó để áp dụng vào sàng lọc thuốc quy mô lớn [4]. Nuôi cấy tinh hoàn chuột để sản xuất tinh trùng in vitro. (A) Các mảnh tinh hoàn nuôi trên giá thể agarose trong môi trường nuôi cấy có bổ sung KBR.
(B) Mô tinh hoàn nuôi cấy sau 7 ngày. Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn cao học Mô hình nuôi cấy tế bào đơn lớp (2D) Đây là mô hình nuôi cấy phổ biến nhất tại tất cả các phòng thí nghiệm trên thời giới trong nhiều thập kỷ qua.