Đánh Giá Khả Năng Tiêu Diệt Sâu Xanh Bướm Trắng (Pieris rapae L.) Của Một Số Chủng Bacillus spp.

Nghiên cứu khả năng diệt sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) bằng chủng Bacillus spp. Giải pháp sinh học tiềm năng, an toàn, hiệu quả cho nông nghiệp.

• Tác giả: Nguyễn Thị Lan Phương
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Minh
• Trường học: Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Nông nghiệp – Môi trường
• Đề tài: Đánh Giá Khả Năng Tiêu Diệt Sâu Xanh Bướm Trắng (Pieris rapae L.) Của Một Số Chủng Bacillus spp.
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂU XANH BƯỚM TRẮNG (Pieris rapae L.)
• 1.2. Vị trí phân loại
• 1.3. Đặc điểm sinh vật học của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.)
• 1.4. Tác hại của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.)
• 1.5. Biện pháp phòng trừ sinh học sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.)
• 1.6. GIỚI THIỆU VỀ Bacillus
• 1.7. Đặc điểm phân loại
• 1.8. Tình hình nghiên cứu Bacillus trong phòng trừ sinh học
• 1.9. KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH LOÀI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ (PCR)
• 1.9.1. Định nghĩa PCR
• 1.9.2. Vùng ribosome 16S RNA
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ
• 2.3. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
• 2.4.1. Bố trí thí nghiệm
• 2.4.2. Hoạt hóa các chủng vi khuẩn tiềm năng
• 2.4.3. Khảo sát hoạt tính tiêu diệt sâu của chủng vi khuẩn tiềm năng
• 2.4.4. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa
• 2.4.5. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ HOẠT HÓA VI KHUẨN TIỀM NĂNG
• 3.1.1. Kết quả quan sát đại thể
• 3.1.2. Kết quả quan sát vi thể
• 3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH TIÊU DIỆT SÂU CỦA CHỦNG VI KHUẨN TIỀM NĂNG
• 3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA
• 3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ
• 3.4.1. Kết quả giải trình tự
• 3.4.2. Kết quả dựng cây phát sinh loài
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Sâu Xanh Bướm Trắng và Tác Hại Khôn Lường

Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) là một đối tượng gây hại nghiêm trọng cho nhiều loại cây trồng, đặc biệt là rau họ cải. Chúng phân bố rộng rãi và gây thiệt hại đáng kể cho nền kinh tế nông nghiệp. Ấu trùng sâu xanh bướm trắng ăn lá cây ký chủ, ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây. Khi mật độ cao, chúng có thể làm trơ trụi ruộng rau, gây mất năng suất. Biện pháp phòng trừ hóa học thường được sử dụng, nhưng lạm dụng thuốc trừ sâu có thể gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Do đó, việc tìm kiếm các biện pháp biện pháp sinh học an toàn và hiệu quả là vô cùng quan trọng. Theo số liệu của Cục BVTV, dư lượng thuốc trừ sâu vượt mức cho phép trong rau quả vẫn còn là một vấn đề nhức nhối.

1.1. Đặc Điểm Sinh Học Của Sâu Xanh Bướm Trắng Pieris rapae

Trưởng thành có thân màu đen, hai cánh trắng, đỉnh cánh có vết đen. Trứng màu hơi vàng, sâu non màu xanh lục, trên lưng có những điểm đen nhỏ. Sâu non có 5 tuổi, khi đẫy sức dài khoảng 28-35 mm. Nhộng màu xanh, khi gần vũ hóa chuyển màu xanh hơi vàng. Vòng đời của sâu xanh bướm trắng từ 26 - 30 ngày, sâu phát sinh và gây hại nặng từ tháng 10 năm trước đến tháng 5 năm sau, nhưng thường nặng nhất từ tháng 2 đến tháng 5. Bướm hoạt động ban ngày, mỗi bướm cái có thể đẻ từ 50-200 trứng.

1.2. Tác Hại Kinh Tế Do Sâu Xanh Bướm Trắng Gây Ra Cho Nông Nghiệp

Ấu trùng sâu xanh bướm trắng ăn lá cây ký chủ, ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây, có thể ăn thủng lá hoặc gặm ngoài cạnh lá sâu vào trong. Đặc biệt chất thải của chúng rất lớn ảnh hưởng sự sinh trưởng của cây rau. Khi bị phá hại sẽ gây ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây, ở mật độ cao chúng làm cho các ruộng rau trở nên xơ xác, mất năng suất. Theo Capinera (2000), nếu không tiêu diệt chúng thì sẽ ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây.

II. Bacillus spp

Bacillus spp., đặc biệt là Bacillus thuringiensis (Bt) và Bacillus subtilis, là những vi khuẩn có khả năng tiêu diệt côn trùng gây hại, trong đó có sâu xanh bướm trắng. Bacillus thuringiensis tạo ra các protein tinh thể độc hại cho côn trùng, được sử dụng rộng rãi làm thuốc trừ sâu sinh học. Bacillus subtilis cũng có khả năng phòng trừ sâu bệnh thông qua cơ chế cạnh tranh và sản sinh các chất kháng sinh. Việc ứng dụng Bacillus spp. trong nông nghiệp hữu cơ và quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) ngày càng được quan tâm. Nhiều nghiên cứu cho thấy hiệu quả phòng trừ của Bacillus spp. tương đương hoặc thậm chí vượt trội so với thuốc trừ sâu hóa học.

2.1. Cơ Chế Tác Động Của Bacillus thuringiensis Bt Lên Sâu Xanh

Bacillus thuringiensis (Bt) tạo ra các protein tinh thể (Cry toxins) độc hại cho côn trùng. Khi côn trùng ăn phải, protein này sẽ liên kết với thụ thể trong ruột giữa, gây tê liệt ruột và dẫn đến cái chết của côn trùng. Quá trình này diễn ra một cách chọn lọc, chỉ ảnh hưởng đến một số loài côn trùng nhất định, do đó Bacillus thuringiensis an toàn hơn so với thuốc trừ sâu hóa học. Theo Phạm Thị Thùy (2004), sau khi ăn phải tinh thể độc của Bacillus thuringiensis, côn trùng ngừng ăn vì ruột bị tê liệt, sau 3 - 4 ngày thì côn trùng chết.

2.2. Ưu Điểm Vượt Trội Của Biện Pháp Phòng Trừ Bằng Bacillus spp.

Bacillus spp. có nhiều ưu điểm so với thuốc trừ sâu hóa học, bao gồm: an toàn sinh học cho người và động vật không phải mục tiêu, không gây ô nhiễm môi trường, không gây kháng thuốc trừ sâu ở côn trùng, và phù hợp với nông nghiệp hữu cơ. Ngoài ra, Bacillus spp. có thể được sản xuất hàng loạt với chi phí thấp, dễ dàng ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp quy mô lớn. Việc sử dụng Bacillus spp. giúp bảo vệ hệ sinh thái và đảm bảo an toàn thực phẩm.

III. Nghiên Cứu Khả Năng Tiêu Diệt Sâu Xanh Bướm Trắng Bằng Bacillus

Nghiên cứu đánh giá khả năng tiêu diệt sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) của một số chủng Bacillus spp. đã được thực hiện nhằm tìm ra những chủng có hoạt lực cao nhất. Các thí nghiệm được tiến hành trong phòng thí nghiệm, sử dụng các chủng Bacillus phân lập từ các nguồn khác nhau. Hoạt tính diệt sâu của các chủng Bacillus được đánh giá dựa trên tỷ lệ chết của sâu xanh bướm trắng sau khi tiếp xúc với vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu cho thấy một số chủng Bacillus có khả năng tiêu diệt sâu xanh bướm trắng rất hiệu quả, mở ra tiềm năng ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp.

3.1. Phương Pháp Nghiên Cứu Khảo Sát Hoạt Tính Diệt Sâu Của Bacillus

Nghiên cứu sử dụng phương pháp thí nghiệm trong phòng thí nghiệm để khảo sát hoạt tính diệt sâu xanh bướm trắng của các chủng Bacillus spp. Sâu non được cho ăn lá rau cải đã được phun dung dịch chứa vi khuẩn Bacillus. Tỷ lệ chết của sâu non được theo dõi và ghi nhận hàng ngày. Đối chứng được sử dụng là sâu non được cho ăn lá rau cải không phun dung dịch Bacillus. Kết quả được phân tích thống kê để đánh giá hiệu quả phòng trừ của các chủng Bacillus.

3.2. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Hiệu Quả Diệt Sâu Của Chủng Bacillus

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hiệu quả diệt sâu của các chủng Bacillus, bao gồm: liều lượng Bacillus, thời điểm phun Bacillus, điều kiện môi trường (nhiệt độ, độ ẩm), và độ nhạy cảm của sâu xanh bướm trắng với độc tố của Bacillus. Việc tối ưu hóa các yếu tố này sẽ giúp nâng cao hiệu quả phòng trừ và giảm thiểu chi phí sản xuất. Cần lựa chọn thời điểm phun Bacillus khi sâu non còn nhỏ, phun vào buổi tối hoặc sáng sớm khi điều kiện môi trường thuận lợi.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Tiềm Năng Ứng Dụng Bacillus Trong Nông Nghiệp

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số chủng Bacillus spp. có khả năng tiêu diệt sâu xanh bướm trắng rất hứa hẹn. Các chủng này có thể được sử dụng để sản xuất các chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học hiệu quả và an toàn. Việc ứng dụng các chế phẩm này trong nông nghiệp hữu cơ và quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) sẽ giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, bảo vệ môi trường và sức khỏe con người. Nghiên cứu cần được tiếp tục mở rộng để đánh giá phổ tác dụng và tính chọn lọc của các chủng Bacillus này.

4.1. Đánh Giá Hiệu Quả Phòng Trừ Sâu Xanh Bướm Trắng Trên Đồng Ruộng

Để đánh giá chính xác hiệu quả phòng trừ của các chế phẩm Bacillus, cần tiến hành các thí nghiệm trên đồng ruộng. Các thí nghiệm này sẽ giúp xác định liều lượng và thời điểm phun phù hợp, cũng như đánh giá tác động của chế phẩm lên các loài côn trùng có ích và môi trường. Kết quả của các thí nghiệm đồng ruộng sẽ là cơ sở để khuyến cáo sử dụng rộng rãi các chế phẩm Bacillus trong sản xuất nông nghiệp.

4.2. Triển Vọng Phát Triển Các Sản Phẩm Thuốc Trừ Sâu Sinh Học Từ Bacillus

Việc nghiên cứu và phát triển các sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ Bacillus có nhiều triển vọng trong tương lai. Các sản phẩm này có thể được cải tiến về hiệu quả phòng trừ, tính ổn định, và dễ sử dụng. Đồng thời, cần nghiên cứu các phương pháp sản xuất Bacillus quy mô lớn với chi phí thấp để đảm bảo khả năng tiếp cận của người nông dân. Sự phát triển của các sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ Bacillus sẽ góp phần xây dựng một nền nông nghiệp bền vững và an toàn.

V. Kết Luận Bacillus spp

Bacillus spp., đặc biệt là Bacillus thuringiensis, hứa hẹn là một giải pháp bền vững và hiệu quả để kiểm soát sâu xanh bướm trắng trong nông nghiệp. Nghiên cứu cho thấy khả năng tiêu diệt sâu xanh bướm trắng của một số chủng Bacillus rất cao, mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học an toàn và thân thiện với môi trường. Việc ứng dụng rộng rãi Bacillus spp. sẽ góp phần giảm thiểu sự phụ thuộc vào thuốc trừ sâu hóa học, bảo vệ sức khỏe cộng đồng và hệ sinh thái. Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các chủng Bacillus mới với phổ tác dụng rộng hơn và hiệu quả phòng trừ cao hơn.

5.1. Các Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Ứng Dụng Bacillus Trong Nông Nghiệp

Các hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus mới với khả năng tiêu diệt côn trùng gây hại cao hơn, nghiên cứu cơ chế tác động của Bacillus lên côn trùng, phát triển các công thức chế phẩm Bacillus bền vững và dễ sử dụng, và đánh giá tác động của Bacillus lên các loài côn trùng có ích và môi trường. Ngoài ra, cần nghiên cứu các phương pháp phối hợp Bacillus với các biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) khác để nâng cao hiệu quả phòng trừ.

5.2. Chính Sách Hỗ Trợ Phát Triển và Ứng Dụng Thuốc Trừ Sâu Sinh Học

Nhà nước cần có các chính sách hỗ trợ phát triển và ứng dụng thuốc trừ sâu sinh học, bao gồm: đầu tư vào nghiên cứu và phát triển, hỗ trợ sản xuất và phân phối, khuyến khích người nông dân sử dụng, và xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học. Đồng thời, cần tăng cường công tác tuyên truyền và giáo dục để nâng cao nhận thức của cộng đồng về lợi ích của việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học và nông nghiệp hữu cơ.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với độ ẩm không khí cao, tạo điều kiện sinh thái thuận lợi cho sự phát sinh và gây hại của nhiều loài côn trùng nông - lâm nghiệp. Trong đó, các loài côn trùng thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera) — với hơn 180.000 loài đã được mô tả trên thế giới — là nhóm dịch hại nghiêm trọng đối với sản xuất nông nghiệp (Nguyễn Thị Hiền, 2012). Để kiểm soát dịch hại, các nhóm thuốc trừ sâu hóa học như organophosphate và carbamate thường xuyên được sử dụng trên diện rộng (Whalon, 2013).

Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đã gây ra những hệ lụy môi trường và sức khỏe cộng đồng. Dư lượng thuốc tồn tại lâu trong đất, gây ô nhiễm nguồn nước ngầm và tích lũy trong nông sản thực phẩm (Ghribi, 2007). Theo số liệu của Cục Bảo vệ thực vật giai đoạn 2000–2002, tỷ lệ mẫu rau, nho, chè có dư lượng thuốc vượt ngưỡng cho phép tại Hà Nội dao động từ 10% đến 26%, tại TP. Hồ Chí Minh từ 10% đến 30%. Kết quả điều tra năm 2010 tại vùng chuyên canh rau đồng bằng sông Hồng ghi nhận số lần phun thuốc trung bình từ 26 đến 32 lần/năm (tương đương 11,1–25,6 kg hoạt chất ai/ha); trong đó 5,19% số hộ sử dụng thuốc cấm hoặc ngoài danh mục, 10,22% không tuân thủ thời gian cách ly và 51% không thực hiện đúng khuyến cáo trên nhãn bao bì (Cục BVTV, 2000, 2010). Tình trạng này làm gia tăng tính kháng thuốc của sâu hại, tiêu diệt thiên địch tự nhiên và dẫn đến nguy cơ bùng phát dịch hại thứ cấp.

Trong nhóm cây rau họ Thập tự (Brassicaceae), sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.), thuộc họ Bướm phấn (Pieridae), bộ Cánh vảy (Lepidoptera), là đối tượng gây hại phổ biến và nghiêm trọng (Bộ môn Côn trùng, 2004). Ấu trùng của loài này cắn phá phiến lá, ăn khuyết lá tạo thành các lỗ thủng xơ xác và thải phân làm giảm chất lượng thương phẩm của bắp cải, súp lơ. Các biện pháp phòng trừ sinh học — đặc biệt là việc ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) — mang lại ưu thế chọn lọc cao, không gây độc cho người và gia súc, không gây ô nhiễm môi trường và duy trì cân bằng hệ sinh thái (Trần Văn Mão, 2002).

Từ bộ sưu tập vi sinh vật sẵn có tại phòng thí nghiệm, đề tài được thực hiện nhằm giải quyết mục tiêu tổng quát: Tuyển chọn thành công chủng Bacillus spp. có hoạt lực mạnh trong diệt sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) hại cây trồng làm cơ sở khoa học cho việc tạo chế phẩm sinh học.

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể bao gồm 3 nhiệm vụ:

1. Hoạt hóa các chủng vi khuẩn Bacillus spp. tiềm năng từ nguồn lưu trữ.
2. Khảo sát hoạt tính diệt sâu xanh bướm trắng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. ở các nồng độ và thời gian khác nhau.
3. Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn có hoạt tính mạnh nhất bằng phương pháp sinh hóa và sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S rRNA).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng sinh học: Sâu non tuổi 2 và tuổi 3 của loài sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) thu nhận trực tiếp từ các vườn rau tại huyện Krông Năng, tỉnh Đắk Lắk; các chủng vi khuẩn tiềm năng gồm BT1, BT2 (từ Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở TP.HCM) và chủng đối chứng chuẩn Bacillus thuringiensis VTCC 10525 (từ Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội).
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 09/2019 đến tháng 07/2020.
• Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh 1 và 2, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở TP.HCM (cơ sở 3, tỉnh Bình Dương).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên các cơ sở lý luận phân loại học, sinh học côn trùng và kỹ thuật vi sinh - sinh học phân tử:

• Phân loại học và đặc điểm sinh học sâu xanh bướm trắng: Theo khóa phân loại của Linnaeus (1758) và tài liệu của Hồ Khắc Tín (1999), Pieris rapae L. có vòng đời 26–30 ngày (trứng 6–8 ngày, sâu non 10–14 ngày qua 5 tuổi, nhộng 7–8 ngày, bướm trưởng thành sống 2–5 tuần và đẻ 50–200 trứng). Sâu phát sinh và gây hại nặng từ tháng 10 năm trước đến tháng 5 năm sau, đỉnh điểm vào tháng 2 đến tháng 5 (Nguyễn Văn Đĩnh, 2004; Nguyễn Mạnh Phương, 2011).
• Đặc điểm vi khuẩn chi Bacillus và cơ chế diệt côn trùng: Phân loại theo Holt và cs. (1990), Bacillus thuộc ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae. Đây là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng sinh nội bào tử chịu nhiệt. Bacillus thuringiensis tổng hợp protein tinh thể độc tố đường ruột ($\delta$-endotoxin) trong quá trình tạo bào tử và ngoại độc tố $\beta$-exotoxin làm tê liệt đường tiêu hóa sâu hại (Joan L., 2007; Phạm Thị Thùy, 2004; Trần Quang Hùng, 1995).
• Lý thuyết định danh phân tử vùng gen 16S rRNA: Sử dụng kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen ribosome 16S RNA kích thước khoảng 1500 bp mang các vùng trình tự bảo tồn và biến đổi đặc trưng cho từng bậc phân loại vi khuẩn nhân sơ (Saiki, 1988; Yu S., 2009; Kim M., 2012).

Phương pháp thực nghiệm được triển khai tuần tự theo các quy trình tiêu chuẩn:

• Hoạt hóa và kiểm tra độ thuần: Cấy ria trên môi trường Nutrient Agar (NA), ủ ở 37°C trong 24–48 giờ; quan sát hình thái khuẩn lạc (đại thể); nhuộm Gram bằng bộ thuốc nhuộm Crystal Violet, dung dịch Lugol, cồn 96° và Safranin O; nhuộm bào tử bằng Carbolic Fuchsin và Methylene Blue (Nguyễn Lân Dũng, 1999; Nguyễn Đức Lượng và cs., 2003).
• Lên men và chuẩn bị dịch khuẩn: Nuôi cấy lắc lỏng trong môi trường Nutrient Broth (NB) ở 37°C, tốc độ 200 vòng/phút trong 72 giờ. Pha loãng dịch khuẩn thành 4 nồng độ thử nghiệm: nồng độ 1 (dịch nguyên, mật độ $10^9$ CFU/mL), nồng độ 1:2 ($5 \times 10^8$ CFU/mL), nồng độ 1:4 ($2,5 \times 10^8$ CFU/mL) và nồng độ 1:8 ($1,25 \times 10^8$ CFU/mL). Mật độ bào tử xác định qua xử lý nhiệt 70°C trong 10 phút, cấy trang ở độ pha loãng $10^{-5}$ và tính theo công thức: $X = \frac{n \times 10}{a}$ (CFU/mL).
• Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu sinh học (Bioassay): Bố trí thí nghiệm theo phương pháp nhúng thức ăn (lá cải tươi) vào dịch khuẩn. Mỗi nghiệm thức gồm 3 hộp vô trùng, mỗi hộp chứa 10 sâu non tuổi 2–3, đặt ở nhiệt độ 25°C. Theo dõi tỷ lệ sâu chết tại các mốc 24h, 48h và 72h. Hiệu lực tiêu diệt sâu ($A%$) được hiệu chỉnh theo công thức Abbott (1925): $$A = \frac{C - T}{C} \times 100$$ (trong đó $C$ là số sâu sống ở lô đối chứng, $T$ là số sâu sống ở lô thí nghiệm). Số liệu được phân tích phương sai ANOVA và kiểm định sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng phép thử Duncan ($p < 0,05$).
• Định danh sinh hóa: Kiểm tra 27 chỉ tiêu sinh lý - sinh hóa theo khóa phân loại Cowan và Steel (Catalase, Oxidase, ONPG, Indole, Nitrat reductase, Simmon's Citrate, khả năng di động với thuốc thử TTC 1%, thủy phân Casein trên NA sữa gầy 5%, thủy phân tinh bột với Lugol, Voges–Proskauer, lên men các loại đường Glucose, Xylose, Cellobiose, Mannose, Melibiose, Raffinose, Salicin, khả năng phát triển ở 10% NaCl, phát triển ở 50°C và phát triển trong điều kiện kỵ khí).
• Định danh sinh học phân tử: Tách chiết DNA, giải trình tự đoạn gen 16S rRNA tại Công ty Cổ phần Công nghệ TBR. So sánh độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI). Sắp gióng trình tự bằng ClustalX và Annhyb. Lựa chọn mô hình tiến hóa tốt nhất dựa trên điểm số BIC (Bayesian Information Criterion) và xây dựng cây phát sinh loài theo thuật toán Maximum Likelihood (ML) bằng phần mềm MEGA 6.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Tổng quan tài liệu

Nội dung chương tổng hợp hệ thống các công trình nghiên cứu về vị trí phân loại, chu kỳ phát triển, tập tính gây hại của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) cũng như các biện pháp sinh học kiểm soát sâu hại (sử dụng ong ký sinh Apanteles glomeratus, vi nấm, virus đa diện nhân NPV, virus hạt GV). Phân tích chi tiết đặc điểm hình thái, sinh lý và cơ chế sản sinh độc tố nội bào tử ($\delta$-endotoxin) và ngoại độc tố ($\beta$-exotoxin) của chi Bacillus. Tổng hợp các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước về hiệu quả của các chủng Bt phòng trừ sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu xanh (Helicoverpa armigera). Giới thiệu nguyên lý khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR và tính ứng dụng của vùng gen 16S rRNA trong định danh vi sinh vật.

Phần 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết địa điểm, thời gian, danh mục hóa chất, môi trường nuôi cấy (NA, NB, Clark-Lubs, Simmon’s Citrate...) và trang thiết bị thực nghiệm. Thiết lập sơ đồ bố trí thí nghiệm từ khâu hoạt hóa vi khuẩn, nuôi cấy lắc thu nhận dịch bào tử, bố trí các nghiệm thức thử nghiệm sinh học trên ấu trùng sâu hại cải, đến quy trình thực hiện 27 phép thử sinh hóa và các bước xử lý dữ liệu tin sinh học phục vụ định danh loài.

Phần 3: Kết quả và thảo luận

Chương này công bố toàn bộ dữ liệu thực nghiệm thu được qua các giai đoạn nghiên cứu:

1. Kết quả hoạt hóa và hình thái học: Các chủng vi khuẩn đều biểu hiện đặc trưng điển hình của chi Bacillus, đảm bảo độ thuần khiết vi sinh vật.

Mã chủng	Đặc điểm khuẩn lạc (Đại thể)	Màu sắc	Bề mặt	Hình thái vi thể (Nhuộm Gram & Bào tử)	Cách sắp xếp
BT1	Bờ răng cưa, tâm nhô	Trắng ngà	Khô, nhô	Trực khuẩn ngắn, Gram (+), có nội bào tử	Dạng chuỗi
BT2	Bờ răng cưa, tâm nhăn, có vòng	Trắng ngà	Khô, nhăn	Trực khuẩn mảnh, Gram (+)	Dạng chuỗi
VTCC 10525	Tròn dẹt, mép không đều	Trắng ngà	Lăn tăn dạng hạt	Trực khuẩn ngắn, Gram (+), có nội bào tử	Dạng chuỗi

2. Hiệu lực tiêu diệt sâu xanh bướm trắng: Hiệu lực diệt sâu tăng dần theo thời gian tiếp xúc và tỷ lệ thuận với nồng độ dịch khuẩn. Thời điểm biểu hiện hoạt tính rõ rệt nhất là sau 72 giờ.

Chủng vi khuẩn	Thời gian (giờ)	Nồng độ 1 ($10^9$ CFU/mL)	Nồng độ 1:2 ($5 \times 10^8$ CFU/mL)	Nồng độ 1:4 ($2,5 \times 10^8$ CFU/mL)	Nồng độ 1:8 ($1,25 \times 10^8$ CFU/mL)
BT1	24h	$6,16 \pm 10,63^{\text{a}}$	$0,03 \pm 0,00^{\text{a}}$	$0,03 \pm 0,00^{\text{a}}$	$0,03 \pm 0,00^{\text{a}}$
	48h	$35,22 \pm 3,48^{\text{a}}$	$28,78 \pm 3,84^{\text{a}}$	$26,07 \pm 7,40^{\text{a}}$	$6,16 \pm 10,63^{\text{b}}$
	72h	$90,51 \pm 16,40^{\text{a}}$	$59,00 \pm 3,84^{\text{b}}$	$41,15 \pm 3,33^{\text{c}}$	$28,78 \pm 3,84^{\text{c}}$
BT2	24h	$0,03 \pm 0,00^{\text{a}}$	$0,03 \pm 0,00^{\text{a}}$	$0,03 \pm 0,00^{\text{a}}$	$0,03 \pm 0,00^{\text{a}}$
	48h	$17,23 \pm 16,63^{\text{a}}$	$15,01 \pm 13,60^{\text{a}}$	$6,16 \pm 10,63^{\text{a}}$	$0,03 \pm 0,00^{\text{a}}$
	72h	$30,79 \pm 7,31^{\text{a}}$	$23,86 \pm 4,69^{\text{ab}}$	$15,01 \pm 13,60^{\text{abc}}$	$12,30 \pm 10,63^{\text{bc}}$
VTCC 10525	24h	$61,22 \pm 3,83^{\text{a}}$	$52,86 \pm 6,81^{\text{ab}}$	$48,93 \pm 8,92^{\text{b}}$	$43,08 \pm 3,33^{\text{b}}$
(Đối chứng chuẩn)	48h	$81,03 \pm 16,41^{\text{a}}$	$59,00 \pm 3,83^{\text{b}}$	$53,07 \pm 9,43^{\text{b}}$	$46,92 \pm 6,66^{\text{b}}$
	72h	$99,98 \pm 0,00^{\text{a}}$	$75,61 \pm 21,10^{\text{b}}$	$61,71 \pm 8,53^{\text{b}}$	$55,07 \pm 9,33^{\text{b}}$

(Ghi chú: Trong cùng một hàng, các giá trị mang cùng chữ cái đi kèm không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê ở mức $p < 0,05$ qua phép thử Duncan).

3. Kết quả định danh chủng vi khuẩn BT1:

• Sinh hóa: Chủng BT1 cho kết quả dương tính với Catalase, Oxidase, Nitrat reductase, Voges-Proskauer, phân giải Tinh bột, phân giải Casein, lên men Glucose, lên men Salicin, khả năng di động và sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí; âm tính với ONPG, Indole, Simmon's Citrate, lên men Cellobiose, Mannose, Melibiose, Raffinose, Xylose, không sinh trưởng ở 10% NaCl và không phát triển ở 50°C. Đối chiếu với khóa phân loại Cowan và Steel, chủng BT1 tương đồng 88,88% (24/27 thử nghiệm) với loài Bacillus thuringiensis.
• Sinh học phân tử: Kết quả giải trình tự vùng gen 16S rRNA của chủng BT1 khi tra cứu BLAST trên NCBI cho độ tương đồng 99% với loài Bacillus thuringiensis (mã số truy cập Accession: NR_112780.1), độ bao phủ (query coverage) đạt 99,39% và chỉ số E-value đạt 0.0. Cây phát sinh loài xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood trong MEGA 6 khẳng định vị trí phân loại của chủng BT1 thuộc loài Bacillus thuringiensis.

Phần 4: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các kết quả đạt được về tuyển chọn chủng BT1 có hoạt lực mạnh và xác định chính xác danh tính sinh học của chủng. Đưa ra các đề xuất về hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao hiệu quả ứng dụng thực tiễn.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

• Đã hoạt hóa thành công và đánh giá tính chất hình thái, vi thể của 2 chủng vi khuẩn tiềm năng (BT1, BT2) và 1 chủng đối chứng (B. thuringiensis VTCC 10525).
• Xác định được chủng BT1 có hoạt tính diệt sâu xanh bướm trắng cao vượt trội so với chủng BT2 và tiệm cận chủng chuẩn VTCC 10525. Ở nồng độ dịch nguyên ($10^9$ CFU/mL), sau 72 giờ xử lý, hiệu lực tiêu diệt sâu của chủng BT1 đạt $90,51 \pm 16,40%$ (so với chủng đối chứng chuẩn VTCC 10525 đạt $99,98 \pm 0,00%$ và chủng BT2 đạt $30,79 \pm 7,31%$).
• Xác định được mối tương quan giữa nồng độ dịch khuẩn và thời gian tác động đến tỷ lệ tử vong của ấu trùng: hiệu lực tiêu diệt sâu giảm dần khi độ pha loãng tăng từ dịch nguyên về 1:8 ($1,25 \times 10^8$ CFU/mL chỉ đạt hiệu lực $28,78 \pm 3,84%$ ở 72h đối với BT1).
• Định danh chính xác chủng BT1 là Bacillus thuringiensis dựa trên sự kết hợp đồng thời giữa 27 chỉ tiêu sinh lý - sinh hóa theo Cowan và Steel (độ tương đồng 88,88%) và phân tích trình tự gen 16S rRNA (độ tương đồng 99%, query cover 99,39%, E-value 0.0 đối với mã số NR_112780.1 trên NCBI).

Đối chiếu với các công bố khoa học liên quan

Tác giả đã đối chiếu hoạt tính của chủng BT1 với các nghiên cứu trước:

• Tương đương với hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của chủng Btk14 đạt 88,89% ở nồng độ $10^9$ bào tử/mL sau 72 giờ trong nghiên cứu của Nguyễn Thiện Phú (2013).
• Cao hơn kết quả diệt sâu tơ (80%) và sâu xanh da láng (50%) ở nồng độ $10^7 - 10^9$ bào tử/mL sau 72 giờ của chủng Bta do Nguyễn Thị Hiền (2012) công bố.
• Đạt hiệu lực cao trong thời gian ngắn (72 giờ) so với hiệu lực phòng trừ sâu xanh bướm trắng của các dòng chế phẩm Metavina (Metavina 90DP đạt 83,33%, Metavina 80LS đạt 80,0%, Metavina 10DP đạt 56,67% nhưng cần tới 10 ngày xử lý) theo nghiên cứu của Nguyễn Mạnh Phương (2012).

Đề xuất và kiến nghị của tác giả

• Tiếp tục nghiên cứu khảo sát các điều kiện lên men tối ưu (nhiệt độ, pH, thành phần môi trường rỉ mật, cao nấm men...) nhằm thu nhận sinh khối và nồng độ tinh thể độc tố cao nhất của chủng BT1.
• Tiến hành thử nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu xanh bướm trắng của chủng BT1 trên quy mô đồng ruộng thực tế.
• Khảo sát sự hiện diện của các gen mã hóa độc tố chuyên biệt (họ gen cry) ở chủng BT1 bằng kỹ thuật PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu.
• Nghiên cứu công nghệ tạo dạng chế phẩm vi sinh (dạng bột thấm nước WP hoặc dạng nhũ dầu) có chất phụ gia bảo vệ bào tử trước bức xạ tử ngoại để kéo dài thời gian bảo quản và hiệu lực ngoài trời.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận chỉ ra một số giới hạn xuất phát từ phạm vi nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm:

• Quy mô thử nghiệm: Thử nghiệm hoạt tính sinh học mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro) trong điều kiện nhiệt độ ($25^\circ\text{C}$) và ẩm độ kiểm soát, chưa phản ánh đầy đủ tác động của các yếu tố ngoại cảnh thực tế như nhiệt độ biến động, ánh sáng mặt trời (tia UV làm bất hoạt bào tử và độc tố) và lượng mưa rửa trôi trên đồng ruộng.
• Đặc điểm di truyền độc tố: Nghiên cứu mới dừng lại ở bước định danh loài qua chỉ thị 16S rRNA và kiểm tra tính chất sinh hóa, chưa tiến hành khuếch đại và phân tích các gen độc tố chuyên biệt nhóm cry1, cry2 hay ngoại độc tố $\beta$-exotoxin của chủng BT1.
• Công nghệ sản xuất: Chưa tối ưu hóa môi trường lên men giá rẻ quy mô pilot và chưa tạo dạng chế phẩm thương mại hoàn chỉnh.

Các hướng nghiên cứu tiếp nối được vạch ra tập trung vào: xác định hệ gen độc tố tinh thể, tối ưu hóa quy trình nuôi cấy bán công nghiệp và thử nghiệm đồng ruộng theo quy chuẩn kiểm nghiệm thuốc bảo vệ thực vật sinh học.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn phục vụ cho các nhóm đối tượng:

• Sinh viên và học viên ngành Công nghệ Sinh học, Bảo vệ Thực vật, Nông học, Khoa học Môi trường: Tham khảo quy trình phân lập, bảo quản, hoạt hóa và đánh giá hoạt tính sinh học của vi khuẩn đối kháng dịch hại cây trồng.
• Nhóm nghiên cứu vi sinh ứng dụng: Cung cấp chi tiết quy trình thực nghiệm đồng bộ gồm: phương pháp chuẩn độ mật độ bào tử qua xử lý nhiệt, phương pháp thử nghiệm sinh học lá nhúng (leaf-dip bioassay), hệ thống 27 phép thử sinh hóa chuẩn theo khóa Cowan & Steel và quy trình xử lý dữ liệu giải trình tự 16S rRNA trên MEGA 6.
• Cán bộ nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm so sánh hoạt lực giữa các chủng Bacillus bản địa với chủng chuẩn quốc tế VTCC 10525, làm tiền đề dữ liệu cho các dự án phát triển thuốc trừ sâu sinh học thế hệ mới.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Hiệu lực tiêu diệt sâu xanh bướm trắng của chủng vi khuẩn BT1 đạt mức cao nhất là bao nhiêu và ở điều kiện nào?
Chủng BT1 đạt hiệu lực tiêu diệt sâu cao nhất là $90,51 \pm 16,40%$ sau 72 giờ thử nghiệm ở nồng độ dịch nguyên ($10^9\text{ CFU/mL}$), sử dụng ấu trùng tuổi 2–3 trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm $25^\circ\text{C}$.

2. Mẫu sâu hại thí nghiệm được thu thập từ địa phương nào và có tiêu chuẩn lựa chọn ra sao?
Ấu trùng sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) gây hại trên bắp cải và súp lơ được thu nhận trực tiếp từ các vườn rau tại huyện Krông Năng, tỉnh Đắk Lắk. Tiêu chuẩn chọn lọc sâu thí nghiệm là các cá thể sâu non khỏe mạnh, đồng đều về kích thước ở giai đoạn tuổi 2 và tuổi 3.

3. Chủng vi khuẩn BT1 có những đặc điểm hình thái đại thể và vi thể nào sau khi hoạt hóa?
Trên môi trường thạch NA ở 37°C, khuẩn lạc BT1 có dạng bờ răng cưa, tâm nhô, màu trắng ngà, bề mặt khô và nhô. Quan sát vi thể sau nhuộm Gram và nhuộm bào tử ghi nhận trực khuẩn ngắn, bắt màu tím Gram dương, có hình thành nội bào tử và tế bào sắp xếp thành dạng chuỗi.

4. Kết quả định danh sinh hóa và sinh học phân tử xác nhận chủng BT1 là loài vi khuẩn nào?

• Về sinh hóa: Chủng BT1 cho kết quả phù hợp với loài Bacillus thuringiensis với độ tương đồng 88,88% (24/27 thử nghiệm sinh hóa theo khóa Cowan và Steel).
• Về sinh học phân tử: Trình tự vùng gen 16S rRNA của BT1 khi so đối chiếu BLAST trên GenBank (NCBI) có độ tương đồng 99% (độ bao phủ 99,39%, E-value = 0.0) với loài Bacillus thuringiensis (mã số truy cập Accession: NR_112780.1).

5. Thí nghiệm kiểm tra hoạt tính diệt sâu sử dụng công thức nào để tính toán hiệu lực và xử lý thống kê ra sao?
Hiệu lực diệt sâu được tính theo công thức Abbott (1925): $A = \frac{C - T}{C} \times 100$ (với $C$ là số sâu sống ở mẫu đối chứng không xử lý dịch khuẩn, $T$ là số sâu sống ở mẫu thí nghiệm). Dữ liệu được phân tích phương sai ANOVA và đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức $p < 0,05$ qua phép thử Duncan.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Lan Phương đã tuyển chọn thành công chủng vi khuẩn Bacillus sp. BT1 có hoạt tính sinh học cao đối với sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.), đạt hiệu lực tiêu diệt $90,51%$ sau 72 giờ ở mật độ $10^9\text{ CFU/mL}$. Bằng sự kết hợp giữa 27 chỉ tiêu sinh hóa theo khóa Cowan & Steel và giải trình tự gen 16S rRNA, nghiên cứu đã định danh chính xác chủng BT1 là Bacillus thuringiensis. Đây là công trình thực nghiệm hoàn chỉnh, cung cấp cơ sở khoa học và nguồn giống vi sinh vật tiềm năng phục vụ việc sản xuất các chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học thay thế hóa chất độc hại trong canh tác rau an toàn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm không khí cao là điều kiện thuận lợi cho các loài sâu hại cây nông - lâm nghiệp phát triển. Côn trùng bộ cánh vảy là bộ lớn trong lớp côn trùng gồm bướm và bướm đêm, trên 180.000 loài đã được mô tả và có mặt ở khắp nơi trên thế giới, chúng gây thiệt hại nghiêm trọng trong nền kinh tế nông nghiệp của nước nhà (Nguyễn Thị Hiền, 2012). Để phòng trừ, kiếm soát sâu bệnh hại, các nhóm thuốc organophosphate, carbamate và nhiều nhóm hóa chất khác thường được sử dụng nhiều (Whalon, 2013). Tuy nhiên, tác hại của việc lạm dụng thuốc trừ sâu hóa học quá mức và rộng rãi đã tác động to lớn.

Thuốc trừ sâu là nhóm lớn nhất của các hóa chất nguy hiểm có tác động trực tiếp vào môi trường. Các dư lượng tồn tại trong đất và có thể gây ô nhiễm nước ngầm và được tích lũy trong thực vật, trái cây và rau quả ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người (Ghribi, 2007). Theo số liệu của cục BVTV, kết quả kiểm tra năm 2000 - 2002 cho thấy ở vùng Hà Nội số mẫu có dư lượng quá mức cho phép khá cao, trên rau, nho, chè từ 10% - 26%, ở TP. Hồ Chí Minh từ 10 - 30%.

Đặc biệt ở các vùng rau, quả, chè, … Kết quả điều tra năm 2010, ở vùng rau đồng bằng sông Hồng cho thấy số lần phun thuốc bảo vệ thực vật từ 26 - 32 lần (11,1 - 25,6 kg ai/ha) trong 1 năm. Còn 5,19% số hộ dùng thuốc cấm, ngoài danh mục, 10,22% không đúng thời gian cách ly, 51% không thực hiện theo khuyến cáo của nhãn. Thuốc BVTV làm tăng tính kháng thuốc của sâu bệnh, tiêu diệt ký sinh thiên địch, có thể gây bộc phát các dịch hại cây trồng (Cục BVTV, 2000, 2010). Sâu xanh bướm trắng hại cải thuộc họ Bướm phấn (Pieridae), Bộ cánh vảy phân bố ở nhiều nước trên thế giới và gây hại rau nghiêm trọng.

Ở Việt Nam sâu xanh bướm trắng xuất hiện và gây hại đã lâu và nổi lên như một đối tượng dịch hại nghiêm trọng (Bộ môn côn trùng, 2004). Các biện pháp sinh học đang rất được chú trọng ở các nước trên thế giới cũng như ở nước ta sẽ khắc phục các nhược điểm của thuốc hóa học do nó có ưu điểm: SVTH: NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH không làm nhiễm bẩn môi trường, không gây độc hại cho người và gia súc, không làm mất đi hệ sinh vật có ích trong tự nhiên mà có tính chọn lọc cao. Sử dụng con đường đấu tranh sinh học để tạo ra những hệ thống tổng hợp bảo vệ cây trồng và bảo vệ môi trường đã thấy hết được ý nghĩa to lớn của chúng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật (Trần Văn Mão, 2002).

(2003) cho thấy thành công lớn nhất trong phòng trừ sâu hại rau họ Hoa thập tự là việc nghiên cứu, sản xuất quy mô công nghiệp và sử dụng rộng rãi các chế phẩm sinh học như NPV, GV đặc biệt là chế phẩm Bt. Nhiều nghiên cứu về Bacillus tổng hợp độc tố diệt côn trùng mang lại hiệu quả phòng trừ, tiêu diệt tốt các loại côn trùng khác nhau. Từ bộ sưu tập chủng Bacillus tiềm năng được phân lập ở phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh và Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – Đại học Quốc Gia Hà Nội. Với những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với nội dung: “ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TIÊU DIỆT SÂU XANH BƯỚM TRẮNG (Pieris rapae L.) CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus spp.

Nhằm chọn ra chủng Bacillus spp. có hoạt lực mạnh trong tiêu diệt sâu hại cây trồng làm cơ sở khoa học trong việc tạo chế phẩm. Mục tiêu nghiên cứu: Tuyển chọn thành công chủng Bacillus spp. có hoạt lực mạnh trong diệt sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) hại cây trồng.

Mục tiêu cụ thể: - Hoạt hóa chủng vi khuẩn Bacillus spp. - Khảo sát hoạt tính diệt sâu xanh bướm trắng của chủng vi khuẩn Bacillus spp. - Định danh Bacillus spp. bằng phương pháp sinh hóa và sinh học phân tử.

SVTH: NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. TỔNG QUAN VỀ SÂU XANH BƯỚM TRẮNG (Pieris rapae L. Vị trí phân loại Dựa vào khóa phân loại của Linnaeus (1758), phân loại khoa học của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) như sau: Giới (Kinhdom): Animalia Ngành (Phylum): Arthopoda Lớp (Class): Insecta Bộ (Order): Lepidoptera Họ (family): Pieridae Chi (Genus): Pieris Hình 1.1 Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.

Đặc điểm sinh vật học của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) Theo Hồ Khắc Tín (1999), trưởng thành của sâu xanh bướm trắng có thân màu đen, hai cánh trắng, đỉnh cánh có vết đen hình tam giác. Trứng màu hơi vàng, sâu non màu xanh lục, trên lưng có những điểm đen nhỏ. Sâu non có 5 tuổi, khi đẫy sức dài khoảng 28-35 mm. Nhộng màu xanh, khi gần vũ hóa chuyển màu xanh hơi vàng.

Bướm hoạt động ban ngày. Sau vũ hóa 3 - 4 ngày thì đẻ trứng, trứng đẻ từng quả, rải rác mặt sau của lá rau. Một bướm có thể đẻ từ 50 - 200 trứng. Bướm sâu xanh sống khá lâu từ 2 - 5 tuần lễ.

SVTH: NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH Sâu non mới nở gặm chất xanh của lá rau, từ tuổi hai trở lên gặm thủng lá rau và ăn kiệt chỉ còn gân lá. Vì vậy nếu để mật độ cao thì ruộng rau sẽ bị trơ trụi, xơ xác. Vòng đời của sâu xanh bướm trắng từ 26 - 30 ngày.

Trong đó giai đoạn trứng từ 6 - 8 ngày, sâu non 10 - 14 ngày, nhộng 7 - 8 ngày. Bướm vũ hóa sau 3 - 4 ngày thì đẻ trứng. Sâu phát sinh và gây hại nặng từ tháng 10 năm trước đến tháng 5 năm sau, nhưng thường nặng nhất từ tháng 2 đến tháng 5 vì thời tiết lúc này phù hợp với sinh trưởng và phát triển của sâu. Sâu xanh thường tập trung và gây hại nặng ở những ruộng rau xanh tốt.

Vì vậy trong kỹ thuật thâm canh cần lưu ý bón phân hợp lý, cân đối và đúng thời kỳ sinh trưởng của cây. Sâu xanh bướm trắng hại chủ yếu trên lá rau, vì vậy khi phát hiện có thể dùng biện pháp thủ công (dùng tay) giết sâu non và nhộng. Trường hợp mật độ quá cao, phải dùng thuốc hóa học để phòng trừ kịp thời. Để việc phòng trừ đạt hiệu quả cao, cần phải theo dõi phát hiện thời kỳ bướm nở rộ và đẻ trứng để phun thuốc kịp thời khi sâu non vừa nở.

Theo Nguyễn Văn Đĩnh (2004), Sâu xanh bướm trắng có mật độ khác nhau giữa các tháng trong năm thể hiện qua bảng sau: Bảng 1.1: Mật độ sâu xanh bướm trắng qua các tháng khác nhau Tên Việt Nam Tên khoa học Mức độ phổ biến qua các tháng 1 2 3 4 5 6 Sâu xanh bướm Pieris rapae ++ +++ +++ ++ 0 0 trắng (Linnaeus) Ghi chú +: Ít gặp (số lần bắt gặp 5-20%) ++: Trung bình (số lần bắt gặp 21-50%); +++: Nhiều (số lần bắt gặp >50%) SVTH: NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH A B C D E F G H Hình 1.2: Các pha phát dục của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) (Nguồn: Nguyễn Mạnh Phương, 2011) (A): Pha trứng, (B): Sâu non tuổi 1, (C): Sâu non tuổi 2, (D): Sâu non các tuổi 2, 3, 4, 5, (E): Sâu non tuổi 5, (F): Pha nhộng, (G): Trưởng thành cái, (H): Trưởng thành đực. SVTH: NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Tác hại của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.

Capinera (2000), ấu trùng của Pieris rapae L. thường ăn lá cây kí chủ, nếu không tiêu diệt chúng thì sẽ ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây. Thậm chí sâu non còn chui vào bắp của cải hoa, cải bắp để gây hại. Đặc biệt là chất thải của chúng rất lớn ảnh hưởng sự sinh trưởng của cây rau.

thường gây hại trên diện rộng, tạo những lỗ thủng rải rác trên lá. Sâu non thường nằm trên lá, chúng có thể ăn thủng lá hoặc gặm ngoài cạnh lá sâu vào trong. Sâu non khi còn nhỏ thường ăn vòng ngoài lá, khi lớn hơn chúng có thể ăn các phần lá già hơn. Khi bị Pieris rapae L.

phá hại sẽ gây ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây, ở mật độ cao chúng làm cho các ruộng rau trở nên xơ xác, mất năng suất.3: Sâu xanh bướm trắng hại bắp cải 1. Biện pháp phòng trừ sinh học sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.Mau (2007), sau khi thu hoạch, các tàn dư cây trồng được tiêu hủy và tiến hành cày lật đất. Các loại cây hoang dại có chứa tinh dầu mù tạt cần SVTH: NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH được chặt bỏ trong những khu vực quanh ruộng để ngăn sâu non của Pieris rapae L.

phát sinh vào vụ sau. Capinera (2000), một số loại vi khuẩn đã được nghiên cứu để diệt trừ Pieris rapae L.và có tiềm năng phát triển mạnh mẽ tiến tới hình thành thuốc trừ sâu vi khuẩn. Pieris rapae Granulosis vius (Pieris rapae L. GV) có tác dụng tiêu diệt Pieris rapae L.

trong cả phòng thí nghiệm lẫn trên đồng ruộng, nhưng phải mất 4-10 ngày sau phun thuốc mới phát huy tác dụng và hiệu quả không cao bằng sử dụng Bacillus thuringiensis để phòng trừ. Vào năm 1934, ở Hawaii, Fullaway và cs. (1945) cho thấy: sử dụng Apanteles glomeraus được nhập vào từ Nhật Bản có tác dụng kí sinh và khống chế Pieris rapae L. một cách có hiệu quả.

Tác nhân gây bệnh, Nosema mesilini là một dạng kí sinh nội bào trong cơ thể trong thời gian lâu dài, dẫn tới Pieris rapae L. cái trưởng thành giảm khả năng sinh sản. Tác nhân gây bệnh này có tác dụng cao nhất đối với sâu non và trung bình đối với sâu trưởng thành. Ngoài ra còn có các loại vi khuẩn gây bệnh như Chalcis obscurata cũng có tác dụng đối với Pieris rapae L., có thể ứng dụng vào thực tế.

GIỚI THIỆU VỀ Bacillus 2. Đặc điểm phân loại Theo khóa phân loại của Holt và cs. năm 1990, Bacillus được phân loại như sau: Giới (Kinhdom): Bacteria Ngành (Phylum): Firmicutes Lớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Bacillales Họ (family): Bacillaceae Chi (Genus): Bacillus Chi Bacillus là một chi lớn (51 loài đã được xác định chính xác và nhiều loài khác chưa được phân loại rõ ràng) và đa dạng, thuộc họ Bacillaceae. Họ này chia làm 5 chi gồm: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, SVTH: NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG 8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.

NGUYỄN VĂN MINH Desulfotomaculum.