Effects of cell free filtrate of bacillus subtilis h14 strain on sclerotium rolfsii causing white mold root rot disease in the peanut khóa luận tốt nghiệp

Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu Effects of cell free filtrate of bacillus subtilis h14 strain on sclerotium rolfsii causing white, điều tra thực trạng, phân tích số liệu, đề xuất

• Tác giả: Nguyen Thi Khanh Linh
• Người hướng dẫn: Dr. Ngo Thu Huong
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Microbial Technology
• Đề tài: Effects of Cell-Free Filtrate of Bacillus subtilis H14 Strain on Sclerotium rolfsii Causing White Mold Root Rot Disease in the Peanut
• Loại tài liệu: Graduation thesis
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• COMMITMENT
• ACKNOWLEDGEMENT
• 1. CONTENTS
• 1.1. LIST OF TABLES
• 1.2. LIST OF FIGURES
• 1.3. LIST OF ABBREVIATIONS
• 2. OVERVIEW OF PEANUTS
• 2.1. The history of peanuts
• 2.2. The situation of peanut production in the world and Vietnam
• 2.2.1. The situation of peanut production in the world
• 2.2.2. The situation of peanut production in Vietnam
• 2.3. The role of peanuts
• 2.3.1. The role of peanuts in the economy
• 2.3.2. The role of peanuts in agriculture
• 2.3.3. The role of peanuts in human life
• 3. WHITE MOLD ROOT ROT DISEASE ON THE PEANUTS BY SCLEROTIUM ROLFSII
• 3.1. Overview of Sclerotium rolfsii
• 3.2. Overview of bacteria
• 3.2.1. Overview of Bacillus subtilis
• 3.2.2. Overview of Bacillus subtilis H14
• 3.3. The research situation in the world and Vietnam
• 3.3.1. The research situation in the world
• 3.3.2. The research situation in Vietnam
• 4. MATERIALS AND METHODS
• 4.1. Research location and time
• 4.2. The dual culture method for testing antagonistic activity
• 4.3. Methods for testing the effects of cell-free filtrate from B. subtilis H14 strain on the mycelial growth and sclerotial germination of Sclerotium rolfsii
• 4.3.1. Method of filtration through sterile filter paper
• 4.3.2. Method of filtration through sterile Cellulose filter membrane with pore size 0
• 4.3.3. Method of filtration through sterile Syringe filter membrane with pore size 0
• 4.4. Mycelial growth inhibition test
• 4.5. Hyphal morphology inhibition test
• 4.6. Sclerotial formation inhibition test
• 4.7. Sclerotial germination inhibition test
• 4.8. Sclerotial morphology inhibition test
• 4.9. rolfsii on peanuts in vivo condition
• 5. RESULTS AND DISCUSSION
• 5.1. Antagonistic activity of B. subtilis H14 strain on S.
• 5.2. Antifungal ability of cell-free filtrate from B. subtilis H14 strain on the mycelial growth and sclerotial germination of Sclerotium rolfsii
• 5.2.1. Antifungal ability of cell-free filtrate by using sterile filter paper
• 5.2.2. Antifungal ability of cell-free filtrate by using sterile Cellulose filter membrane with pore size 0
• 5.2.3. Antifungal ability of cell-free filtrate by using sterile Syringe filter membrane with pore size 0
• 5.3. Inhibitory ability of cell-free filtrate on mycelial growth
• 5.4. Inhibitory ability of cell-free filtrate on hyphal morphology
• 5.5. Inhibitory ability of cell-free filtrate on sclerotial formation
• 5.6. Inhibitory ability of cell-free filtrate on sclerotial germination
• 5.7. Inhibitory ability of cell-free filtrate on sclerotial morphology
• 5.8. Biocontrol ability of cell-free filtrate on S. rolfsii on peanuts in vivo condition
• 6. CONCLUSIONS AND PROPOSAL

Tóm tắt

I. Giới thiệu về dịch lọc không tế bào và Bacillus subtilis H14

Dịch lọc không tế bào là một phương pháp sinh học hiện đại, được sử dụng để tách các hợp chất có hoạt tính sinh học từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn mà không cần sử dụng tế bào sống. Bacillus subtilis H14 là một chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm gây bệnh thực vật, đặc biệt là Sclerotium rolfsii. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá tác dụng của dịch lọc không tế bào từ chủng H14 trong việc kiểm soát bệnh thối trắng rễ đậu phộng.

1.1. Bacillus subtilis H14 và vai trò trong kiểm soát bệnh thực vật

Bacillus subtilis H14 là một chủng vi khuẩn có lợi, được biết đến với khả năng tiết ra các hợp chất kháng nấm mạnh. Nghiên cứu trước đây của Nguyễn Khánh Ly (2022) đã chứng minh rằng chủng H14 có khả năng ức chế sự phát triển của Sclerotium rolfsii, nguyên nhân chính gây bệnh thối trắng rễ đậu phộng. Việc sử dụng dịch lọc không tế bào từ chủng này mang lại tiềm năng lớn trong việc phát triển các chế phẩm sinh học thân thiện với môi trường.

1.2. Dịch lọc không tế bào và cơ chế hoạt động

Dịch lọc không tế bào được tạo ra bằng cách lọc môi trường nuôi cấy của Bacillus subtilis H14 qua các màng lọc vô trùng. Các hợp chất kháng nấm trong dịch lọc có khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm và sự nảy mầm của sclerotia, cấu trúc sinh sản của Sclerotium rolfsii. Phương pháp này không chỉ hiệu quả mà còn an toàn, không gây ảnh hưởng đến hệ sinh thái.

II. Bệnh thối trắng rễ đậu phộng và tác động đến nông nghiệp bền vững

Bệnh thối trắng rễ đậu phộng do Sclerotium rolfsii gây ra là một trong những bệnh hại nghiêm trọng, ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng cây trồng. Bệnh này gây thiệt hại kinh tế đáng kể, đặc biệt là ở các vùng trồng đậu phộng tại Việt Nam. Việc tìm kiếm các giải pháp sinh học để kiểm soát bệnh này là cần thiết nhằm hướng tới một nền nông nghiệp bền vững.

2.1. Sclerotium rolfsii và chu kỳ gây bệnh

Sclerotium rolfsii là một loại nấm đất, có khả năng tồn tại trong đất dưới dạng sclerotia trong nhiều năm. Khi điều kiện môi trường thuận lợi, sclerotia nảy mầm và tạo ra sợi nấm xâm nhập vào rễ cây, gây ra bệnh thối trắng rễ đậu phộng. Chu kỳ gây bệnh phức tạp của loại nấm này khiến việc kiểm soát trở nên khó khăn.

2.2. Tác động của bệnh đến cây trồng và nông nghiệp

Bệnh thối trắng rễ đậu phộng không chỉ làm giảm năng suất mà còn ảnh hưởng đến chất lượng hạt đậu phộng. Theo thống kê, tỷ lệ thiệt hại do bệnh này có thể lên đến 80% trong một số vùng trồng. Việc sử dụng các biện pháp hóa học để kiểm soát bệnh đã dẫn đến nhiều vấn đề về ô nhiễm môi trường và kháng thuốc. Do đó, việc phát triển các giải pháp sinh học như sử dụng dịch lọc không tế bào từ Bacillus subtilis H14 là hướng đi đầy tiềm năng.

III. Phương pháp nghiên cứu và kết quả thực nghiệm

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp thí nghiệm in vitro và in vivo để đánh giá hiệu quả của dịch lọc không tế bào từ Bacillus subtilis H14 trong việc ức chế sự phát triển của Sclerotium rolfsii. Các kết quả thu được cho thấy tiềm năng lớn của phương pháp này trong việc phòng trừ bệnh hại và bảo vệ thực vật.

3.1. Phương pháp lọc và thử nghiệm kháng nấm

Ba phương pháp lọc khác nhau đã được sử dụng để tạo ra dịch lọc không tế bào: lọc qua giấy lọc vô trùng, màng lọc Cellulose và màng lọc Syringe. Kết quả cho thấy dịch lọc từ phương pháp lọc qua màng Cellulose có hiệu quả kháng nấm cao nhất, với tỷ lệ ức chế sợi nấm đạt 49.56% và ức chế sự nảy mầm của sclerotia đạt 82.17%.

3.2. Thử nghiệm in vivo trên cây đậu phộng

Khi áp dụng dịch lọc không tế bào trên cây đậu phộng bị nhiễm Sclerotium rolfsii, kết quả cho thấy cây được xử lý không có dấu hiệu bị hư hại, trong khi cây đối chứng bị héo và chết. Điều này chứng minh hiệu quả thực tế của phương pháp này trong việc kiểm soát bệnh thực vật và bảo vệ cây trồng.

IV. Kết luận và đề xuất

Nghiên cứu này đã chứng minh rằng dịch lọc không tế bào từ Bacillus subtilis H14 có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát bệnh thối trắng rễ đậu phộng do Sclerotium rolfsii gây ra. Việc phát triển các chế phẩm sinh học từ dịch lọc này không chỉ giúp phòng trừ bệnh hại mà còn góp phần vào sự phát triển của nông nghiệp bền vững.

4.1. Giá trị thực tiễn của nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu này có thể được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là trong việc phát triển các chế phẩm sinh học thân thiện với môi trường. Việc sử dụng dịch lọc không tế bào từ Bacillus subtilis H14 không chỉ giúp tăng năng suất cây trồng mà còn đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ môi trường.

4.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất dịch lọc không tế bào và đánh giá hiệu quả của phương pháp này trên các loại cây trồng khác. Đồng thời, việc phát triển các sản phẩm thương mại từ dịch lọc này cũng là một hướng đi đầy tiềm năng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là một trong những cây thực phẩm và cây lấy dầu quan trọng trên thế giới, đóng vai trò chủ lực trong chiến lược sinh kế nông nghiệp, an ninh lương thực và thu nhập của nhiều quốc gia. Theo số liệu của FAOSTAT (2022), cây lạc được canh tác tại hơn 110 quốc gia với diện tích thu hoạch toàn cầu đạt 31,6 triệu ha và sản lượng khoảng 53,6 triệu tấn. Tại Việt Nam, cây lạc được trồng rộng rãi tại 53 tỉnh thành trải dài từ Bắc vào Nam, tập trung ở 6 vùng sinh thái chính gồm Đồng bằng sông Hồng, Đông Bắc, Bắc Trung Bộ, Duyên hải Nam Trung Bộ, Tây Nguyên và Đông Nam Bộ; trong đó diện tích canh tác lớn nhất tập trung tại các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh và Thanh Hóa.

Mặc dù năng suất lạc bình quân tại Việt Nam có xu hướng cải thiện (tăng từ 2,10 tấn/ha năm 2010 lên 2,50 tấn/ha năm 2020), song tiềm năng năng suất vẫn bị suy giảm nghiêm trọng bởi các loại dịch hại trong đất. Trong đó, bệnh thối gốc mốc trắng do nấm Sclerotium rolfsii Sacc. (giai đoạn sinh sản hữu tính là Athelia rolfsii) gây ra là một trong những nguyên nhân hàng đầu làm suy giảm năng suất từ 10% đến 25%, thậm chí lên đến 80% tại các vùng bị nhiễm bệnh nặng. Nấm Sclerotium rolfsii có khả năng hình thành cấu trúc hạch nấm (sclerotia) vỏ cứng chứa melanin, tồn tại bền bỉ trong đất nhiều năm và tái nảy mầm lây lan sang thân, rễ, gốc sát mặt đất của cây trồng.

Để hạn chế bệnh hại, các biện pháp sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đã được áp dụng phổ biến nhưng để lại nhiều hệ lụy về ô nhiễm môi trường, phá vỡ hệ sinh thái đất và nguy cơ kháng thuốc. Do đó, việc ứng dụng các chủng vi sinh vật đối kháng tự nhiên an toàn sinh học như Bacillus subtilis đang là hướng tiếp cận ưu tiên. Kế thừa nghiên cứu của Nguyễn Khánh Ly (2022) về chủng vi khuẩn Bacillus subtilis H14 có hoạt tính đối kháng mạnh, khóa luận này tập trung nghiên cứu sâu hơn về tác dụng của các hợp chất chuyển hóa ngoại bào chứa trong dịch lọc không tế bào (cell-free filtrate) nhằm tạo tiền đề cho sản phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài gồm:

1. Tuyển chọn phương pháp tối ưu nhất để thu nhận dịch lọc không tế bào từ môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus subtilis H14.
2. Đánh giá hoạt tính ức chế của dịch lọc không tế bào H14 ở các nồng độ pha loãng khác nhau đối với sự sinh trưởng sợi nấm, sự biến đổi hình thái sợi nấm, sự hình thành hạch nấm và tỷ lệ nảy mầm của hạch nấm Sclerotium rolfsii in vitro.
3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sinh học của dịch lọc không tế bào chủng H14 khi tái lây nhiễm nhân tạo nấm Sclerotium rolfsii trên cây lạc trong điều kiện in vivo.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis H14 (phân lập từ đất trồng lạc tại Hưng Hà - Thái Bình và Ý Yên - Nam Định) và chủng nấm gây bệnh Sclerotium rolfsii.
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Thực hiện từ tháng 08/2022 đến tháng 12/2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên cơ sở lý thuyết về sinh học cây lạc, đặc tính gây bệnh của nấm đất Sclerotium rolfsii, và khả năng sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn Bacillus subtilis. Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, tạo nội bào tử, được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận thuộc nhóm vi sinh vật an toàn (GRAS). Khả năng đối kháng nấm của B. subtilis bắt nguồn từ việc tiết ra các lipopeptide ngoại bào (surfactin, iturin, fengycin, bacitracin), các enzyme thủy phân vách tế bào nấm (chitinase, protease, cellulase, amylase) và các hợp chất phenolic.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai theo các quy trình chuẩn hóa:

• Phương pháp nuôi cấy đối kháng kép (Dual culture assay): Thực hiện trên đĩa thạch PDA (Potato Dextrose Agar) theo phương pháp của Fokkema (1978). Cấy ria đường vi khuẩn H14 dài 4,5 cm cách miếng thạch nấm bệnh (đường kính 7 mm) khoảng cách 3 cm, ủ ở 30°C trong 72–96 giờ.
• Phương pháp thu nhận dịch lọc không tế bào: Nuôi cấy chủng H14 trong môi trường dịch thể Luria-Bertani (LB, pH 6,5) ở 30°C, lắc 200 vòng/phút trong 48 giờ; ly tâm dịch nuôi cấy ở tốc độ 5.500 vòng/phút trong 25 phút để thu dịch nổi. Sau đó tiến hành thử nghiệm so sánh 3 kỹ thuật tách lọc:
  1. Lọc qua giấy lọc vi sinh vô trùng.
  2. Lọc qua màng lọc Cellulose vô trùng kích thước lỗ 0,45 µm đặt trên mặt thạch PDA.
  3. Lọc qua màng lọc Syringe vô trùng kích thước lỗ 0,22 µm.
• Phương pháp kiểm tra hoạt tính ức chế sợi nấm và hình thái sợi nấm in vitro: Phối trộn dịch lọc không tế bào vào môi trường PDA ở các nồng độ pha loãng 1:0, 1:4 và 1:9 (thể tích dịch lọc/nước cất vô trùng), đo đường kính tản nấm tại các thời điểm 24h, 48h, 72h. Kiểm tra cấu trúc sợi nấm dưới kính hiển vi quang học vật kính 100X qua phương pháp chèn lam kính vô trùng.
• Phương pháp kiểm tra ức chế hình thành và nảy mầm hạch nấm: Đếm số lượng hạch nấm hình thành sau 20 ngày nuôi cấy; thử nghiệm nảy mầm hạch nấm trên đĩa thạch chứa dịch lọc; ngâm hạch nấm trực tiếp trong dịch lọc 24 giờ; và đánh giá khả năng nảy mầm của hạch nấm sau khi xử lý dịch lọc và chôn trong đất Tribat độ ẩm 80% trong 15 ngày.
• Phương pháp thử nghiệm in vivo trên cây lạc: Gieo hạt lạc đã khử trùng bề mặt (NaOCl 5% trong 1 phút) vào chậu đất vô trùng. Cây lạc 2 tuần tuổi được lây nhiễm hỗn dịch nấm S. rolfsii kết hợp xử lý dịch lọc H14 ở các tỷ lệ thể tích 1:1, 1:3 và 1:5, so sánh với các công thức đối chứng âm (nước cất, dịch lọc đơn lẻ) và đối chứng dương (chỉ lây nhiễm nấm bệnh). Đánh giá mức độ bệnh sau 7 ngày.

Nguồn dữ liệu của nghiên cứu bao gồm số liệu thực nghiệm đo đạc lặp lại 3 lần trong phòng thí nghiệm và các nguồn dữ liệu thống kê sản xuất nông nghiệp từ FAOSTAT và Tổng cục Thống kê giai đoạn 2010–2020.

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan tài liệu (Overview)

Chương tổng quan hệ thống hóa nguồn gốc, lịch sử phát triển, phân loại học và giá trị của cây lạc (Arachis hypogaea L.) trong kinh tế, nông nghiệp (cải tạo đất, cố định đạm qua vi khuẩn nốt sần, luân canh với lúa) và đời sống con người (sản xuất dầu ăn, bơ, bột dinh dưỡng). Tác giả phân tích tình hình sản xuất lạc toàn cầu và tại Việt Nam giai đoạn 2010–2020: diện tích trồng lạc tại Việt Nam giảm từ 213.400 ha (2010) xuống 169.595 ha (2020), song năng suất tăng từ 2,10 tấn/ha lên 2,50 tấn/ha.

Chương này cũng mô tả chi tiết tác nhân gây bệnh thối gốc mốc trắng Sclerotium rolfsii, đặc điểm hình thái sợi nấm màu trắng dạng bông, hạch nấm hình cầu màu nâu đậm, cơ chế tiết acid oxalic và enzyme phân giải mô thực vật, cùng điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho nấm phát triển (nhiệt độ 25–35°C, pH 3,0–7,0). Đồng thời, tác giả tổng hợp các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn Bacillus subtilis và chủng B. subtilis H14 có nguồn gốc bản địa tại Việt Nam.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (Materials and Methods)

Chương này cung cấp thông tin chi tiết về các chủng vi sinh vật, môi trường nuôi cấy (LB lỏng, PDA thạch), dụng cụ và thiết bị nghiên cứu. Trọng tâm của chương là thiết kế thực nghiệm chi tiết cho 3 phương pháp lọc dịch, quy trình thử nghiệm hoạt tính kháng nấm ở các nồng độ pha loãng (1:0, 1:2, 1:4, 1:9), công thức tính toán tỷ lệ ức chế sinh trưởng sợi nấm (IRMG), tỷ lệ ức chế hình thành hạch nấm (IRSF), tỷ lệ ức chế nảy mầm hạch nấm (IRSG), và bố trí thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo trên cây lạc in vivo.

Kết quả và thảo luận (Results and Discussion)

Chương kết quả và thảo luận trình bày các phát hiện thực nghiệm quan trọng:

• Hoạt tính đối kháng trực tiếp: Chủng B. subtilis H14 đối kháng mạnh với S. rolfsii trên đĩa thạch sau 96 giờ nuôi cấy, tái khẳng định hoạt tính ổn định của chủng giống sau thời gian bảo quản phòng thí nghiệm.
• Tuyển chọn phương pháp tách dịch lọc không tế bào:
  • Phương pháp giấy lọc vi sinh vô trùng: Sau 24 giờ nuôi cấy, bào tử vi khuẩn vẫn lọt qua giấy lọc và mọc thành khuẩn lạc trên bề mặt thạch PDA, làm sai lệch đánh giá tác dụng riêng biệt của hoạt chất ngoại bào.
  • Phương pháp màng Cellulose 0,45 µm: Tỷ lệ ức chế sinh trưởng sợi nấm chỉ đạt 31,78%, thời gian thẩm thấu kéo dài 48 giờ và vi khuẩn vẫn có khả năng xuyên màng.
  • Phương pháp màng Syringe 0,22 µm: Loại bỏ hoàn toàn tế bào vi khuẩn, cho hiệu quả ức chế sợi nấm đạt 43,34% sau 72 giờ ở thử nghiệm so sánh và đạt 49,88% ở nồng độ nguyên chất 1:0. Đây được xác định là phương pháp tối ưu nhất.
• Tác động lên sự sinh trưởng và hình thái sợi nấm: Ở nồng độ dịch lọc 1:0, tỷ lệ ức chế sợi nấm đạt 49,56% (sau 72h). Trên môi trường đối chứng, khuẩn ty nấm phát triển dày đặc phủ kín đĩa Petri (d > 90 mm); trong khi ở môi trường bổ sung dịch lọc H14, khuẩn ty phát triển thưa thớt, co cụm dạng hoa cúc, sợi nấm bị biến dạng rõ rệt khi quan sát dưới vật kính 100X.
• Tác động lên sự hình thành và nảy mầm của hạch nấm: Dịch lọc H14 làm giảm mạnh số lượng hạch nấm hình thành sau 20 ngày và ức chế nảy mầm của hạch nấm đạt 82,17% ở nồng độ 1:0. Khi chôn hạch nấm trong đất Tribat 15 ngày, dịch lọc duy trì hiệu lực làm giảm sức sống của hạch nấm rõ rệt.
• Hiệu lực bảo vệ cây lạc in vivo: Ở các nghiệm thức đối chứng dương (chỉ lây nhiễm S. rolfsii), cây lạc bị thối rễ, héo rũ và chết sau 7 ngày. Ngược lại, ở các nghiệm thức có xử lý dịch lọc H14 (tỷ lệ 1:1, 1:3, 1:5), cây lạc duy trì sinh trưởng bình thường, không biểu hiện triệu chứng thối gốc mốc trắng.

Kết luận và kiến nghị (Conclusions and Proposal)

Chương tổng kết xác nhận màng lọc Syringe 0,22 µm là giải pháp tối ưu để thu dịch lọc không tế bào từ chủng B. subtilis H14. Dịch lọc chứa các hợp chất ngoại bào có khả năng ức chế mạnh cả sợi nấm và hạch nấm S. rolfsii, đồng thời bảo vệ hiệu quả cây lạc khỏi sự xâm nhiễm của mầm bệnh trong điều kiện in vivo. Tác giả đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm chiết xuất, định danh hoạt chất và phát triển chế phẩm sinh học dạng bột hoặc dạng lỏng ứng dụng trong sản xuất thực tiễn.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã chứng minh hiệu lực kháng nấm của các hợp chất chuyển hóa ngoại bào tiết ra từ chủng Bacillus subtilis H14 đối với nấm Sclerotium rolfsii mà không cần sự hiện diện trực tiếp của tế bào vi khuẩn sống.

Bảng tổng hợp so sánh hiệu quả của 3 phương pháp thu dịch lọc không tế bào từ chủng B. subtilis H14:

Phương pháp tách lọc	Kích thước lỗ lọc / Đặc điểm	Khả năng loại bỏ tế bào vi sinh vật	Tỷ lệ ức chế sợi nấm sau 72h (%)	Đánh giá tính khả thi
Giấy lọc vi sinh vô trùng	Giấy lọc thông thường	Không triệt để (bào tử vi khuẩn mọc lại sau 24h)	Không xác định chính xác do lẫn khuẩn	Không phù hợp để nghiên cứu hoạt chất ngoại bào
Màng lọc Cellulose	0,45 µm	Thấp (vi khuẩn có thể xuyên màng sau 48h)	31,78%	Hiệu quả thấp, thao tác phức tạp
Màng lọc Syringe vô trùng	0,22 µm	Tuyệt đối (không còn tế bào/bào tử vi khuẩn)	43,34% – 49,88%	Tối ưu nhất, thao tác thuận tiện, kết quả ổn định

Bảng tổng hợp hiệu lực ức chế của dịch lọc H14 (phương pháp Syringe 0,22 µm) theo nồng độ:

Chỉ tiêu theo dõi	Nồng độ 1:0 (Nguyên chất)	Nồng độ 1:4	Nồng độ 1:9	Đối chứng (CT)
Tỷ lệ ức chế sinh trưởng sợi nấm sau 72h (%)	49,56% – 49,88%	Giảm dần theo độ pha loãng	Thấp nhất trong các nồng độ	0% (Nấm phủ kín đĩa d > 90 mm)
Tỷ lệ ức chế nảy mầm hạch nấm (%)	82,17%	Thấp hơn 1:0	Thấp nhất	0% (Hạch nảy mầm bình thường)
Hình thái sợi nấm (vật kính 100X)	Biến dạng, sợi mỏng, thưa, co cụm	Kém biến dạng hơn	Ít biến dạng	Sợi nấm thẳng, mịn, phát triển dày đặc
Tình trạng cây lạc in vivo sau 7 ngày	Cây khỏe mạnh, không triệu chứng thối gốc	Cây sinh trưởng ổn định	Cây sinh trưởng ổn định	Cây thối rễ, héo rũ và chết

Đóng góp mới của khóa luận:

• Chuẩn hóa được phương pháp thu hồi dịch lọc không tế bào của chủng B. subtilis H14 bằng màng lọc Syringe 0,22 µm, chứng minh hoạt tính kháng nấm không phụ thuộc vào cạnh tranh không gian sống hay dinh dưỡng của vi khuẩn sống.
• Cung cấp các dẫn liệu định lượng chi tiết về khả năng ức chế đồng thời cả thể sợi nấm và thể nghỉ (hạch nấm) của S. rolfsii, tạo cơ sở khoa học để phát triển các chế phẩm sinh học dạng dịch lọc hoặc chiết xuất hoạt chất phòng trừ bệnh thối gốc mốc trắng trên cây lạc.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Thử nghiệm in vivo mới chỉ dừng lại ở quy mô chậu vại trong điều kiện phòng thí nghiệm với thời gian theo dõi ngắn (7 ngày sau lây nhiễm), chưa đánh giá trên quy mô đồng ruộng với các điều kiện thời tiết, đất đai và hệ vi sinh vật tự nhiên phức tạp.
• Khóa luận chưa thực hiện phân tích thành phần hóa học, định tính và định lượng chi tiết các hợp chất lipopeptide hoặc enzyme cụ thể có trong dịch lọc.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất:

• Tách chiết, tinh sạch và định danh chính xác các hoạt chất kháng nấm trong dịch lọc không tế bào của chủng H14.
• Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học dạng bột và dạng lỏng từ dịch lọc H14, tiến hành khảo nghiệm diện rộng trên đồng ruộng trồng lạc để đánh giá hiệu quả kinh tế và độ ổn định thực tế.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Vi sinh, Bảo vệ Thực vật và Nông học.

Các nội dung có giá trị ứng dụng cao gồm:

• Quy trình thực nghiệm so sánh và chuẩn hóa phương pháp thu nhận dịch lọc không tế bào qua màng Syringe 0,22 µm.
• Hệ thống phương pháp luận đánh giá toàn diện hoạt tính kháng nấm: từ ức chế sinh trưởng sợi, giải phẫu hình thái sợi dưới kính hiển vi, ức chế hình thành và nảy mầm hạch nấm trong môi trường thạch cũng như trong môi trường đất, đến thử nghiệm in vivo trên cây trồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao phương pháp lọc qua giấy lọc vi sinh thông thường không đạt yêu cầu nghiên cứu dịch lọc của chủng H14?
Do kích thước lỗ lọc của giấy lọc vi sinh lớn hơn kích thước của bào tử và tế bào vi khuẩn B. subtilis, dẫn đến sau 24 giờ nuôi cấy trên đĩa thạch PDA, vi khuẩn vẫn mọc lại và hình thành khuẩn lạc. Điều này khiến hoạt tính ức chế nấm bị lẫn lộn giữa tác động của tế bào vi khuẩn sống và tác dụng của dịch tiết ngoại bào.

2. Hiệu lực ức chế sợi nấm và nảy mầm hạch nấm của dịch lọc H14 ở nồng độ nguyên chất (1:0) đạt bao nhiêu?
Ở tỷ lệ pha loãng 1:0 (nguyên chất), dịch lọc không tế bào H14 đạt tỷ lệ ức chế sinh trưởng sợi nấm S. rolfsii là 49,56% (sau 72 giờ) và tỷ lệ ức chế nảy mầm hạch nấm lên đến 82,17%.

3. Phương pháp nào được kết luận là tối ưu nhất để thu nhận dịch lọc không tế bào B. subtilis H14?
Phương pháp lọc dịch ly tâm qua màng lọc Syringe vô trùng có kích thước lỗ 0,22 µm là tối ưu nhất, giúp loại bỏ hoàn toàn tế bào vi khuẩn, quy trình thực hiện thuận tiện và cho hiệu lực ức chế nấm bệnh cao nhất (43,34% – 49,88%).

4. Dưới kính hiển vi vật kính 100X, hình thái sợi nấm Sclerotium rolfsii bị biến đổi như thế nào khi xử lý bằng dịch lọc H14?
Sợi nấm ở nghiệm thức xử lý dịch lọc H14 bị biến dạng cấu trúc, phát triển thưa thớt, co cụm dạng hoa cúc, sợi mỏng và không kéo dài thẳng hay đan kết dày đặc như ở nghiệm thức đối chứng không xử lý.

5. Kết quả thử nghiệm in vivo trên cây lạc 2 tuần tuổi cho thấy điều gì sau 7 ngày lây nhiễm?
Cây lạc ở nghiệm thức đối chứng dương (chỉ nhiễm nấm S. rolfsii) bị thối rễ, héo úa và chết hoàn toàn. Trong khi đó, các cây lạc được xử lý phối hợp với dịch lọc không tế bào H14 ở các tỷ lệ 1:1, 1:3 và 1:5 đều sinh trưởng bình thường, bộ rễ khỏe mạnh và không xuất hiện triệu chứng bệnh.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Khánh Linh đã hoàn thành việc đánh giá tác dụng kháng nấm Sclerotium rolfsii của dịch lọc không tế bào từ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis H14. Nghiên cứu đã xác định màng lọc Syringe 0,22 µm là phương pháp tối ưu để thu nhận dịch lọc, đồng thời chứng minh các hợp chất chuyển hóa ngoại bào của chủng H14 có khả năng ức chế 49,56% sự phát triển sợi nấm và 82,17% sự nảy mầm của hạch nấm in vitro. Kết quả thử nghiệm in vivo khẳng định tiềm năng ứng dụng của dịch lọc chủng H14 trong việc bảo vệ cây lạc khỏi bệnh thối gốc mốc trắng, đặt nền tảng cho việc phát triển các chế phẩm sinh học an toàn thay thế hóa chất bảo vệ thực vật.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY -------------***-------------- GRADUATION THESIS TITLE: “EFFECTS OF CELL-FREE FILTRATE OF BACILLUS SUBTILIS H14 STRAIN ON SCLEROTIUM ROLFSII CAUSING WHITE MOLD ROOT ROT DISEASE IN THE PEANUT” Hanoi-2022 VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY --------------***-------------- GRADUATION THESIS TITLE: “EFFECTS OF CELL-FREE FILTRATE OF BACILLUS SUBTILIS H14 STRAIN ON SCLEROTIUM ROLFSII CAUSING WHITE MOLD ROOT ROT DISEASE IN THE PEANUT” Student’s name : NGUYEN THI KHANH LINH Class : K63CNSHE Student’s code : 637332 Supervisor : Dr. NGO THU HUONG MSc. TRAN THI HONG HANH Major : MICROBIAL TECHNOLOGY Hanoi-2022 COMMITMENT I hereby declare that this is a scientific research work carried out by me during the period from August 2022 to December 2022 under the guidance of Dr. Ngo Thu Huong and MSc.

Tran Thi Hong Hanh, Laboratory of Microbiology - Faculty of Biotechnology - Vietnam National University of Agriculture. The data and research results in this thesis are honest and have never been published by anyone in other studies. The documents cited in the thesis are listed in the references section. Hanoi, 5th December, 2022.

Sincerely, Nguyen Thi Khanh Linh i ACKNOWLEDGEMENT First of all, I would like to thank the Academy's Board of Directors, lecturers, and staff who are teaching and working at the Academy. I am extremely grateful to the teachers of the Faculty of Biotechnology for teaching, guiding, and creating conditions for me to complete my study program, professional internship, and graduation thesis. More specifically, I would like to express my deep respect and gratitude to Dr. Ngo Thu Huong and MSc.

Tran Thi Hong Hanh for guiding my research and guiding me wholeheartedly during the course of this thesis. I would like to thank the professors of Microbiology Technology, Assoc. Nguyen Xuan Canh, Prof. Nguyen Van Giang, Ms.

Tran Thi Dao, and fellow researchers: Ms. Nguyen Thi Thu, Mr. Duong Van Hoan helped me during the thesis work. Finally, I would like to thank my friends and my family for their encouragement and help so that I could complete my graduation thesis.

Thank you from the bottom of my heart for everything! Hanoi, 5th Decembr , 2022. Sincerely, Nguyen Thi Khanh Linh ii CONTENTS COMMITMENT. iii LIST OF TABLES. vi LIST OF FIGURES .vii LIST OF ABBREVIATIONS.

Overview of peanuts. The history of peanuts. The situation of peanut production in the world and Vietnam. The situation of peanut production in the world.

The situation of peanut production in Vietnam. The role of peanuts. The role of peanuts in the economy. The role of peanuts in agriculture.

The role of peanuts in human life. White mold root rot disease on the peanuts by Sclerotium rolfsii. Overview of Sclerotium rolfsii. Overview of bacteria.

Overview of Bacillus subtilis. Overview of Bacillus subtilis H14. The research situation in the world and Vietnam. The research situation in the world.

The research situation in Vietnam. MATERIALS AND METHODS. Research location and time. The dual culture method for testing antagonistic activity.

Methods for testing the effects of cell-free filtrate from B. subtilis H14 strain on the mycelial growth and sclerotial germination of Sclerotium rolfsii. Method of filtration through sterile filter paper. Method of filtration through sterile Cellulose filter membrane with pore size 0.

Method of filtration through sterile Syringe filter membrane with pore size 0. Mycelial growth inhibition test. Hyphal morphology inhibition test. Sclerotial formation inhibition test.

Sclerotial germination inhibition test. Sclerotial morphology inhibition test. rolfsii on peanuts in vivo condition. RESULTS AND DISCUSSION.

Antagonistic activity of B. subtilis H14 strain on S. Antifungal ability of cell-free filtrate from B. subtilis H14 strain on the mycelial growth and sclerotial germination of Sclerotium rolfsii.

Antifungal ability of cell-free filtrate by using sterile filter paper. Antifungal ability of cell-free filtrate by using sterile Cellulose filter membrane with pore size 0. Antifungal ability of cell-free filtrate by using sterile Syringe filter membrane with pore size 0. Inhibitory ability of cell-free filtrate on mycelial growth .