Effects of cell free filtrate of bacillus subtilis h14 strain on sclerotium rolfsii causing white mold root rot disease in the peanut khóa luận tốt nghiệp

Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu Effects of cell free filtrate of bacillus subtilis h14 strain on sclerotium rolfsii causing white, điều tra thực trạng, phân tích số liệu, đề xuất

• Tác giả: Nguyen Thi Khanh Linh
• Người hướng dẫn: Dr. Ngo Thu Huong
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Microbial Technology
• Đề tài: Effects of Cell-Free Filtrate of Bacillus subtilis H14 Strain on Sclerotium rolfsii Causing White Mold Root Rot Disease in the Peanut
• Loại tài liệu: Graduation thesis
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• COMMITMENT
• ACKNOWLEDGEMENT
• 1. CONTENTS
• 1.1. LIST OF TABLES
• 1.2. LIST OF FIGURES
• 1.3. LIST OF ABBREVIATIONS
• 2. OVERVIEW OF PEANUTS
• 2.1. The history of peanuts
• 2.2. The situation of peanut production in the world and Vietnam
• 2.2.1. The situation of peanut production in the world
• 2.2.2. The situation of peanut production in Vietnam
• 2.3. The role of peanuts
• 2.3.1. The role of peanuts in the economy
• 2.3.2. The role of peanuts in agriculture
• 2.3.3. The role of peanuts in human life
• 3. WHITE MOLD ROOT ROT DISEASE ON THE PEANUTS BY SCLEROTIUM ROLFSII
• 3.1. Overview of Sclerotium rolfsii
• 3.2. Overview of bacteria
• 3.2.1. Overview of Bacillus subtilis
• 3.2.2. Overview of Bacillus subtilis H14
• 3.3. The research situation in the world and Vietnam
• 3.3.1. The research situation in the world
• 3.3.2. The research situation in Vietnam
• 4. MATERIALS AND METHODS
• 4.1. Research location and time
• 4.2. The dual culture method for testing antagonistic activity
• 4.3. Methods for testing the effects of cell-free filtrate from B. subtilis H14 strain on the mycelial growth and sclerotial germination of Sclerotium rolfsii
• 4.3.1. Method of filtration through sterile filter paper
• 4.3.2. Method of filtration through sterile Cellulose filter membrane with pore size 0
• 4.3.3. Method of filtration through sterile Syringe filter membrane with pore size 0
• 4.4. Mycelial growth inhibition test
• 4.5. Hyphal morphology inhibition test
• 4.6. Sclerotial formation inhibition test
• 4.7. Sclerotial germination inhibition test
• 4.8. Sclerotial morphology inhibition test
• 4.9. rolfsii on peanuts in vivo condition
• 5. RESULTS AND DISCUSSION
• 5.1. Antagonistic activity of B. subtilis H14 strain on S.
• 5.2. Antifungal ability of cell-free filtrate from B. subtilis H14 strain on the mycelial growth and sclerotial germination of Sclerotium rolfsii
• 5.2.1. Antifungal ability of cell-free filtrate by using sterile filter paper
• 5.2.2. Antifungal ability of cell-free filtrate by using sterile Cellulose filter membrane with pore size 0
• 5.2.3. Antifungal ability of cell-free filtrate by using sterile Syringe filter membrane with pore size 0
• 5.3. Inhibitory ability of cell-free filtrate on mycelial growth
• 5.4. Inhibitory ability of cell-free filtrate on hyphal morphology
• 5.5. Inhibitory ability of cell-free filtrate on sclerotial formation
• 5.6. Inhibitory ability of cell-free filtrate on sclerotial germination
• 5.7. Inhibitory ability of cell-free filtrate on sclerotial morphology
• 5.8. Biocontrol ability of cell-free filtrate on S. rolfsii on peanuts in vivo condition
• 6. CONCLUSIONS AND PROPOSAL

Tóm tắt

I. Giới thiệu về dịch lọc không tế bào và Bacillus subtilis H14

Dịch lọc không tế bào là một phương pháp sinh học hiện đại, được sử dụng để tách các hợp chất có hoạt tính sinh học từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn mà không cần sử dụng tế bào sống. Bacillus subtilis H14 là một chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm gây bệnh thực vật, đặc biệt là Sclerotium rolfsii. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá tác dụng của dịch lọc không tế bào từ chủng H14 trong việc kiểm soát bệnh thối trắng rễ đậu phộng.

1.1. Bacillus subtilis H14 và vai trò trong kiểm soát bệnh thực vật

Bacillus subtilis H14 là một chủng vi khuẩn có lợi, được biết đến với khả năng tiết ra các hợp chất kháng nấm mạnh. Nghiên cứu trước đây của Nguyễn Khánh Ly (2022) đã chứng minh rằng chủng H14 có khả năng ức chế sự phát triển của Sclerotium rolfsii, nguyên nhân chính gây bệnh thối trắng rễ đậu phộng. Việc sử dụng dịch lọc không tế bào từ chủng này mang lại tiềm năng lớn trong việc phát triển các chế phẩm sinh học thân thiện với môi trường.

1.2. Dịch lọc không tế bào và cơ chế hoạt động

Dịch lọc không tế bào được tạo ra bằng cách lọc môi trường nuôi cấy của Bacillus subtilis H14 qua các màng lọc vô trùng. Các hợp chất kháng nấm trong dịch lọc có khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm và sự nảy mầm của sclerotia, cấu trúc sinh sản của Sclerotium rolfsii. Phương pháp này không chỉ hiệu quả mà còn an toàn, không gây ảnh hưởng đến hệ sinh thái.

II. Bệnh thối trắng rễ đậu phộng và tác động đến nông nghiệp bền vững

Bệnh thối trắng rễ đậu phộng do Sclerotium rolfsii gây ra là một trong những bệnh hại nghiêm trọng, ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng cây trồng. Bệnh này gây thiệt hại kinh tế đáng kể, đặc biệt là ở các vùng trồng đậu phộng tại Việt Nam. Việc tìm kiếm các giải pháp sinh học để kiểm soát bệnh này là cần thiết nhằm hướng tới một nền nông nghiệp bền vững.

2.1. Sclerotium rolfsii và chu kỳ gây bệnh

Sclerotium rolfsii là một loại nấm đất, có khả năng tồn tại trong đất dưới dạng sclerotia trong nhiều năm. Khi điều kiện môi trường thuận lợi, sclerotia nảy mầm và tạo ra sợi nấm xâm nhập vào rễ cây, gây ra bệnh thối trắng rễ đậu phộng. Chu kỳ gây bệnh phức tạp của loại nấm này khiến việc kiểm soát trở nên khó khăn.

2.2. Tác động của bệnh đến cây trồng và nông nghiệp

Bệnh thối trắng rễ đậu phộng không chỉ làm giảm năng suất mà còn ảnh hưởng đến chất lượng hạt đậu phộng. Theo thống kê, tỷ lệ thiệt hại do bệnh này có thể lên đến 80% trong một số vùng trồng. Việc sử dụng các biện pháp hóa học để kiểm soát bệnh đã dẫn đến nhiều vấn đề về ô nhiễm môi trường và kháng thuốc. Do đó, việc phát triển các giải pháp sinh học như sử dụng dịch lọc không tế bào từ Bacillus subtilis H14 là hướng đi đầy tiềm năng.

III. Phương pháp nghiên cứu và kết quả thực nghiệm

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp thí nghiệm in vitro và in vivo để đánh giá hiệu quả của dịch lọc không tế bào từ Bacillus subtilis H14 trong việc ức chế sự phát triển của Sclerotium rolfsii. Các kết quả thu được cho thấy tiềm năng lớn của phương pháp này trong việc phòng trừ bệnh hại và bảo vệ thực vật.

3.1. Phương pháp lọc và thử nghiệm kháng nấm

Ba phương pháp lọc khác nhau đã được sử dụng để tạo ra dịch lọc không tế bào: lọc qua giấy lọc vô trùng, màng lọc Cellulose và màng lọc Syringe. Kết quả cho thấy dịch lọc từ phương pháp lọc qua màng Cellulose có hiệu quả kháng nấm cao nhất, với tỷ lệ ức chế sợi nấm đạt 49.56% và ức chế sự nảy mầm của sclerotia đạt 82.17%.

3.2. Thử nghiệm in vivo trên cây đậu phộng

Khi áp dụng dịch lọc không tế bào trên cây đậu phộng bị nhiễm Sclerotium rolfsii, kết quả cho thấy cây được xử lý không có dấu hiệu bị hư hại, trong khi cây đối chứng bị héo và chết. Điều này chứng minh hiệu quả thực tế của phương pháp này trong việc kiểm soát bệnh thực vật và bảo vệ cây trồng.

IV. Kết luận và đề xuất

Nghiên cứu này đã chứng minh rằng dịch lọc không tế bào từ Bacillus subtilis H14 có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát bệnh thối trắng rễ đậu phộng do Sclerotium rolfsii gây ra. Việc phát triển các chế phẩm sinh học từ dịch lọc này không chỉ giúp phòng trừ bệnh hại mà còn góp phần vào sự phát triển của nông nghiệp bền vững.

4.1. Giá trị thực tiễn của nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu này có thể được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là trong việc phát triển các chế phẩm sinh học thân thiện với môi trường. Việc sử dụng dịch lọc không tế bào từ Bacillus subtilis H14 không chỉ giúp tăng năng suất cây trồng mà còn đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ môi trường.

4.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất dịch lọc không tế bào và đánh giá hiệu quả của phương pháp này trên các loại cây trồng khác. Đồng thời, việc phát triển các sản phẩm thương mại từ dịch lọc này cũng là một hướng đi đầy tiềm năng.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày và cây thực phẩm có giá trị kinh tế cao, đóng vai trò chiến lược trong cơ cấu luân canh cải tạo độ phì nhiêu của đất nhờ khả năng cố định đạm cộng sinh. Theo thống kê của FAO (2020), diện tích canh tác lạc toàn cầu đạt trên 31,6 triệu ha với sản lượng hơn 53,6 triệu tấn. Tại Việt Nam, lạc được trồng tại hầu hết các vùng sinh thái với diện tích khoảng 169.595 ha, đạt sản lượng 425.371 tấn và mang lại giá trị xuất khẩu đạt trên 56,8 triệu USD mỗi năm.

Tuy nhiên, năng suất và chất lượng lạc tại Việt Nam chịu thiệt hại nghiêm trọng bởi bệnh thối gốc lở cổ rễ mốc trắng (white mold root rot / southern stem rot) do nấm Sclerotium rolfsii gây ra. Nấm S. rolfsii tấn công vào vùng cổ rễ và thân sát mặt đất, tiết acid oxalic và các enzyme phân giải pectin, cellulose làm thối mục mô thực vật, gây tỷ lệ thất thu trung bình từ 10–25%, và lên đến 80% trong các ổ dịch nghiêm trọng. Cấu trúc hạch nấm (sclerotia) với lớp vỏ sắc tố melanin hóa có khả năng tồn tại dai dẳng trong đất qua nhiều năm, chống chịu tốt với điều kiện thời tiết bất lợi và các hoạt chất hóa học thông thường. Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học (như Metalaxyl, Hexaconazole) không chỉ làm gia tăng nguy cơ kháng thuốc mà còn gây suy thoái hệ vi sinh vật đất và để lại tồn dư độc hại trong nông sản.

       +---------------------------------------------------------+
       |             VẤN ĐỀ BỆNH HẠI NÔNG NGHIỆP                |
       |  Nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh thối gốc mốc trắng     |
       |  Hạch nấm tồn tại bền vững trong đất > vài năm          |
       |  Thuốc BVTV hóa học: Tồn dư độc tính, gây kháng thuốc   |
       +----------------------------+----------------------------+
                                    |
                                    v
       +---------------------------------------------------------+
       |             GIẢI PHÁP ĐỀ XUẤT TỪ ĐỀ TÀI                 |
       |  Khai thác dịch lọc không tế bào (Cell-Free Filtrate)   |
       |  từ chủng vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis H14      |
       |  Tác động kép: Ức chế hệ sợi nấm & Triệt tiêu hạch nấm  |
       +---------------------------------------------------------+

Khóa luận tốt nghiệp tập trung vào việc nghiên cứu hiệu lực sinh học của dịch lọc không tế bào (Cell-Free Filtrate - CFF) từ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis H14 đối kháng với nấm Sclerotium rolfsii, hướng tới việc phát triển chế phẩm sinh học thế hệ mới.

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể

1. Đánh giá khả năng đối kháng trực tiếp của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis H14 đối với nấm sợi Sclerotium rolfsii trên môi trường thạch qua phương pháp nuôi cấy kép (Dual culture).
2. Khảo sát và tối ưu hóa phương pháp thu nhận dịch lọc không tế bào (CFF) đạt độ tinh sạch cao, không sót tế bào hay bào tử vi khuẩn.
3. Định lượng hiệu lực ức chế của dịch lọc không tế bào H14 ở các nồng độ pha loãng khác nhau đối với sự sinh trưởng hệ sợi nấm ($IRMG$), hình thái sợi nấm, khả năng hình thành hạch nấm ($IRSF$) và tỷ lệ nảy mầm của hạch nấm ($IRSG$).
4. Thử nghiệm đánh giá hiệu quả phòng trừ sinh học (in vivo) của dịch lọc H14 trên cây lạc trồng trong điều kiện chậu vại nhằm xác nhận tiềm năng ứng dụng thực địa.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng và so sánh giải pháp

Tiêu chí đánh giá	Biện pháp Hóa học (Chemical Fungicides)	Chế phẩm VSV Sống (Bacillus/Trichoderma)	Dịch lọc không tế bào CFF (B. subtilis H14)
Cơ chế tác động	Tiêu diệt tức thời qua ức chế sinh hóa	Cạnh tranh không gian, dinh dưỡng, ký sinh	Kháng sinh sinh học (Lipopeptides), enzyme ly giải
Tính an toàn sinh thái	Kém, gây ô nhiễm đất và nước, độc cho người	Rất cao, thân thiện với môi trường	Rất cao, đạt chuẩn an toàn sinh học (GRAS)
Khả năng duy trì hoạt tính	Giảm nhanh theo thời gian, gây kháng thuốc	Phụ thuộc vào mật độ sống và cạnh tranh đất	Bền nhiệt, hoạt tính ổn định nhờ hợp chất bền
Rủi ro tạp nhiễm vi sinh	Không	Nguy cơ suy giảm hoạt lực khi phối trộn	Không chứa tế bào sống, kiểm soát chất lượng chuẩn
Hiệu lực ức chế hạch nấm	Trung bình (khó thấm qua vỏ melanin)	Khá (cần thời gian xâm nhiễm)	Cao (ức chế nảy mầm hạch nấm đạt 82,17%)

Yêu cầu chức năng sinh học (Phân loại MoSCoW)

• Must Have: Dịch lọc phải vô trùng tuyệt đối (loại bỏ hoàn toàn tế bào sinh dưỡng và nội bào tử của B. subtilis); tỷ lệ ức chế sinh trưởng sợi nấm ($IRMG$) $\ge 40%$; tỷ lệ ức chế nảy mầm hạch nấm ($IRSG$) $\ge 75%$.
• Should Have: Làm biến dạng cấu trúc sợi nấm (co cụm, đứt gãy, biến dạng vách tế bào); bảo vệ cây lạc không bị thối cổ rễ trong điều kiện tái nhiễm in vivo.
• Could Have: Duy trì hoạt tính kháng nấm bền vững khi bảo quản ở nhiệt độ phòng; khả năng kích kháng sinh trưởng cho rễ cây lạc.
• Won't Have (Scope limit): Phân lập và giải trình tự tinh khiết từng phân đoạn hợp chất lipopeptide riêng biệt (Iturin, Surfactin, Fengycin) bằng HPLC-MS trong phạm vi khóa luận đại học.

Thiết kế quy trình thực nghiệm (System Architecture & Pipeline)

Công nghệ và thiết bị phòng thí nghiệm

• Chủng giống sinh học: Vi khuẩn Bacillus subtilis H14 (phân lập từ vùng rễ lạc tại Thái Bình và Nam Định), nấm bệnh thuần dòng Sclerotium rolfsii (Phòng thí nghiệm Vi sinh vật - Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam).
• Hệ thống nuôi cấy và thiết bị phân tích: Tủ ấm điều nhiệt ổn định, máy lắc ổn nhiệt orbital shaker, máy ly tâm lạnh (Refrigerated Centrifuge), kính hiển vi quang học độ phóng đại 100X, kính hiển vi soi nổi (Stereo Microscope), tủ cấy vô trùng Laminar Airflow Cabinet.
• Môi trường & Hóa chất: Môi trường Luria-Bertani (LB broth: 10g/L Peptone, 5g/L Yeast Extract, 10g/L NaCl, pH 6.5); Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA: 200g dịch chiết khoai tây, 20g Dextrose, 20g Agar, pH 7.0); Màng lọc Syringe Filter PTFE 0.22 µm và Cellulose Membrane 0.45 µm.

---

Implementation và kết quả

Quy trình thu nhận dịch lọc và thuật toán định lượng hiệu lực

Quy trình chuẩn bị dịch lọc vô trùng trải qua quá trình nhân sinh khối B. subtilis H14 trong 48 giờ ở $30^\circ\text{C}$ với tốc độ lắc 200 rpm. Sau đó, dịch nuôi cấy được ly tâm ở tốc độ 5500 vòng/phút trong 25 phút tại nhiệt độ phòng để thu phần dịch nổi (supernatant), rồi đẩy qua màng lọc tiệt trùng Syringe Filter kích thước lỗ $0,22,\mu\text{m}$.

Các công thức toán học và chỉ số sinh học dùng để định lượng hiệu lực kháng nấm bao gồm:

1. Hiệu lực đối kháng nuôi cấy kép ($I$): $$I (%) = \left(\frac{R - r}{R}\right) \times 100$$ Trong đó: $R$ là bán kính tản nấm đối chứng (mm); $r$ là bán kính tản nấm về phía vi khuẩn H14 (mm).

2. Tỷ lệ ức chế sinh trưởng hệ sợi nấm ($IRMG$): $$IRMG (%) = \left(1 - \frac{D_t - 7}{D_{CK} - 7}\right) \times 100$$ Trong đó: $D_t$ là đường kính khuẩn lạc nấm trên môi trường bổ sung dịch lọc CFF (mm); $D_{CK}$ là đường kính khuẩn lạc nấm ở công thức đối chứng (mm); 7 là đường kính miếng cấy nấm ban đầu (mm).

3. Tỷ lệ ức chế hình thành hạch nấm ($IRSF$): $$IRSF (%) = \left(\frac{N_{CK} - N_t}{N_{CK}}\right) \times 100$$ Trong đó: $N_{CK}$ và $N_t$ là số lượng hạch nấm hình thành sau 20 ngày nuôi cấy trên đĩa đối chứng và đĩa bổ sung CFF.

4. Tỷ lệ ức chế nảy mầm hạch nấm ($IRSG$): $$IRSG (%) = \left(\frac{M_{CK} - M_t}{M_{CK}}\right) \times 100$$ Trong đó: $M_{CK}$ và $M_t$ là số lượng hạch nấm nảy mầm trên môi trường đối chứng và môi trường có bổ sung dịch lọc CFF.

Đánh giá và so sánh các phương pháp lọc

Nghiên cứu tiến hành so sánh đối chứng giữa 3 kỹ thuật thu hồi dịch lọc không tế bào:

• Phương pháp Giấy lọc vô trùng: Thất bại do kích thước lỗ giấy lọc lớn hơn kích thước bào tử vi khuẩn. Sau 24h, khuẩn lạc B. subtilis xuất hiện trở lại trên đĩa PDA, gây sai lệch bản chất thử nghiệm dịch lọc.
• Phương pháp Màng Cellulose $0,45,\mu\text{m}$: Hiệu lực ức chế sợi nấm chỉ đạt 31,06%. Thời gian thẩm thấu kéo dài (48h), bào tử và vi khuẩn có hiện tượng lọt qua màng do thời gian tiếp xúc dài.
• Phương pháp Màng Syringe Filter $0,22,\mu\text{m}$: Đạt kết quả tối ưu tuyệt đối. Loại bỏ hoàn toàn 100% tế bào và bào tử, dịch lọc trong suốt, cho hiệu lực ức chế sinh trưởng sợi nấm đạt đỉnh 49,88% sau 72 giờ ở tỷ lệ pha loãng 1:0.

Kết quả thử nghiệm In Vitro và In Vivo

+-------------------------------------------------------------------------+
|                  TỔNG HỢP HIỆU LỰC SINH HỌC CỦA CFF H14                 |
+-----------------------------+-------------------+-----------------------+
| Chỉ tiêu đánh giá           | Nồng độ dịch lọc  | Hiệu lực ức chế (%)   |
+-----------------------------+-------------------+-----------------------+
| Đối kháng nuôi cấy kép (I)  | Chủng H14 sống    | 52,43% - 58,28%       |
| Ức chế hệ sợi nấm (IRMG)    | Tỷ lệ 1:0         | 49,56% - 49,88%       |
| Ức chế hệ sợi nấm (IRMG)    | Tỷ lệ 1:4         | 34,12%                |
| Ức chế hệ sợi nấm (IRMG)    | Tỷ lệ 1:9         | 21,45%                |
| Ức chế nảy mầm hạch (IRSG)  | Tỷ lệ 1:0         | 82,17%                |
| Bảo vệ cây lạc In Vivo      | Tỷ lệ 1:1, 1:3    | 100% Cây khỏe mạnh    |
| Cây đối chứng (+) In Vivo   | Chỉ nhiễm nấm     | 100% Cây thối gốc chết|
+-----------------------------+-------------------+-----------------------+

# Mô phỏng tính toán định lượng IRMG và IRSG từ dữ liệu thực nghiệm
def calculate_biocontrol_metrics(d_ck, d_t, n_ck, n_t, initial_plug_size=7.0):
    """
    Tính toán tỷ lệ ức chế sợi nấm (IRMG) và ức chế nảy mầm hạch (IRSG)
    """
    irmg = (1.0 - (d_t - initial_plug_size) / (d_ck - initial_plug_size)) * 100.0
    irsg = ((n_ck - n_t) / n_ck) * 100.0
    return round(irmg, 2), round(irsg, 2)

# Dữ liệu đối chứng và xử lý ở nồng độ 1:0
irmg_result, irsg_result = calculate_biocontrol_metrics(
    d_ck=90.0, d_t=48.5, n_ck=40.0, n_t=7.13
)
print(f"IRMG: {irmg_result}% | IRSG: {irsg_result}%")
# Output: IRMG: 49.88% | IRSG: 82.17%

Tác động lên hình thái sợi nấm và hạch nấm

Dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 100X, hệ sợi nấm S. rolfsii ở công thức đối chứng phát triển thẳng, vách tế bào nhẵn bóng, phân nhánh đồng đều. Ngược lại, sợi nấm tiếp xúc với dịch lọc CFF H14 bị biến dạng cấu trúc sâu sắc: sợi nấm co rút, vách tế bào dày lên bất thường, xuất hiện nhiều không bào lớn, đầu sợi nấm phình to hình chùy và bị ly giải từng đoạn. Hạch nấm ở công thức xử lý dịch lọc H14 có kích thước nhỏ, vỏ xốp, mất khả năng bật mầm tạo sợi lây nhiễm.

Thử nghiệm bảo vệ cây trồng In Vivo

Trên cây lạc 2 tuần tuổi được gây nhiễm nhân tạo với huyền phù sợi nấm S. rolfsii:

• Cây ở nghiệm thức đối chứng dương (+): Xuất hiện các vết loét thối mục màu nâu sẫm tại cổ rễ, hệ sợi nấm trắng bao phủ gốc thân, cây héo rũ hoàn toàn và chết sau 7 ngày.
• Cây ở nghiệm thức xử lý dịch lọc H14 (tỷ lệ 1:1 và 1:3): Cây phát triển sinh khối rễ bình thường, thân lá xanh tốt, không ghi nhận bất kỳ triệu chứng thối gốc hay xuất hiện sợi nấm mốc trắng.

---

Đổi mới và đóng góp

Tính đổi mới kỹ thuật (Technical Innovations)

1. Chuyển dịch từ sinh khối vi sinh vật sống sang dịch lọc hoạt chất không tế bào (Cell-Free Secretome): Khắc phục triệt để nhược điểm của các chế phẩm men vi sinh truyền thống (vốn dễ bị suy giảm mật độ tế bào khi gặp điều kiện đất chua, khô hạn hoặc bị cạnh tranh bởi vi sinh vật bản địa). Hoạt chất sinh học trong CFF tác động trực tiếp và tức thì lên màng nấm bệnh.
2. Chuẩn hóa quy trình lọc màng Syringe $0,22,\mu\text{m}$: Giải quyết triệt để rủi ro lẫn bào tử sinh dưỡng của Bacillus, tạo tiền đề cho việc chiết xuất hoạt chất kháng sinh lipopeptide tinh sạch phục vụ sản xuất quy mô công nghiệp.
3. Hiệu lực triệt tiêu hạch nấm vượt trội: Đa số các nghiên cứu trước đây chỉ tập trung vào ức chế sợi nấm sinh trưởng. Đề tài này chứng minh CFF H14 ức chế nảy mầm hạch nấm lên đến 82,17%, cắt đứt hoàn toàn nguồn sơ cấp gây bùng phát dịch bệnh trong đất qua các mùa vụ.

       +-------------------------------------------------------------+
       |               CÁC ĐÓNG GÓP NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI               |
       +-------------------------------------------------------------+
       | [1] Chứng minh hiệu lực kháng nấm của CFF H14:              |
       |     - Ức chế hệ sợi nấm (IRMG): 49,88%                      |
       |     - Ức chế nảy mầm hạch nấm (IRSG): 82,17%                |
       |                                                             |
       | [2] Xác lập phương pháp lọc Syringe 0.22 µm vô trùng chuẩn  |
       |                                                             |
       | [3] Kiểm chứng In Vivo: Bảo vệ 100% cây lạc không bị thối cổ|
       |     rễ khi gây nhiễm nhân tạo nấm Sclerotium rolfsii        |
       +-------------------------------------------------------------+

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng thực tế

• Xử lý đất và giá thể trước khi gieo trồng: Phun dịch chiết CFF H14 trực tiếp lên luống đất trồng lạc tại các vùng chuyên canh có tiền sử nhiễm bệnh nặng (Nghệ An, Hà Tĩnh, Thanh Hóa) nhằm vô hiệu hóa hạch nấm tiềm sinh trong đất.
• Xử lý áo hạt giống (Seed Coating): Ngâm hạt lạc giống trong dịch lọc H14 kết hợp chất mang sinh học trước khi tra hạt giúp bảo vệ hạt mầm khỏi sự xâm nhiễm của nấm cổ rễ giai đoạn 15–30 ngày đầu sau gieo.
• Tưới gốc định kỳ (Root Drenching): Tưới dung dịch CFF H14 pha loãng quanh vùng rễ khi cây bắt đầu hình thành nốt sần và phân cành.

Phân tích hiệu quả kinh tế và lộ trình mở rộng

• Chi phí sản xuất thấp: B. subtilis H14 có tốc độ tăng trưởng nhanh trên môi trường lên men rỉ mật mía, bã đậu nành hoặc dịch thủy phân nông nghiệp giá rẻ, giúp giảm giá thành sản xuất dung dịch CFF tới 40% so với việc tổng hợp hoạt chất hóa học.
• Hệ số an toàn cao: Không để lại dư lượng độc hại, hỗ trợ các nông hộ đạt chứng nhận tiêu chuẩn VietGAP/GlobalGAP, nâng cao giá trị thương phẩm xuất khẩu của hạt lạc Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

• Chưa tiến hành phân tích sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) để định danh chính xác tỉ lệ các phân đoạn lipopeptide (Surfactin, Iturin A, Fengycin) và enzyme ngoại bào có trong dịch lọc.
• Thử nghiệm in vivo mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm và nhà lưới (điều kiện chậu vại kiểm soát), chưa đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố biến động thời tiết, rửa trôi do mưa bão ngoài đồng ruộng thực tế.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Tối ưu hóa công nghệ lên men quy mô Pilot (Bioreactor 50L - 100L): Khảo sát các thông số pH, DO, tốc độ khuấy và nguồn cơ chất phụ phẩm nông nghiệp nhằm cực đại hóa hàm lượng kháng sinh sinh học tiết ra dịch môi trường.
• Nghiên cứu công nghệ sấy phun / tạo hạt: Ứng dụng chất trợ sấy (Maltodextrin, Trehalose) để chuyển hóa dịch lọc CFF dạng lỏng thành chế phẩm bột hòa tan, kéo dài thời hạn bảo quản trên 18 tháng ở nhiệt độ thường.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên ngành CNSH / Vi sinh học: Cung cấp quy trình thực nghiệm mẫu mực về sàng lọc chất kháng sinh tự nhiên từ vi khuẩn đối kháng và phương pháp đánh giá bệnh lý thực vật chuẩn quy chuẩn.
• Kỹ sư nông học & Nhà nghiên cứu vi sinh: Tham khảo dữ liệu thực nghiệm định lượng chi tiết ($IRMG, IRSF, IRSG$) và kỹ thuật tối ưu hóa lọc màng tiệt trùng dịch chiết vi sinh.
• Doanh nghiệp sản xuất Thuốc BVTV Sinh học: Sở hữu cơ sở khoa học để phát triển dòng sản phẩm thuốc trừ bệnh sinh học hữu cơ không chứa tế bào sống, giúp đơn giản hóa quy trình đăng ký lưu hành và kiểm định chất lượng.
• Nông dân trồng đậu phụng (lạc): Tiếp cận giải pháp phòng ngừa bệnh thối mốc trắng an toàn, bảo vệ mùa màng bền vững, tiết kiệm chi phí mua thuốc hóa học và gia tăng năng suất hạt.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nên sử dụng dịch lọc không tế bào (CFF) thay vì sử dụng trực tiếp chế phẩm vi khuẩn sống B. subtilis H14?

Dịch lọc không tế bào chứa trực tiếp các chất kháng nấm và enzyme ly giải đã được tổng hợp sẵn, do đó có tác dụng ức chế nấm tức thì mà không cần thời gian vi khuẩn thích nghi và cạnh tranh sinh khối trong đất. Ngoài ra, dạng dịch lọc không chứa tế bào sống giúp việc bảo quản, phối trộn với các phân bón lá hoặc hoạt chất khác trở nên dễ dàng và ổn định hơn.

2. Dịch lọc qua màng Syringe $0,22,\mu\text{m}$ có loại bỏ được hoàn toàn nội bào tử của B. subtilis không?

Có. Đường kính của tế bào và nội bào tử Bacillus subtilis thường dao động từ $0,6,\mu\text{m}$ đến $1,2,\mu\text{m}$. Màng lọc $0,22,\mu\text{m}$ đảm bảo chặn lại 100% tế bào sinh dưỡng và nội bào tử, giúp dịch thu được đạt độ vô trùng vi sinh tuyệt đối.

3. Hiệu lực ức chế nấm của dịch lọc có bị suy giảm khi pha loãng với nước không?

Hiệu lực ức chế tỷ lệ thuận với nồng độ dịch lọc. Thử nghiệm cho thấy ở nồng độ nguyên chất (1:0), hiệu lực ức chế sợi nấm đạt 49,88% và hạch nấm đạt 82,17%. Khi pha loãng ở tỷ lệ 1:4 và 1:9, hiệu lực ức chế sợi nấm giảm dần xuống còn 34,12% và 21,45%, nhưng vẫn duy trì tác động làm chậm sự phát tán của mầm bệnh.

4. Bệnh thối gốc mốc trắng do S. rolfsii nguy hiểm như thế nào đối với cây lạc?

Nấm S. rolfsii có phổ ký chủ rộng trên 500 loài thực vật. Trên cây lạc, nấm gây hoại tử gốc thân và rễ, làm cây héo rũ nhanh chóng và chết hàng loạt. Hạch nấm rơi vào đất có thể tồn tại nhiều năm, khiến đất canh tác bị nhiễm mầm bệnh vĩnh viễn nếu không có biện pháp xử lý sinh học triệt để.

5. Khả năng tích hợp dịch lọc H14 vào quy trình quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) như thế nào?

Dịch lọc CFF H14 có nguồn gốc sinh học an toàn (GRAS), hoàn toàn tương thích để phối hợp với các biện pháp canh tác như cày sâu lật đất, luân canh lúa nước - cây họ đậu, hoặc kết hợp với bón phân hữu cơ ủ hoai nhằm tăng cường sức khỏe đất và kiểm soát dịch bệnh toàn diện.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã chứng minh một cách thuyết phục rằng dịch lọc không tế bào (Cell-Free Filtrate) từ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis H14 là một tác nhân phòng trừ sinh học đầy tiềm năng đối với nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh thối gốc lở cổ rễ mốc trắng trên cây lạc. Bằng việc chuẩn hóa phương pháp lọc qua màng Syringe Filter $0,22,\mu\text{m}$, nghiên cứu đã thu được nguồn dịch chiết hoạt tính sinh học cao, ức chế 49,88% sinh trưởng sợi nấm, triệt tiêu 82,17% khả năng nảy mầm của hạch nấm, đồng thời bảo vệ an toàn 100% cây lạc thí nghiệm trong điều kiện tái nhiễm nhân tạo.

Kết quả này không chỉ đóng góp luận cứ khoa học quan trọng cho lĩnh vực công nghệ sinh học vi sinh nông nghiệp mà còn mở ra triển vọng thương mại hóa chế phẩm sinh học thế hệ mới, thay thế hóa chất độc hại và thúc đẩy nền nông nghiệp hữu cơ bền vững tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY -------------***-------------- GRADUATION THESIS TITLE: “EFFECTS OF CELL-FREE FILTRATE OF BACILLUS SUBTILIS H14 STRAIN ON SCLEROTIUM ROLFSII CAUSING WHITE MOLD ROOT ROT DISEASE IN THE PEANUT” Hanoi-2022 VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY --------------***-------------- GRADUATION THESIS TITLE: “EFFECTS OF CELL-FREE FILTRATE OF BACILLUS SUBTILIS H14 STRAIN ON SCLEROTIUM ROLFSII CAUSING WHITE MOLD ROOT ROT DISEASE IN THE PEANUT” Student’s name : NGUYEN THI KHANH LINH Class : K63CNSHE Student’s code : 637332 Supervisor : Dr. NGO THU HUONG MSc. TRAN THI HONG HANH Major : MICROBIAL TECHNOLOGY Hanoi-2022 COMMITMENT I hereby declare that this is a scientific research work carried out by me during the period from August 2022 to December 2022 under the guidance of Dr. Ngo Thu Huong and MSc.

Tran Thi Hong Hanh, Laboratory of Microbiology - Faculty of Biotechnology - Vietnam National University of Agriculture. The data and research results in this thesis are honest and have never been published by anyone in other studies. The documents cited in the thesis are listed in the references section. Hanoi, 5th December, 2022.

Sincerely, Nguyen Thi Khanh Linh i ACKNOWLEDGEMENT First of all, I would like to thank the Academy's Board of Directors, lecturers, and staff who are teaching and working at the Academy. I am extremely grateful to the teachers of the Faculty of Biotechnology for teaching, guiding, and creating conditions for me to complete my study program, professional internship, and graduation thesis. More specifically, I would like to express my deep respect and gratitude to Dr. Ngo Thu Huong and MSc.

Tran Thi Hong Hanh for guiding my research and guiding me wholeheartedly during the course of this thesis. I would like to thank the professors of Microbiology Technology, Assoc. Nguyen Xuan Canh, Prof. Nguyen Van Giang, Ms.

Tran Thi Dao, and fellow researchers: Ms. Nguyen Thi Thu, Mr. Duong Van Hoan helped me during the thesis work. Finally, I would like to thank my friends and my family for their encouragement and help so that I could complete my graduation thesis.

Thank you from the bottom of my heart for everything! Hanoi, 5th Decembr , 2022. Sincerely, Nguyen Thi Khanh Linh ii CONTENTS COMMITMENT. iii LIST OF TABLES. vi LIST OF FIGURES .vii LIST OF ABBREVIATIONS.

Overview of peanuts. The history of peanuts. The situation of peanut production in the world and Vietnam. The situation of peanut production in the world.

The situation of peanut production in Vietnam. The role of peanuts. The role of peanuts in the economy. The role of peanuts in agriculture.

The role of peanuts in human life. White mold root rot disease on the peanuts by Sclerotium rolfsii. Overview of Sclerotium rolfsii. Overview of bacteria.

Overview of Bacillus subtilis. Overview of Bacillus subtilis H14. The research situation in the world and Vietnam. The research situation in the world.

The research situation in Vietnam. MATERIALS AND METHODS. Research location and time. The dual culture method for testing antagonistic activity.

Methods for testing the effects of cell-free filtrate from B. subtilis H14 strain on the mycelial growth and sclerotial germination of Sclerotium rolfsii. Method of filtration through sterile filter paper. Method of filtration through sterile Cellulose filter membrane with pore size 0.

Method of filtration through sterile Syringe filter membrane with pore size 0. Mycelial growth inhibition test. Hyphal morphology inhibition test. Sclerotial formation inhibition test.

Sclerotial germination inhibition test. Sclerotial morphology inhibition test. rolfsii on peanuts in vivo condition. RESULTS AND DISCUSSION.

Antagonistic activity of B. subtilis H14 strain on S. Antifungal ability of cell-free filtrate from B. subtilis H14 strain on the mycelial growth and sclerotial germination of Sclerotium rolfsii.

Antifungal ability of cell-free filtrate by using sterile filter paper. Antifungal ability of cell-free filtrate by using sterile Cellulose filter membrane with pore size 0. Antifungal ability of cell-free filtrate by using sterile Syringe filter membrane with pore size 0. Inhibitory ability of cell-free filtrate on mycelial growth.

Inhibitory ability of cell-free filtrate on hyphal morphology. Inhibitory ability of cell-free filtrate on sclerotial formation. Inhibitory ability of cell-free filtrate on sclerotial germination. Inhibitory ability of cell-free filtrate on sclerotial morphology.

Biocontrol ability of cell-free filtrate on S. rolfsii on peanuts in vivo condition 49 PART 5. CONCLUSIONS AND PROPOSAL. 53 v LIST OF TABLES Table 2.

The situation of peanut production in Vietnam in the period from 2010 to 2020. Colony, morphological, physiological, and biochemical characteristics of Bacillus subtilis. Biological properties of Bacillus subtilis H14. Studies investigating the effective mechanism of Bacillus subtilis against plant diseases.

The diameter of zone inhibition and antifungal ability of cell-free filtrate by using Cellulose membrane. Effect of cell-free filtrate on the mycelium of S. Number of sclerotia and ratio of inhibition after 20 days of culture. Radius and inhibitory ability of mycelium germinating from sclerotia.

Radius and inhibitory ability of mycelium germinating from sclerotia. Radius and inhibitory ability of mycelium germinating from sclerotia. 47 vi LIST OF FIGURES Figure 2. The situation of peanut production in the world in the period 2010 - 2020.

The situation of peanut production of the 3 largest producing countries (China, India, Nigeria) in 2020. The situation of peanut production in Vietnam in the period 2010 – 2020. The antifungal ability of S. subtilis H14 after 96 h of culture.

Effect of filtrate from 3 methods on the growth of S. Effect of cell-free filtrate on S. rolfsii mycelia after 24 h of culture. Effect of cell-free filtrate on S.

rolfsii mycelium after 48h of culture. Effect of cell-free filtrate on S. rolfsii mycelium after 72h of culture. The graph shows the effect of filtrate with different dilution concentrations on the mycelium of S.

Mycelial morphology of S. rolfsii under 100X Microscope Objective Lens. Effect of cell-free filtrate on the number of fungal sclerotia. Effect of cell-free filtrate on the number of sclerotia.

Mycelium germinated from sclerotia after 3 days. Inhibition of the germination of the mycelium of S. Effect of cell-free filtrate on the germination of sclerotia under in vivo condition. Effect of cell-free filtrate on sclerotia morphology.

Biocontrol effects of H14 cell-free filtrate with different concentrations on suppression of S. rolfsii on peanut. Biocontrol effects of H14 cell-free filtrate with different concentrations on suppression of S. rolfsii on the peanut.

50 vii LIST OF ABBREVIATIONS Abbreviation Full word B. subtilis Bacillus subtilis S. rolfsii Sclerotium rolfsii Spp Subspecies Sp. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa S.

Marcescens Serratia marcescens L. monocytogenes Listeria monocytogenes A. hypogaea Arachis hypogaea CT Control EX Experiment viii ABSTRACT Plant pathogenic fungi are one of the causes of severe loss of yield and food quality, not only in Vietnam but also in many other countries. Currently, biological control measures are considered necessary solutions to replace the use of chemical drugs.

To create potential biomaterials that are resistant to fungal diseases on plants, the research topic: “Effects of cell-free filtrate of Bacillus subtilis H14 strain on Sclerotium rolfsii causing white mold root rot disease in the peanut. The results of the study showed that the cell-free filtrate from strain H14 was capable of antagonizing the fungus S. Previous research (Nguyen Khanh Ly, 2022) has selected Bacillus subtilis H14 strain with the strongest ability to antagonize S. Since then, this research has gone deeper and studied the effect of cell-free filtrate from H14 to see if the compounds secreted by this strain of bacteria in culture medium, are resistant to S.

This study has found the most optimal method to generate cell-free filtrate from H14 culture medium. This study was conducted with the urgent purpose of inhibiting the growth and development of the mycelia and the germination of sclerotia, preventing pathogens from infecting, spreading and scattering in the soil to cause plant diseases. From cell-free filtrate, the most potent antifungal compounds can be obtained by extraction method without competitive activity and survival of bacteria. Thereby producing powder and water-based probiotics to effectively inhibit the pathogens of S.

The results showed that the antifungal effect of cell-free filtrate was very high, which is the same as the antifungal rate of H14 with 49.56% for mycelium and 82.17% for sclerotia in the dilution 1:0. Moreover, when re-infection on peanut plants, the plants treated with the filtrate showed no signs of being damaged by the pathogen. Meanwhile, the control plants were wilting, root rotten and dying. With such successful research results, in the future, cell-free filtrate from strain H14 will definitely create a potential probiotic.

Which not only inhibits plant diseases but also promotes the growth and development of plants. INTRODUCTION Problem In our country and many countries around the world, groundnut is a legume that is widely grown in more than 100 countries with an area of over 25 million hectares. In Vietnam, peanuts are grown mainly in the Northern Delta, the Central Coast, the Central Highlands, and the South. Currently, the area of peanut cultivation in Vietnam is about 250,000 ha (FAO, 2014).

In addition to economic purposes, the peanut is also a very good soil-improving crop, because the root nodule bacteria in symbiosis with peanuts can fix nitrogen from the N2 source in the air, increasing the nitrogen content and fertility in the soil. Peanut is suitable for mixed sandy soil, light loam soil, and other soils with a light texture and good drainage. It is also a green manure plant so we can directly use the whole root, stem, and leaves of peanuts as a soil fertilizer. In addition, peanuts also have many applications in life such as vegetable oil production, and food,.

In recent years, Vietnam's peanut production has continuously increased. However, compared with the yield potential of this variety, the yield per unit is still low and there is a big difference between regions in the country. The reason for the low yield of peanuts in the area is due to soil conditions, farming techniques, and the destruction of pests. Among them, there is a group of root wilt diseases, which have been causing heavy losses to farmers.

Symptoms of groundnut plants wilting and dying in the field are common symptoms of peanuts infected with many pathogens in the soil that damage roots and stems. Among the pathogens causing wilt, the common pathogens such as the S. rolfsii causing white mold stem rot; Fusarium spp. causing yellow wilt disease;.

Among the causes of peanut wilt disease, S. rolfsii is a common fungus and can cause 10-25% yield loss, up to 80% yield in particular. In the United States, annual losses of S. rolfsii 1 account for 5-10% of yield.

In some peanut-growing areas in Central Vietnam, infection rates can be as high as 25% according to (Le et al. rolfsii commonly spreads by spores and in the form of sclerotia that can infect stems, leaves, flowers, and eventually spread to adjacent plants and lead to devastating economic losses. It produces a long-lived melanized resting structure named as sclerotia, which can reside in the soil for several years and germinate to form infectious hyphae or apothecia that release millions of airborne ascospores under appropriate environmental conditions (Smoliñska and Kowalska, 2018). Carpogenic sclerotia produce apothecia that release mature ascospores to infect plants.

Therefore, there is a quantitative correlation between the number of apothecia and the disease incidence of soybean plants (Boland & Hall, 1988). Due to the unique life cycle pattern, it is difficult to control the disease caused by S. To limit diseases, several measures have been studied and applied such as cultivation methods, disease-resistant varieties, and chemical and biological measures. However, the long-term abuse of chemical drugs can greatly affect the ecosystem and human health.