Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ với đề tài “Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật xử lý mùn cưa làm cơ chất nuôi trồng mộc nhĩ và tái sử dụng bã thải để trồng nấm sò” được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Ngô Xuân Chinh dưới sự hướng dẫn của GS. Phạm Văn Toản và TS. Phạm Bích Hiên tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, phối hợp cùng Bộ môn Sinh học Môi trường thuộc Viện Môi trường Nông nghiệp và Khoa Nông Lâm thuộc Trường Đại học Hoa Lư, tỉnh Ninh Bình (hoàn thành vào tháng 03 năm 2018). Công trình thuộc nhóm chuyên ngành khoa học nông nghiệp và công nghệ vi sinh vật ứng dụng, triển khai theo hướng tiếp cận thực nghiệm định lượng kết hợp với nghiên cứu mô hình hóa và ứng dụng thực tế.

Về tính cấp thiết, nấm ăn được xác định là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng với hàm lượng protein thô cao, chứa đầy đủ các axit amin thiết yếu và nhiều hoạt chất có tác dụng dược lý. Mùn cưa từ các cơ sở chế biến gỗ là nguồn phụ phẩm nông - lâm nghiệp dồi dào, giá thành rẻ, có các đặc tính hóa lý thích hợp để làm cơ chất trồng nấm. Tuy nhiên, các loài nấm trồng phổ biến như mộc nhĩ (Auricularia polytricha) và nấm sò (Pleurotus florida) có hệ sợi không thể trực tiếp hấp thụ ngay các cơ chất gỗ cứng hay mùn cưa gỗ tạp chưa qua xử lý do cấu trúc phức hợp ligno - xenluloza rất bền vững. Trong khi đó, các nghiên cứu nấm ăn trong nước trước đây chỉ tập trung chủ yếu vào công tác chọn tạo giống, kỹ thuật nuôi trồng, thu hoạch và bảo quản sau thu hoạch mà chưa chú trọng giải quyết triệt để khâu tiền xử lý cơ chất bằng công nghệ vi sinh vật. Bên cạnh đó, sau chu kỳ thu hoạch mộc nhĩ, lượng bã thải mùn cưa chứa tỷ lệ xenluloza và hemixenluloza tương đương rơm rạ thường bị thải bỏ trực tiếp ra môi trường. Nguồn bã thải này chứa sợi nấm và gốc nấm mộc nhĩ sót lại gây ức chế mạnh đến sự sinh trưởng của các loài nấm khác, đòi hỏi phải có biện pháp xử lý vi sinh để khắc phục và tái sử dụng làm giá thể trồng nấm sò.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm các nội dung cụ thể:

  1. Phân lập, tuyển chọn và xác định được chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp hệ enzyme chuyển hóa hợp chất ligno - xenluloza phục vụ xử lý mùn cưa và bã thải trồng mộc nhĩ.
  2. Xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình nhân sinh khối chủng vi sinh vật được chọn bằng kỹ thuật lên men chìm.
  3. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học và quy trình sử dụng chế phẩm để xử lý mùn cưa làm cơ chất nuôi trồng mộc nhĩ, đồng thời tái sử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất nuôi trồng nấm sò.
  4. Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, năng suất nấm và hiệu quả kinh tế - kỹ thuật của các mô hình ứng dụng chế phẩm vi sinh vật tại địa bàn thực địa.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi sinh vật phân giải ligno - xenluloza phân lập từ đất, mùn cưa và rơm rạ mục; chủng xạ khuẩn tuyển chọn Streptomyces thermocoprophilus MC05; cơ chất mùn cưa gỗ keo và bã thải mùn cưa sau trồng mộc nhĩ; giống nấm mộc nhĩ (Auricularia polytricha) và giống nấm sò trắng (Pleurotus florida) do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp.
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm được tiến hành tại Viện Môi trường Nông nghiệp và Trường Đại học Hoa Lư; các mô hình thử nghiệm ứng dụng quy mô 1.000 bịch được triển khai tại các cơ sở nuôi trồng nấm trên địa bàn tỉnh Ninh Bình; nguồn mẫu phân lập được thu thập tại Hà Nội và Ninh Bình.
  • Phạm vi thời gian: Luận án được thực hiện, nghiệm thu và bảo vệ vào tháng 03 năm 2018, kế thừa các số liệu và hỗ trợ kỹ thuật từ đề tài khoa học công nghệ cấp cơ sở do Trường Đại học Hoa Lư chủ trì.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến phân loại học, giá trị dinh dưỡng, sinh lý phát triển của nấm ăn, cấu trúc hợp chất ligno - xenluloza và hệ vi sinh vật phân giải.

Về nấm mộc nhĩ và nấm sò, tác giả điểm lại các nghiên cứu phân loại của Luo (1993, trích theo Lê Duy Thắng, 1999) xác định mộc nhĩ có khoảng 15-20 loài; Đỗ và Trịnh (1977, trích theo Vương Bá Triệt và cộng sự, 1994) phân loại dựa trên lớp lông tơ trên bề mặt quả thể; Lowy (1951, 1952) phân loại dựa theo vi cấu thái bên trong; Trịnh Tam Kiệt (1986, 2001) xác định Việt Nam có 6 loài mộc nhĩ, phổ biến là Auricularia polytricha và Auricularia auricula. Đối với nấm sò (Pleurotus spp.), Đinh Xuân Linh và cộng sự (2012) cùng Nguyễn Lân Dũng (2004) ghi nhận việc thuần hóa và nuôi trồng tại Việt Nam bắt đầu từ những năm 1974. Về giá trị dinh dưỡng, số liệu phân tích của Nuhu Alam và cộng sự (2008) chỉ ra protein của nấm sò tươi đạt 2,6 - 3,4%, giàu axit amin (Abdurrahman Dundar và cộng sự); FAO (1972) công bố mộc nhĩ khô chứa 7,9% protein thô, 1,2% chất béo và 84,2% cacbonhydrat; Paul Stamets và J. Chilton cung cấp số liệu thành phần hóa học của mùn cưa; Nguyễn Lân Dũng (2001, 2002), Hayes và cộng sự, Lưu (1994), Lin Zhanxi và cộng sự phân tích hàm lượng khoáng và vitamin nhóm B, vitamin C trong quả thể nấm.

Về sinh lý và yếu tố môi trường nuôi trồng, các tác giả Hassan và cộng sự (2012), Miles (1993, 1999), Horr (1936), Chang và Miles (2004) làm rõ nhu cầu cacbon, nitơ, khoáng (P, K, Mg, S, Fe, Cu, Mn, Mo, Zn). Lê Duy Thắng và cộng sự (2001) chỉ ra tỷ lệ C/N thích hợp cho mộc nhĩ là dưới 60/1 (tối ưu 35/1), nấm sò là 20 - 30/1 (không quá 50/1), trong khi mùn cưa gỗ tạp có C/N vượt quá 100/1. Nguyễn Lân Hùng (2000) và Trịnh Tam Kiệt (2013) xác định dải nhiệt độ thích hợp của mộc nhĩ là 25 - 32°C, độ ẩm không khí 80 - 90%, cường độ ánh sáng quả thể đạt 330 lux; nấm sò cần nhiệt độ 25 - 30°C và ánh sáng khuếch tán 100 - 200 lux (Đinh Xuân Linh và cộng sự, 2012).

Về tình hình sản xuất nấm, theo FAO (2015) và Bradley (2013), châu Á chiếm 74,64% sản lượng nấm thế giới, châu Âu chiếm 19,63%; Trung Quốc là quốc gia sản xuất lớn nhất, cung cấp trên 70% sản lượng toàn cầu (Wu và cộng sự, 2013; Zhang và cộng sự, 2014; Li & Hu, 2014). Tại Việt Nam, Trịnh Tam Kiệt (2011) ghi nhận khoảng 1.800 loài nấm lớn; Nguyễn Như Hiến và Phạm Văn Dư (2013) thống kê sản lượng nấm cả nước đạt khoảng 250.000 tấn/năm (mộc nhĩ 120.000 tấn, nấm rơm 64.500 tấn, nấm sò 60.000 tấn), kim ngạch xuất khẩu 70 - 90 triệu USD. Quyết định số 439/QĐ-TTg ngày 16/4/2012 của Thủ tướng Chính phủ đưa nấm ăn và nấm dược liệu vào danh mục sản phẩm quốc gia với mục tiêu đạt 400.000 tấn vào năm 2015 và 1.000.000 tấn vào năm 2020.

Về phức hợp ligno - xenluloza và vi sinh vật phân giải, các công trình của Field và cộng sự (1998), Lynd và cộng sự (2002), Paraveen Kumar và cộng sự (2009), Klemm và cộng sự, Tăng Thị Chính (2001), Nguyễn Thị Hoài Hà (2004), Beguin và cộng sự (1992), Palonen (2004) đã làm rõ cấu trúc bền vững gồm mạch xenluloza liên kết β-1,4 glycosidic, mạng lưới hemixenluloza (xylan, glucomannan) và liên kết phức tạp với lignin phi phenolic/phenolic. Hệ enzyme phân giải gồm endoglucanaza, exoglucanaza, β-glucosidaza (Shewale, 1982; Wilson, 2008, 2011) và enzyme phân giải lignin gồm lignin peroxidaza (LiP), manganese peroxidaza (MnP), laccaza (Kirk & Farrell, 1987; Daljit Singh Arora và cộng sự; Kuwahara và cộng sự; Petr Baldrian, 2005). Các yếu tố kiểm soát đống ủ được tổng kết qua nghiên cứu của Chen và cộng sự (2011), Bach và cộng sự (1984), Blain (1995), Cogger và cộng sự (2009), Lê Hoàng Việt (2004), Stratton (1998) với khoảng nhiệt độ 60 - 65°C, độ ẩm 50 - 60%, tỷ lệ C/N từ 30 - 40 và pH từ 6,0 - 7,5.

Về nghiên cứu cơ chất và tái sử dụng bã thải, tác giả phân tích các nghiên cứu của Liu Fuqing (bổ sung lá keo dậu tỷ lệ C/N 32,7), Wang Yu và cộng sự (2008), Onyanggo và cộng sự (2011), Irawati và cộng sự (2012), Badsah và cộng sự (1992), Jumiati và cộng sự (2006), Peng J.T (2010), Royse & Sanchez-Vazquez (2001), Chang và cộng sự (2004). Về tái sử dụng bã thải trồng nấm: Rinker và cộng sự (2004), Royse (1992), Sripheuk (2007), Ashrafi và cộng sự (2014). Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Lương Bảo Uyên (2008), Đào Anh Thông và cộng sự (2014), Nguyễn Thị Minh (2016), Nguyễn Thị Liên (2017) đã thử nghiệm bã thải làm giá thể trồng rau hoặc sản xuất phân bón vi sinh.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Chưa có công trình nào tại Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống việc phân lập, tuyển chọn và định danh chủng xạ khuẩn có khả năng chịu nhiệt, đồng thời sinh tổng hợp cả 3 enzyme (xenlulaza, LiP, MnP) để tối ưu hóa điều kiện lên men chìm, sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ rút ngắn thời gian ủ mùn cưa trồng mộc nhĩ và tái xử lý chính nguồn bã thải này để nuôi trồng nấm sò.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về quá trình chuyển hóa sinh học hiếu khí của vi sinh vật đối với phức hợp ligno - xenluloza trong chất thải hữu cơ và động thái nhiệt sinh học của khối ủ. Khung lý thuyết phân giải xác định:

  • Phân giải xenluloza qua sự phối hợp của hệ enzyme xenlulozaxome cắt mạch nội bào và ngoại bào tạo đường khử đơn phân (glucoza).
  • Phân giải lignin qua chuỗi phản ứng oxy hóa gián tiếp nhờ MnP (thông qua cặp oxy hóa khử Mn3+/Mn2+) và xúc tác trực tiếp cắt cầu nối aryl, liên kết Cα-Cβ của LiP khi có mặt tác nhân H2O2.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế đồng bộ từ khâu phân lập đến mô hình ứng dụng:

[Mẫu đất, mùn cưa, rơm rạ]
[Phân lập & Sàng lọc hoạt tính CMC-ase (phản ứng Lugol)]
[Tuyển chọn chủng MC05 & Định danh (Hình thái Fe-SEM, Sinh hóa, Giải trình tự gen 16S rRNA)]
[Tối ưu hóa nhân sinh khối lên men chìm (Phương pháp bề mặt đáp ứng RSM & Phân tích ANOVA)]
[Sản xuất chế phẩm sinh học trên thiết bị lên men chìm 50 lít]
[Khảo sát ủ mùn cưa gỗ keo]             [Thử nghiệm trồng mộc nhĩ]              [Ủ bã thải & Trồng nấm sò]
(Độ ẩm, liều lượng, urê, lân, rỉ đường)   (Tốc độ lan sợi, tỷ lệ hỏng, năng suất)  (Tốc độ lan sợi, năng suất nấm sò)
                   [Xây dựng mô hình thực tế 1.000 bịch tại Ninh Bình & Hạch toán kinh tế]

Các phương pháp vi sinh vật và sinh hóa phân tích cụ thể:

  1. Mật độ vi sinh vật: Xác định theo phương pháp nuôi cấy pha loãng trên môi trường thạch đĩa của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (2011), tính theo công thức: $$N = \frac{\sum C}{d \times (n_1 + 0,1 n_2)}$$ Trong đó: $N$ là mật độ vi sinh vật (CFU/g hoặc CFU/ml); $\sum C$ là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa giữ lại; $n_1, n_2$ là số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất và thứ hai; $d$ là hệ số pha loãng thứ nhất.
  2. Phân lập và tuyển chọn: Sử dụng 10 mẫu đất trồng, 10 mẫu mùn cưa và 10 mẫu rơm rạ mục tại Hà Nội và Ninh Bình. Cân 1g mẫu hòa trong 9ml nước cất vô trùng, cấy trang trên môi trường Hutchinson (vi khuẩn), Gause (xạ khuẩn), Czapek (vi nấm). Hoạt tính phân giải xenluloza được xác định định tính bằng thử nghiệm tạo vòng phân giải carboxymethyl celluloza (CMC) trên đĩa thạch phủ dịch lugol (pha 2g KI và 1g I2 trong 300ml nước cất), đo hiệu số giữa đường kính vòng phân giải ($D$) và đường kính lỗ khoan ($d$).
  3. Phân loại xạ khuẩn: Đánh giá đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường chuẩn quốc tế ISP (International Streptomyces Project), chụp ảnh chuỗi bào tử và cuống sinh bào tử dưới kính hiển vi điện tử quét Fe-SEM S-4800 (Hitachi), kết hợp phân tích sinh hóa. Định danh sinh học phân tử bằng tách chiết ADN, khuếch đại gen 16S rRNA trên máy GeneAmp PCR System 9700, giải trình tự trên máy ABI Prism 3100-Avant và dựng cây phát sinh loài.
  4. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme và hóa học cơ chất: Định lượng hoạt độ enzyme xenlulaza, lignin peroxidaza (LiP), manganese peroxidaza (MnP); đo cacbon tổng số, nitơ tổng số, hàm lượng xenluloza và đường khử.
  5. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy: Áp dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) với mô hình phân tích phương sai (ANOVA) để xác định điểm tối ưu của các thông số công nghệ (nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, lưu lượng khí cấp, tỷ lệ tiếp giống) trên thiết bị lên men chìm dung tích 50 lít.
  6. Phương pháp bố trí thí nghiệm và theo dõi nấm: Thí nghiệm ủ mùn cưa với các yếu tố độ ẩm, chất dinh dưỡng bổ sung (đạm urê, super lân Lâm Thao, rỉ đường) và liều lượng chế phẩm. Đánh giá tốc độ lan hệ sợi, thời gian ăn kín bịch, tỷ lệ nhiễm hỏng, đường kính tai nấm, năng suất nấm tươi và hiệu suất sinh học tại mô hình thực nghiệm quy mô 1.000 bịch tại Ninh Bình.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần Mở đầu trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ yêu cầu thực tiễn sản xuất nấm ăn tại Việt Nam, mục tiêu tổng quát và 4 mục tiêu cụ thể, ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn, cùng 4 luận điểm đóng góp mới của luận án. Nghiên cứu khẳng định việc ứng dụng xạ khuẩn phân giải ligno - xenluloza là mắt xích kỹ thuật quyết định để nâng cao hiệu quả chuyển hóa cơ chất mùn cưa và tái sinh nguồn bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất cho nấm sò.

Chương I: Tổng quan tài liệu

Chương I tổng thuật chi tiết cơ sở dữ liệu học thuật về đặc tính sinh học, phân loại, giá trị dinh dưỡng của mộc nhĩ và nấm sò; tình hình sản xuất nấm trên thế giới và tại Việt Nam; cấu tạo hóa học phức tạp của ligno - xenluloza; các hệ vi sinh vật phân giải và enzyme liên quan; các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân hủy sinh học và thực trạng công nghệ xử lý mùn cưa, tái sử dụng phế phụ phẩm.

Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của một số loài nấm sò tươi (Nguồn: Nuhu Alam et al., 2008)

Loài nấm Độ ẩm (%) Protein (%) Lipid (%) Cacbonhydrat (%) Chất xơ (%) Tro (%)
Pleurotus ostreatus 86,0 3,40 0,68 3,40 1,18 5,10
Pleurotus sajor-caju 87,0 3,26 0,57 2,97 1,10 5,09
Pleurotus florida 87,5 2,60 0,54 3,00 1,13 5,24

Bảng 2: Thành phần axit amin của nấm sò (Nguồn: Abdurrahman Dundar et al.)

Axit amin (mg/g vật chất khô) Pleurotus ostreatus Pleurotus sajor-caju
Alanine 12,53 11,24
Glycine 10,43 9,37
Valine 10,51 10,04
Leucine 16,36 14,61
Isoleucine 9,88 11,20
Threonine 9,43 8,95
Serine 7,91 7,65
Proline 8,15 7,91
Aspartic axit 22,53 20,12
Methionine 2,69 2,72
Glutamic axit 25,31 15,56
Phenyalanine 11,09 9,24
Lysine 11,28 5,75
Tyrosine 6,94 5,96

Bảng 3: Thành phần dinh dưỡng của mộc nhĩ (Nguồn: FAO, 1972)

Mẫu phân tích Độ ẩm (%) Protein thô (%) Chất béo (%) Cacbonhydrat (%) Tro (%) Năng lượng (Kcal)
Mộc nhĩ tươi 87,1 7,7 0,8 87,6 3,9 347
Mộc nhĩ khô 13,0 7,9 1,2 84,2 6,7 357

Bảng 4: Thành phần ligno - xenluloza và hóa học của mùn cưa

Chỉ tiêu / Nguồn vật liệu Xenluloza (%) Hemi-xenluloza (%) Lignin (%) Nguồn tài liệu
Thân gỗ cứng 40 - 55 24 - 40 18 - 25 Paraveen Kumar et al., 2009
Thân gỗ mềm 45 - 50 25 - 35 25 - 35 Paraveen Kumar et al., 2009
Mùn cưa (tổng thể) Xenluloza + Lignin: 71,2% Hydratcacbon tan: 24,0% Protein thô: 1,5%; Lipid: 1,1% Paul Stamets, J. Chilton

Chương I chỉ rõ trong phương pháp truyền thống tại Việt Nam, mùn cưa gỗ tạp phải ủ tự nhiên từ 5 tháng đến 1 năm mới đủ độ hoai mục để cấy giống mộc nhĩ; việc ứng dụng công nghệ vi sinh vật là giải pháp cần thiết nhằm rút ngắn thời gian ủ, điều chỉnh tỷ lệ C/N và nâng cao hiệu quả kinh tế.

Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả đầy đủ nguồn vật liệu nghiên cứu (30 mẫu phân lập đất, mùn cưa, rơm rạ mục tại Hà Nội và Ninh Bình; mùn cưa gỗ keo; rơm rạ mới thu hoạch; giống nấm mộc nhĩ Auricularia polytricha và nấm sò trắng Pleurotus florida). Danh mục thiết bị chuyên dụng gồm kính hiển vi điện tử quét Fe-SEM Hitachi S-4800, máy giải trình tự ABI Prism 3100-Avant, máy luân nhiệt PCR GeneAmp 9700, tủ sinh trưởng WTC Binder, máy so màu quang phổ 722 visible, nồi hấp vô trùng ALP CL-32 và hệ thống lên men chìm 50 lít. Chương này trình bày chi tiết công thức toán học tính mật độ CFU, quy trình sàng lọc hoạt tính CMC-ase bằng dung dịch Lugol, các phương pháp phân tích enzyme LiP, MnP, quy trình phân tích C/N, kỹ thuật tối ưu hóa RSM/ANOVA và sơ đồ bố trí thí nghiệm mô hình tại Ninh Bình.

Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương III trình bày kết quả thực nghiệm toàn diện của luận án qua các nội dung:

  1. Phân lập, tuyển chọn và định danh: Từ các mẫu thu thập, luận án phân lập được các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải xenluloza. Trong đó, chủng ký hiệu MC05 thể hiện hoạt tính CMC-ase vượt trội, đồng thời tổng hợp mạnh cả 3 enzyme xenlulaza, LiP và MnP. Kết quả phân tích đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường ISP, quan sát cấu trúc chuỗi bào tử trên Fe-SEM, kết hợp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA và phân tích phát sinh loài đã định danh chủng MC05 là Streptomyces thermocoprophilus MC05. Chủng này thuộc nhóm an toàn sinh học rủi ro cấp độ 1.
  2. Tối ưu hóa nhân sinh khối và sản xuất chế phẩm: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH môi trường, thời gian nuôi cấy, tỷ lệ tiếp giống và lưu lượng khí cấp đến sinh trưởng của Streptomyces thermocoprophilus MC05. Ứng dụng mô hình toán học bề mặt đáp ứng (RSM) và phân tích phương sai ANOVA, luận án xác định phương án tối ưu các thông số nuôi cấy và hoàn thiện quy trình nhân sinh khối trên thiết bị lên men chìm dung tích 50 lít. Chế phẩm sinh học tạo thành đạt mật độ bào tử và sinh khối cao, duy trì khả năng sống và hoạt tính enzyme ổn định trong chất mang.
  3. Ứng dụng chế phẩm ủ mùn cưa trồng mộc nhĩ: Thử nghiệm xác định các thông số kỹ thuật tối ưu của khối ủ mùn cưa: độ ẩm ban đầu đạt 60 - 65%, bổ sung dinh dưỡng khoáng gồm đạm urê, super lân Lâm Thao và rỉ đường cùng liều lượng chế phẩm vi sinh thích hợp. Quá trình ủ bổ sung chế phẩm vi sinh giúp đống ủ đạt đỉnh nhiệt độ cao nhanh chóng, đẩy nhanh tốc độ phân hủy hữu cơ, hạ tỷ lệ C/N về mức thích hợp cho nấm mộc nhĩ, giảm khối lượng mùn cưa và tăng hàm lượng đường khử. Khi nuôi trồng, mùn cưa xử lý bằng chế phẩm giúp hệ sợi mộc nhĩ phát triển nhanh, giảm rõ rệt tỷ lệ bịch thối hỏng, tăng tốc độ tăng trưởng đường kính tai nấm và đạt hiệu suất sinh học cao hơn đối chứng.
  4. Tái sử dụng bã thải trồng mộc nhĩ nuôi nấm sò: Bã thải sau thu hoạch mộc nhĩ được xử lý bằng chế phẩm xạ khuẩn MC05 giúp phân giải các độc tố và gốc sợi nấm mộc nhĩ còn sót lại, làm mềm cơ chất và cân đối lại tỷ lệ C/N. Kết quả thử nghiệm cho thấy hệ sợi nấm sò trắng (Pleurotus florida) lan nhanh, thời gian ăn kín bịch rút ngắn, tỷ lệ nhiễm hỏng thấp và năng suất nấm sò tươi đạt tương đương hoặc cao hơn so với các cơ chất rơm rạ truyền thống.
  5. Mô hình ứng dụng tại Ninh Bình: Luận án xây dựng 2 mô hình thực tế quy mô 1.000 bịch tại tỉnh Ninh Bình:
    • Mô hình trồng mộc nhĩ trên mùn cưa keo xử lý bằng chế phẩm vi sinh: Tỷ lệ bịch hỏng giảm mạnh, năng suất thu hoạch tăng và hiệu quả kinh tế tăng so với phương pháp ủ truyền thống.
    • Mô hình trồng nấm sò trên bã thải mộc nhĩ xử lý bằng chế phẩm: Tận dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm, giảm chi phí nguyên liệu đầu vào và mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người trồng nấm.

Kết quả và những đóng góp mới

Theo nội dung công bố của luận án, công trình đạt được những kết quả và đóng góp mới sau:

  1. Đóng góp về nguồn gen và đặc tính sinh học: Phân lập, tuyển chọn và định danh chính xác chủng xạ khuẩn ưa nhiệt Streptomyces thermocoprophilus MC05 thuộc nhóm an toàn sinh học rủi ro cấp độ 1. Chủng có khả năng tổng hợp đồng thời cả 3 enzyme phân giải ligno - xenluloza quan trọng gồm xenlulaza, lignin peroxidaza (LiP) và manganese peroxidaza (MnP).
  2. Đóng góp về mặt phương pháp và công nghệ tối ưu hóa: Xác định được hệ thống thông số kỹ thuật tối ưu cho quá trình nhân sinh khối chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 bằng kỹ thuật lên men chìm thông qua phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) và phân tích phương sai ANOVA. Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam áp dụng công cụ tối ưu hóa toán học RSM trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ xử lý cơ chất trồng nấm.
  3. Đóng góp về quy trình công nghệ: Xây dựng hoàn chỉnh quy trình sản xuất chế phẩm sinh học xạ khuẩn trên thiết bị lên men chìm dung tích 50 lít; đồng thời hoàn thiện 2 quy trình ứng dụng gồm: quy trình xử lý mùn cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ và quy trình tái xử lý bã thải mùn cưa làm cơ chất trồng nấm sò.
  4. Đóng góp về mặt thực tiễn và môi trường: Việc ứng dụng chế phẩm sinh học giúp rút ngắn thời gian ủ mùn cưa từ 5 - 12 tháng (theo phương pháp ủ truyền thống) xuống thời gian ngắn hơn nhiều, giảm tỷ lệ nhiễm bệnh thối hỏng bịch nấm, tăng năng suất mộc nhĩ và nấm sò, nâng cao tỷ suất lợi nhuận kinh tế cho các cơ sở sản xuất tại Ninh Bình; đồng thời giải quyết triệt để vấn đề ô nhiễm môi trường do bã thải mùn cưa gây ra.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất từ luận án:

  • Khuyến nghị phổ biến quy trình sử dụng chế phẩm Streptomyces thermocoprophilus MC05 vào các vùng chuyên canh sản xuất nấm ăn quy mô nông hộ và trang trại để nâng cao hiệu quả kinh tế.
  • Khuyến nghị áp dụng mô hình tuần hoàn khép kín: Mùn cưa gỗ keo -> Ủ chế phẩm vi sinh -> Nuôi trồng mộc nhĩ -> Bã thải sau thu hoạch -> Tái ủ chế phẩm vi sinh -> Nuôi trồng nấm sò -> Phân bón hữu cơ sinh học.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi nghiên cứu và dữ kiện được nêu trong văn bản luận án:

  • Hạn chế về đối tượng nguyên liệu và địa bàn: Thử nghiệm thực tế của luận án chủ yếu tập trung vào nguồn mùn cưa gỗ keo thu thập tại Hà Nội, Ninh Bình và thực nghiệm trên 2 đối tượng nấm ăn cụ thể là mộc nhĩ (Auricularia polytricha) và nấm sò trắng (Pleurotus florida). Hiệu quả xử lý trên các loại mùn cưa gỗ tạp khác có hàm lượng tinh dầu hoặc tanin cao chưa được khảo sát chi tiết.
  • Hạn chế về quy mô thiết bị: Kỹ thuật lên men chìm nhân sinh khối mới dừng lại ở quy mô pilot trên thiết bị 50 lít trong phòng thí nghiệm và xưởng thử nghiệm, chưa triển khai ở quy mô công nghiệp hàng nghìn lít.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Tiếp tục đánh giá khả năng phân giải của chế phẩm Streptomyces thermocoprophilus MC05 trên các nguồn phụ phẩm ligno - xenluloza đa dạng khác (mùn cưa cao su, thân lõi ngô, bã mía, vỏ trấu).
    • Mở rộng thử nghiệm tái sử dụng bã thải mùn cưa để trồng thêm các loài nấm ăn và nấm dược liệu khác (như nấm mỡ, nấm rơm, nấm linh chi).
    • Nâng quy mô thiết bị lên men chìm để sản xuất chế phẩm dạng thương mại phục vụ nhu cầu thị trường.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo khoa học có giá trị thực tiễn đối với nhiều nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học ứng dụng, Khoa học Cây trồng và Bảo vệ Môi trường Nông nghiệp: Cung cấp tài liệu tham khảo về phương pháp sàng lọc vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào, kỹ thuật sinh học phân tử định danh xạ khuẩn bằng gen 16S rRNA và phương pháp tối ưu hóa nuôi cấy bằng RSM/ANOVA.
  • Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Nguồn trích dẫn học thuật chi tiết về sinh lý dinh dưỡng nấm ăn, cấu trúc ligno - xenluloza và động học phân hủy sinh học trong các đống ủ hiếu khí.
  • Cán bộ kỹ thuật khuyến nông và các nhà quản lý nông nghiệp: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng các mô hình nông nghiệp tuần hoàn, tận dụng tối đa phụ phẩm lâm nghiệp và giải quyết vấn đề rác thải nông thôn theo định hướng phát triển sản phẩm quốc gia theo Quyết định số 439/QĐ-TTg.
  • Các cơ sở sản xuất và chủ trang trại nấm ăn: Cung cấp hướng dẫn kỹ thuật về tỷ lệ phối trộn dinh dưỡng (urê, lân Lâm Thao, rỉ đường), kiểm soát độ ẩm và nhiệt độ khối ủ mùn cưa, giải pháp tái sử dụng bã thải giúp tiết kiệm chi phí nguyên liệu và hạ tỷ lệ hư hỏng phôi nấm.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi sinh vật nào được tuyển chọn trong luận án và có những đặc tính gì nổi bật?

Chủng vi sinh vật được tuyển chọn là xạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05, phân lập từ các mẫu rác mục/mùn cưa tại Ninh Bình và Hà Nội. Chủng này thuộc nhóm an toàn sinh học rủi ro cấp độ 1, có khả năng ưa nhiệt và đồng thời sinh tổng hợp cả 3 loại enzyme: xenlulaza (thủy phân xenluloza), lignin peroxidaza (LiP) và manganese peroxidaza (MnP) (phân giải cấu trúc phenolic và phi phenolic của lignin).

2. Tỷ lệ C/N thích hợp cho mộc nhĩ và nấm sò được luận án xác định là bao nhiêu?

Theo tổng quan của luận án (dẫn theo Lê Duy Thắng và cộng sự, 2001; Sharma và cộng sự), tỷ lệ C/N thích hợp cho mộc nhĩ sinh trưởng là dưới 60/1, trong đó tối ưu nhất là 35/1. Đối với nấm sò, tỷ lệ C/N tối ưu nằm trong khoảng 20 - 30/1 và không vượt quá 50/1. Do mùn cưa gỗ tạp có C/N tự nhiên rất cao (thường trên 100/1), quá trình ủ cần phải bổ sung thêm nguồn đạm (như urê) và chế phẩm vi sinh để hạ tỷ lệ C/N về mức tối ưu.

3. Phương pháp định tính khả năng phân giải xenluloza của các chủng phân lập được tiến hành như thế nào?

Phương pháp định tính dựa trên nguyên tắc enzyme xenlulaza thủy phân carboxymethyl celluloza (CMC) trên đĩa thạch. Dịch enzyme sau ly tâm được nhỏ vào lỗ khoan (đường kính 10 mm) trên đĩa thạch chứa CMC, giữ lạnh 6 - 8 giờ để khuếch tán rồi ủ ở 37°C. Sau đó, đĩa thạch được phủ 5ml dung dịch Lugol (pha từ 2g KI và 1g I2 trong 300ml nước cất). Hoạt tính CMC-ase được tính bằng hiệu số giữa đường kính vòng phân giải màu vàng trên nền đen tím ($D$) và đường kính lỗ khoan ($d$).

4. Quá trình nhân sinh khối chủng xạ khuẩn MC05 được tối ưu hóa bằng công cụ nào và trên thiết bị dung tích bao nhiêu?

Quá trình nhân sinh khối được tối ưu hóa thông qua phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) kết hợp với phân tích phương sai ANOVA để xác định đồng thời các giá trị tối ưu của nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, tỷ lệ tiếp giống và lượng khí cấp. Thí nghiệm nhân sinh khối quy mô pilot được tiến hành trên thiết bị lên men chìm dung tích 50 lít.

5. Vì sao bã thải sau khi trồng mộc nhĩ không thể dùng ngay để trồng nấm sò mà phải qua xử lý vi sinh?

Mặc dù bã thải mùn cưa sau trồng mộc nhĩ vẫn còn hàm lượng xenluloza và hemixenluloza cao tương đương rơm rạ, nhưng trong bã thải còn tồn dư hệ sợi nấm và gốc nấm mộc nhĩ chưa phân hủy. Đây là tác nhân cạnh tranh sinh học và tiết chất ức chế sự phát triển của hệ sợi nấm sò. Việc bổ sung chế phẩm xạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 giúp phân hủy triệt để tàn dư sợi nấm mộc nhĩ, làm hoai mục cơ chất và cân bằng dinh dưỡng, tạo môi trường thuận lợi cho nấm sò sinh trưởng.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Ngô Xuân Chinh đã giải quyết trọn vẹn vấn đề công nghệ trong việc phân lập, tuyển chọn và định danh chủng xạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 có khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme phân giải ligno - xenluloza hoàn chỉnh. Bằng việc ứng dụng mô hình toán học bề mặt đáp ứng (RSM) trên thiết bị lên men chìm 50 lít, tác giả đã xây dựng thành công quy trình sản xuất chế phẩm sinh học đạt hiệu quả cao. Kết quả thực nghiệm và các mô hình ứng dụng tại tỉnh Ninh Bình đã chứng minh chế phẩm vi sinh giúp rút ngắn thời gian ủ mùn cưa keo, giảm tỷ lệ hư hỏng, nâng cao năng suất mộc nhĩ và mở ra giải pháp tái sử dụng nguồn bã thải để nuôi trồng nấm sò, đóng góp thiết thực cho phát triển nông nghiệp tuần hoàn và bảo vệ môi trường.