Đặt vấn đề Trong cuộc sống hằng ngày chúng ta thì vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều trong thực phẩm lên men hằng ngày như dưa muối, cà muối, lên men rượu, sữa chua, nem chua, pho mai, bia [3]. Nó có vai trò quan trọng trong đời sống như tăng cường miễn dịch, ức chế các vi sinh vật có hại, bổ sung các vi sinh vật có lợi, tác dụng kháng khuẩn. Và gần đây có nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein được tổng hợp ở riboxom từ các chuỗi peptit hoặc protein ở cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương [20].
Nó có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan làm suy yếu thành tế bào của vi khuẩn gây hại [29]. Vì vậy bacteriocin có rất nhiều ứng dụng, trong mỹ phẩm, xử lí môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi, trong y học và trong công nghệ thực phẩm [22]. Trong y dược, bacteriocin còn được ứng dụng như một chế phẩm sinh học để điều trị một số bệnh như viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đường tiêu hoá và còn sử dụng trong điều trị kháng sinh đồ[30].Trong ngành mỹ phẩm, bacteriocin được sử dụng trong thành phần của một số loại mỹ phẩm chăm sóc da vì có tính diệt khuẩn và giữ ẩm.Trong công nghệ thực phẩm, bacteriocin được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong chế biến và bảo quản một số loại thực phẩm như phomat, xúc xích, sữa chua, một số loại sản phẩm thịt, rau quả đóng hộp.[26] Ở Việt Nam hiện nay có nhiều nghiên cứu về sinh tổng hợp bacteriocin từ nem chua, sữa chua, dưa chua. Trong bài này tôi “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men”.
Mục đích của đề tài Đánh giá được khả năng kháng các vi khuẩn chỉ thị của vi khuẩn lactic phân lập từ đồ uống lên men Boza và xác định ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn. Mục tiêu của đề tài Khảo sát được khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Bacillus cereus) của các vi khuẩn lactic phân lập từ Boza. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện lên men tới quá trình tổng hợp bacteriocin: thời gian lên men, pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.
Ý nghĩa khoa học Xác định được khả năng kháng các vi khuẩn độc hại và ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng hình thành bacteriocin của vi khuẩn lactic từ Boza, làm cơ sở để có những nghiên cứu tiếp theo về chủng loại bacteriocin và ứng dụng trong thực tế. Đề tài giúp sinh viên có thêm kinh nghiệm, kiến thức bổ ích và tiếp cận với công tác nghiên cứu khoa học để phục vụ cho nghiên cứu và công tác sau này. Ý nghĩa thực tiễn Là cơ sở để nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn đã phân lập trong sản xuất bacteriocin ứng dụng trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm. Khẳng định vai trò có lợi của đồ uống lên men Boza đối với con người.
n 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, hình que hoặc hình cầu, có khả năng lên men đường thành acid lactic. Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng, màu trắng đục hoặc màu vàng kem hoặc đôi khi khuẩn lạc có kính thước to, tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc có thể tỏa ra mùi chua của acid.
Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriacae thuộc bộ Eubacteriales [2]. Chúng trao đổi chất và phần lớn sản phẩm cuối của quá trình lên men cacbonhydrat là axit lactic [1]. Theo Nguyễn Thành Đạt (2007) tất cả những vi sinh vật lactic đều có các đặc điểm sau: Đó là những vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh bào tử, có hoạt tính catalaza, oxydaza, nitratoreductaza âm tính. Tổng hợp nhiều hợp chất cần thiết cho sự sống nhưng rất yếu, cho nên chúng là những vi sinh vật đa khuyết dưỡng đối với nhiều axit amin, nhiều bazơ nucleic, nhiều vitamin… Không có khả năng tổng hợp nhân hem của các porphyrine, bình thường chúng không có cytochrome.
Chúng là những vi khuẩn kị khí tùy tiện, vi hiếu khí, là loại có khả năng lên men hiếu khí cũng như lên men kị khí. Có khả năng chống chịu tốt trong môi trường acid. Vi khuẩn lactic phân bố tương đối rộng trong tự nhiên, đặc biệt trong các sản phẩm lên men. Vi khuẩn lactic có thể tồn tại trong đất, trong nước, trên bề mặt thực vật, trong các sản phẩm lên men (sữa chua, format,…), các sản phẩm rau muối chua, trong đường tiêu hóa của người và động vật, trong các sản phẩm thịt.
Phân loại vi khuẩn lactic n 4 Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống khác nhau. Để phân loại người ta dựa vào nhiều tiêu chí khác nhau, căn cứ vào đặc điểm hình thái, phương thức lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng chịu muối, chịu axit hay chịu kiềm. Theo Orla-Jensen (1919) [2] Chia làm 4 loài chính: Lactobacillus. Ngày nay người ta mới bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những vi khuẩn Bifidobacterium (Kandler và Welss, 1986).
Phân loại theo hình dạng tế bào [2] Hình que: Lactobacillus, Carnobacterium. Hình cầu: Streptococcus, Leuconotoc, Pedicoccus. Ngoại lệ: Weissella (có cả hình cầu và que), Bifidobacterium. Phân chia vuông góc nhau trên một mặt phẳng tạo hình tứ cầu (Aerococcus, Tetragenococcus, Pediococcus).
Hình dạng và sự sắp xếp tế bào có thể thay đổi tùy thuộc vào thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy. Phân loại theo cách thức lên men [9] Lên men đồng hình (homofermentative): Khi lượng axit lactic tạo ra chủ yếu 85 – 90%. Vi khuẩn lên men lactic đồng hình có enzyme aldolaza nhưng không có enzyme phosphoketolaza. Nhóm vi khuẩn này gồm các cầu khuẩn Streptococcus lactic như là Streptococcus cremoris, các trực khuẩn Lactobacterium acidophilum, Lactobacterium helveticum, Lactobacterium bulgaricus.
n 5 Lên men dị hình (heterofermentative): Khi lượng axit lactic lên men chiếm tỉ lệ thấp khoảng 50%, các axit hữu cơ khác như axit acetic, axit formic… và CO2. Nhóm vi khuẩn lactic này không có enzyme aldolaza nhưng lại có enzyme phosphoketolaza. Ví dụ: Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, một số Lactobacillus. Phân loại dựa vào nhiệt độ Chia làm 3 loại [10,11]: Ưa lạnh: 0 – 27oC Ưa ấm: 5 – 45oC Ưa nhiệt: 20 – 60oC Ngoài ra còn có thể phân loại vi khuẩn lactic theo một số đặc điểm sau [5]: Khả năng chịu muối.
Khả năng sinh tổng hợp các đồng phân khác nhau của axit lactic. Phân loại dựa vào tỷ lệ phần trăm của các bazơ Guamin (G) + Cytosin (C) (%GC). Các loài thuộc giống Streptococcus có tỷ lệ %GC 34-46%, Leuconostoc 36-43%, Pediococuss 34-43%… [2]. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic 2.
Đặc điểm sinh lý Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc bộ Eubacteriales. Chúng không đồng nhất về mặt hình thái nhưng về sinh lý tương đối đồng nhất. Đều là vi khuẩn Gram dương (+), không tạo bào tử, hầu hết không di động, thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và sinh axit lactic. Axit lactic sinh ra dưới dạng D (-), L (+) hoặc DL [1,7].
Tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men bắt buộc, không chứa enzyme catalaza, cytochrome, hô hấp tùy tiện. Vi khuẩn lactic đòi hỏi nhu cầu cao về môi trường dinh dưỡng, ngoài đường, muối khoáng, nitơ, đa số chúng cần hàng loạt các loại vitamin n 6 (thiamin, biototin, axit folic, lactoflavin, axit pentotenic, axit nicotinic…) và các axit amin. Hình dạng và kích thước tế bào của vi khuẩn lactic thay đổi tùy từng loài, hình thái còn phụ thuộc vào điều kiện môi trường, thời gian lên men, sự có mặt của oxi và các tác nhân khác. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn lactic Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Cacbon là thành tố chính xây dựng nên cơ thể của mọi sinh vật.
Vì vậy sự chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật. Vi khuẩn lactic có thể sử dụng rất nhiều loại hydratcacbon khác nhau, chúng dễ dàng lên men các loại đường đơn (monosaccharide) như glucose, fructose, mantose, galactose. Với các loại đường đôi (disaccharide) như saccharose, mantose… thì được đồng hóa một cách chọn lọc hơn. Đối với các loại polysaccharide như dextrin, tinh bột… chỉ một số loài mới có khả năng đồng hóa.
Các loài vi khuẩn lactic khác nhau thì đỏi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Sự phát triển vi khuẩn lactic với mỗi loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau, vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước áp lực của các quá trình xử lý sau này. Chẳng hạn khả năng sống sót của L. burgaticus sau khi sấy đông khô cao hơn khi sử dụng đường fructose và lactose so với mannose.delbruceckii có thể sử dụng đường glucose, galactose, mantose, saccharose nhưng không sử dụng được lactose, rafinose [4,7].
Nhu cầu về dinh dưỡng nitơ Nitơ là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của mọi sinh vật. Những vật chất cơ bản của tế bào protein, axit nucleic… đều chứa nitơ vì vậy nitơ đóng vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng nitơ phức tạp. Phần lớn vi khuẩn lactic n 7 không thể tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ, do vậy chúng cần sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường chủ yếu là các nitơ hữu cơ như protein, peptid, peptone, axit amine [1].
Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như cao thịt, cao nấm mem, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone, dịch nấm men thủy phân, dịch chiết thịt. Đây là nguồn nitơ được sử dụng thường xuyên trong môi trường nuôi cấy [7]. Nhu cầu về dinh dưỡng vitamin Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống của tế bào. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin.
Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại [7].