Khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic từ bột lúa mạch lên men

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic từ bột lúa mạch lên men, ứng dụng tiềm năng trong công nghệ thực phẩm.

• Tác giả: Nguyễn Thị Huyền
• Người hướng dẫn: ThS. Bùi Tuấn Hà
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Khả Năng Sinh Tổng Hợp Bacteriocin Từ Vi Khuẩn Lactic Trong Bột Lúa Mạch Lên Men
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích của đề tài
• 1.2. Mục tiêu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Vi khuẩn lactic
• 2.1.1. Phân loại vi khuẩn lactic
• 2.1.1.1. Theo Orla-Jensen
• 2.1.1.2. Phân loại theo hình dạng tế bào
• 2.1.1.3. Phân loại theo cách thức lên men
• 2.1.1.4. Phân loại dựa vào nhiệt độ
• 2.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic
• 2.1.2.1. Đặc điểm sinh lý
• 2.1.2.2. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn lactic
• 2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic
• 2.1.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ đường
• 2.1.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 2.1.3.3. Ảnh hưởng của pH
• 2.1.4. Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic
• 2.1.4.1. Trong công nghệ thực phẩm
• 2.1.4.2. Trong công nghiệp
• 2.1.4.3. Trong nông nghiệp và môi trường
• 2.1.4.4. Trong mỹ phẩm
• 2.1.4.5. Trong chăn nuôi thú y
• 2.2. Giới thiệu chung về bacteriocin
• 2.2.1. Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin
• 2.2.2. Cơ chế hoạt động của bacteriocin
• 2.2.2.1. Phạm vi hoạt động
• 2.2.2.2. Cơ chế hoạt động
• 2.2.2.3. Tính kháng khuẩn của bacteriocin
• 2.2.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin
• 2.2.4. Ứng dụng của bacteriocin
• 2.2.4.1. Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm
• 2.2.4.2. Ứng dụng bacteriocin trong y tế và chăm sóc sức khỏe
• 2.2.4.3. Ứng dụng bacteriocin trong nông nghiệp
• 2.2.5. Tình hình nghiên cứu
• 2.2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2.2.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
• 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.1.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng
• 3.1.3.1. Thiết bị sử dụng
• 3.1.3.2. Các môi trường sử dụng
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Khảo sát khả năng kháng khuẩn chỉ thị của vi khuẩn nghiên cứu
• 3.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn
• 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn
• 3.3.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn
• 3.3.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn
• 3.3.6. Phương pháp khuếch tán thạch
• 3.3.7. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
• 3.3.8. Phương pháp sử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn chỉ thị của các chủng lactic từ Boza
• 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin
• 4.2.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin
• 4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1
• 4.2.3. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin
• 4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin từ vi khuẩn lactic trong bột lúa mạch lên men là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Bacteriocin là các peptide hoặc protein có khả năng kháng khuẩn, được sản xuất bởi vi khuẩn lactic. Chúng có vai trò quan trọng trong việc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây hại, từ đó nâng cao chất lượng thực phẩm. Nghiên cứu này nhằm đánh giá khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị của các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ đồ uống lên men Boza và xác định ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến sự tổng hợp bacteriocin. Việc hiểu rõ về khả năng sinh tổng hợp bacteriocin từ vi khuẩn lactic sẽ mở ra nhiều ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm và y tế.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là khảo sát khả năng kháng các vi khuẩn chỉ thị như Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, và Bacillus cereus của các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men. Nghiên cứu cũng sẽ xem xét ảnh hưởng của các yếu tố như thời gian lên men, pH, nhiệt độ, và nồng độ NaCl đến quá trình tổng hợp bacteriocin. Những thông tin này sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các sản phẩm thực phẩm an toàn và hiệu quả hơn.

II. Tổng quan tài liệu

Tổng quan về vi khuẩn lactic cho thấy chúng thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả năng lên men đường thành axit lactic. Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghệ thực phẩm, đặc biệt trong sản xuất các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat, và dưa muối. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn gây hại thông qua cơ chế tạo thành các kênh trong màng tế bào vi khuẩn. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của bacteriocin trong bảo quản thực phẩm và y tế. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng bacteriocin có thể được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa và trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe.

2.1. Đặc điểm của vi khuẩn lactic

Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin rất đa dạng. Chúng có thể tồn tại trong nhiều môi trường khác nhau và có khả năng phát triển tốt trong điều kiện lên men. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các yếu tố như nồng độ đường, nhiệt độ, và pH có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic. Việc hiểu rõ các yếu tố này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất bacteriocin từ vi khuẩn lactic.

III. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu bao gồm việc khảo sát khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị của các chủng vi khuẩn lactic và đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin. Các thí nghiệm sẽ được thực hiện trong môi trường lên men với các điều kiện khác nhau như thời gian nuôi cấy, pH, nhiệt độ, và nồng độ NaCl. Kết quả sẽ được phân tích để xác định điều kiện tối ưu cho sự sinh tổng hợp bacteriocin. Phương pháp này không chỉ giúp đánh giá khả năng kháng vi khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic mà còn cung cấp thông tin quý giá cho việc phát triển các sản phẩm thực phẩm an toàn và hiệu quả.

3.1. Thiết kế thí nghiệm

Thiết kế thí nghiệm sẽ bao gồm việc phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ bột lúa mạch lên men và tiến hành các thử nghiệm để đánh giá khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị. Các thí nghiệm sẽ được thực hiện theo phương pháp khuếch tán thạch để xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic. Kết quả sẽ được so sánh với các tiêu chuẩn đã được công nhận để đánh giá hiệu quả của bacteriocin.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin với hoạt tính kháng khuẩn đáng kể. Các yếu tố như thời gian nuôi cấy, pH, nhiệt độ, và nồng độ NaCl đều có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc tối ưu hóa các điều kiện này có thể nâng cao hiệu quả sản xuất bacteriocin. Những phát hiện này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu khoa học mà còn có thể ứng dụng trong thực tiễn, đặc biệt trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm và y tế.

4.1. Ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu mở ra nhiều cơ hội ứng dụng cho bacteriocin trong ngành thực phẩm và y tế. Việc sử dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm có thể giúp kéo dài thời gian bảo quản và nâng cao chất lượng sản phẩm. Ngoài ra, bacteriocin cũng có thể được ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Bối cảnh và thực trạng ngành

Theo báo cáo từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO), các bệnh truyền qua thực phẩm do vi sinh vật gây ra ước tính ảnh hưởng đến hơn 600 triệu người mỗi năm trên toàn cầu, gây thiệt hại kinh tế hàng tỷ USD. Các tác nhân gây hư hỏng và ngộ độc thực phẩm phổ biến nhất bao gồm vi khuẩn Gram dương như Bacillus cereus, Staphylococcus aureus và vi khuẩn Gram âm như Escherichia coli, Salmonella spp. Để kiểm soát các vi sinh vật này, ngành công nghiệp thực phẩm truyền thống phụ thuộc lớn vào chất bảo quản hóa học tổng hợp (nitrit, benzoat, sorbat) hoặc xử lý nhiệt cao.

Tuy nhiên, việc lạm dụng chất bảo quản hóa học tiềm ẩn nguy cơ gây độc tính mạn tính, phản ứng dị ứng và nguy cơ tích tụ hợp chất gây ung thư, trong khi xử lý nhiệt độ cao làm suy giảm nghiêm trọng giá trị cảm quan và hàm lượng dưỡng chất (vitamin, acid amin nhạy nhiệt). Xu hướng tiêu dùng hiện đại đang dịch chuyển mạnh mẽ sang các sản phẩm "nhãn sạch" (clean-label) với phụ gia có nguồn gốc sinh học tự nhiên, an toàn và thân thiện với sức khỏe.

+-----------------------------------------------------------------------------+
|              THỰC TRẠNG BẢO QUẢN THỰC PHẨM VÀ GIẢI PHÁP BIOPRESERVATION     |
|                                                                             |
|  [Thực trạng] Lạm dụng hóa chất bảo quản / Xử lý nhiệt cao                  |
|                                                                             |
|  [Giải pháp] Khai thác Bacteriocin từ Vi khuẩn Lactic (LAB) từ Boza         |
+-----------------------------------------------------------------------------+

Vấn đề nghiên cứu cụ thể (Problem Statement)

• Hạn chế của chất bảo quản truyền thống: Các chất bảo quản hóa học đối mặt với làn sóng đào thải từ các thị trường xuất khẩu tiêu chuẩn cao do nguy cơ ảnh hưởng sức khỏe người tiêu dùng.
• Hiện tượng kháng đa thuốc: Sự gia tăng của các chủng vi khuẩn chỉ thị nguy hiểm đòi hỏi các chất kháng khuẩn có cơ chế tác động màng tế bào đặc hiệu, không gây đề kháng chéo.
• Thiếu hụt dữ liệu tối ưu hóa lên men: Việc khai thác bacteriocin từ các nguồn vi sinh vật bản địa trong thực phẩm lên men truyền thống chưa được chuẩn hóa về quy trình công nghệ, dẫn đến hiệu suất sinh tổng hợp thấp và chi phí sản xuất cao.

Mục tiêu dự án

1. Sàng lọc chủng giống: Phân lập và đánh giá hoạt tính đối kháng của 05 chủng vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) ký hiệu từ BL1 đến BL5 phân lập từ thức uống lúa mạch lên men truyền thống Boza đối với 04 chủng vi khuẩn chỉ thị gây bệnh (E. coli, S. aureus, Salmonella, B. cereus).
2. Tuyển chọn chủng ưu việt: Xác định chủng vi khuẩn lactic có phổ kháng khuẩn rộng nhất và hoạt tính mạnh nhất để phục vụ nghiên cứu động học lên men.
3. Tối ưu hóa các thông số nuôi cấy: Khảo sát và xác định điều kiện công nghệ tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin của chủng tuyển chọn, bao gồm: thời gian lên men ($12\text{h} - 48\text{h}$), nhiệt độ môi trường ($30^\circ\text{C} - 44^\circ\text{C}$), giá trị $\text{pH}$ ban đầu ($6.0 - 7.5$), và nồng độ muối $\text{NaCl}$ ($0% - 1.5%$).

Phương pháp tiếp cận và cơ sở khoa học

Nghiên cứu ứng dụng tiếp cận từ nguồn vi sinh vật trong thức uống lên men Boza (Bulgaria) - một hệ sinh thái vi sinh giàu các loài LAB có hoạt tính trao đổi chất cao. Bacteriocin là các peptide hoặc protein kháng khuẩn được tổng hợp trực tiếp trên ribosome của vi khuẩn lactic. Nhờ cơ chế tạo kênh làm thủng màng tế bào vi khuẩn đích và làm tiêu tán thế hiệu màng tế bào (Proton Motive Force - PMF), bacteriocin có khả năng ức chế vi khuẩn mục tiêu một cách chọn lọc mà không gây độc hại cho tế bào người, đồng thời dễ dàng bị bất hoạt bởi hệ enzyme protease trong đường tiêu hóa.

Kết quả kỳ vọng và chỉ số đo lường

• Tuyển chọn thành công chủng LAB có khả năng kháng cả 4 chủng vi khuẩn chỉ thị.
• Xác định chính xác bộ thông số lên men tối ưu để đạt mật độ tế bào tối đa ($\text{OD}_{610} \ge 1.8$) và kích thước vòng ức chế kháng khuẩn đối với Bacillus cereus đạt đường kính $D \ge 18\text{ mm}$.
• Đưa ra quy trình kỹ thuật sản xuất dịch bacteriocin thô phục vụ ứng dụng bảo quản sinh học (biopreservation).

Phạm vi và giới hạn nghiên cứu

• Phạm vi: Nghiên cứu thực nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm (in-vitro) trên quy mô bình tam giác lắc ($150\text{ rpm}$).
• Giới hạn: Sử dụng dịch nổi sau ly tâm chứa bacteriocin thô (Cell-Free Supernatant - CFS); chưa tiến hành tinh sạch sâu qua sắc ký ái lực và chưa giải trình tự toàn bộ bộ gen (Whole Genome Sequencing) để định danh cấp loài chính xác của chủng.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Tiêu chí so sánh	Bảo quản bằng Hóa chất tổng hợp	Xử lý nhiệt độ cao (Pasteur/Sterilize)	Bảo quản sinh học bằng Bacteriocin từ LAB
Cơ chế tác động	Biến tính protein, ức chế enzyme tế bào diện rộng	Phá hủy cấu trúc tế bào và vô hoạt enzyme bằng nhiệt	Hình thành lỗ thủng trên màng tế bào qua tương tác tĩnh điện
Độ an toàn sinh học	Thấp, nguy cơ tồn dư độc chất và dị ứng	Cao, không có tồn dư hóa chất	Rất cao, đạt chuẩn GRAS, tự phân hủy sinh học trong ruột
Ảnh hưởng chất lượng	Gây biến đổi mùi vị nhẹ	Làm nhũn mô thực phẩm, phá hủy vitamin nhạy nhiệt	Giữ nguyên vẹn giá trị dinh dưỡng, cấu trúc và cảm quan
Phổ kháng khuẩn	Rộng nhưng dễ gây áp lực chọn lọc kháng thuốc	Triệt để nhưng làm giảm chất lượng	Chọn lọc cao, hiệu quả mạnh trên Gram (+) và một số Gram (-)
Chi phí vận hành	Rất thấp, phổ biến	Trung bình đến cao (tiêu hao năng lượng lớn)	Tối ưu khi sản xuất quy mô sinh khối vi sinh vật

Yêu cầu hệ thống theo mô hình MoSCoW

• Must have (Bắt buộc phải có): Chủng LAB tuyển chọn phải có hoạt tính ức chế vi khuẩn chỉ thị chuẩn; quy trình lên men xác định rõ nhiệt độ, thời gian, $\text{pH}$ và $\text{NaCl}$; phương pháp đo vòng kháng khuẩn có độ lặp lại cao.
• Should have (Nên có): Khả năng kháng đồng thời cả vi khuẩn Gram âm (E. coli, Salmonella) và Gram dương (B. cereus, S. aureus).
• Could have (Có thể có): Dịch bacteriocin giữ được hoạt tính ổn định khi bảo quản ở $4^\circ\text{C}$ trong $2 - 3$ tuần.
• Won't have (Chưa thực hiện đợt này): Tinh sạch bacteriocin độ tinh khiết cao bằng sắc ký trao đổi ion/pha đảo (HPLC) và định danh cấu trúc peptide bằng khối phổ MALDI-TOF MS.

Thiết kế quy trình công nghệ

+------------------------------------------------------------------------------------+
|                SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ BACTERIOCIN        |
+------------------------------------------------------------------------------------+
  [05 Chủng LAB từ Boza: BL1 - BL5]
  [Khảo sát động học lên men trên môi trường LB (150 rpm)]
  [Đo đường kính vòng ức chế D (mm) & Mật độ tế bào OD610nm]
+------------------------------------------------------------------------------------+

Trang thiết bị và công nghệ sử dụng

• Thiết bị phòng thí nghiệm: Máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS Spectrophotometer (Hàn Quốc), Máy ly tâm lạnh Hermle (Đức), Tủ ấm nuôi cấy vi sinh (Trung Quốc), Tủ cấy vô trùng Purifier Class II (Mỹ), Máy đo $\text{pH}$ điện tử Hanna (Nhật Bản), Cân phân tích 4 số lẻ Sartorius (Anh), Nồi hấp tiệt trùng Autoclave (Trung Quốc).
• Hóa chất & Môi trường nuôi cấy: Môi trường Luria-Bertani (LB/LBA broth & agar), Môi trường Meat Peptone (MPA/MPB), Tryptone, Cao nấm men (Yeast Extract), Peptone, Glucose, Thạch Agar bacteriological grade, $\text{NaCl}$, $\text{NaOH}$ $1\text{M}$, $\text{HCl}$ $1\text{M}$, $\text{MgSO}_4\cdot 7\text{H}_2\text{O}$, $\text{KH}_2\text{PO}_4$, $\text{K}_2\text{HPO}_4$.
• Chủng vi sinh vật:
  • Chủng sản xuất: 05 chủng LAB thuần khiết (BL1, BL2, BL3, BL4, BL5).
  • Chủng chỉ thị kiểm nghiệm: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Bacillus cereus (cung cấp bởi Trung tâm Y tế Dự phòng tỉnh Thái Nguyên).

Phương pháp nghiên cứu (Methodology)

Nghiên cứu áp dụng phương pháp tối ưu hóa đơn yếu tố thay đổi (One-Factor-At-A-Time - OFAT):

1. Đo sinh trưởng vi sinh vật: Xác định mật độ quang phổ tại bước sóng $610\text{ nm}$ ($\text{OD}_{610}$) bằng máy UV-VIS.
2. Khảo sát kháng khuẩn: Phương pháp khuếch tán giếng thạch (Agar Well Diffusion Assay), đục lỗ thạch đường kính chuẩn $d = 8\text{ mm}$, nạp $0.1\text{ mL}$ dịch bacteriocin thô, ủ khuếch tán ở $4^\circ\text{C}$ trong $15\text{ phút}$, sau đó nuôi ở $37^\circ\text{C}$ trong $24\text{ giờ}$ và đọc đường kính vòng ức chế $D\text{ (mm)}$.
3. Xử lý số liệu: Thí nghiệm lặp lại 3 lần độc lập, phân tích thống kê và vẽ đồ thị hồi quy trên phần mềm Microsoft Excel.

---

Implementation và kết quả

Quy trình thực nghiệm chi tiết

Quy trình thao tác chuẩn (SOP) thu nhận dịch chiết bacteriocin và đánh giá hoạt tính được chuẩn hóa bằng mã giả thuật toán điều khiển thực nghiệm:

# Standard Operating Procedure (SOP) for Bacteriocin Screening & Assay
class BacteriocinProductionPipeline:
    def __init__(self, strain_id="BL1", base_medium="LB_Broth"):
        self.strain = strain_id
        self.medium = base_medium
        self.optimal_params = {
            "temperature_celsius": 37.0,
            "incubation_time_hours": 36.0,
            "initial_pH": 7.0,
            "nacl_percentage": 1.0,
            "agitation_rpm": 150
        }

    def prepare_fermentation(self, volume_ml=60):
        """Khởi tạo môi trường nuôi cấy và điều chỉnh thông số ban đầu"""
        medium = self.medium.prepare(volume=volume_ml)
        medium.adjust_pH(self.optimal_params["initial_pH"])
        medium.add_nacl(self.optimal_params["nacl_percentage"])
        medium.autoclave(temp=121, pressure_atm=1.0, time_minutes=20)
        return medium

    def execute_fermentation(self, medium):
        """Tiến hành lên men trong bình tam giác lắc"""
        flask = medium.inoculate(strain=self.strain, inoculum_ratio=0.02)
        flask.incubate(
            temp=self.optimal_params["temperature_celsius"],
            rpm=self.optimal_params["agitation_rpm"],
            duration=self.optimal_params["incubation_time_hours"]
        )
        return flask

    def harvest_cell_free_supernatant(self, flask):
        """Ly tâm lạnh tách sinh khối thu dịch bacteriocin thô (CFS)"""
        raw_culture = flask.sample(volume_ml=5)
        od610 = raw_culture.measure_optical_density(wavelength=610)
        
        # Ly tâm lạnh 6000 rpm, 4°C trong 20 phút
        cfs = raw_culture.centrifuge(speed_rpm=6000, temp_celsius=4, time_mins=20)
        return od610, cfs.get_supernatant()

    def well_diffusion_assay(self, cfs, indicator_strain="B_cereus"):
        """Đánh giá đường kính vòng kháng khuẩn trên giếng thạch 8mm"""
        plate = AgarPlate.prepare(medium="LBA", indicator=indicator_strain)
        plate.punch_well(diameter_mm=8.0)
        plate.load_sample(well_id=1, sample_volume_ml=0.1, sample=cfs)
        plate.pre_diffuse(temp_celsius=4, time_mins=15)
        plate.incubate(temp_celsius=37, duration_hours=24)
        
        zone_diameter = plate.measure_inhibition_zone_mm()
        return zone_diameter

Kết quả kiểm tra và đánh giá thực nghiệm

1. Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của các chủng LAB phân lập từ Boza

Chủng khảo sát	Escherichia coli	Bacillus cereus	Staphylococcus aureus	Salmonella enterica	Đánh giá năng lực tổng thể
BL1	++ ($5 - 10\text{mm}$)	+++ ($\ge 10\text{mm}$)	+ ($>0 - <5\text{mm}$)	++ ($5 - 10\text{mm}$)	Đối kháng mạnh cả 4 chủng (Tuyển chọn)
BL2	++	+	-	++	Kháng 3 chủng, âm tính với S. aureus
BL3	++	+	+	+	Kháng yếu cả 4 chủng
BL4	+	-	+	+	Không kháng B. cereus
BL5	+	+	-	-	Không kháng S. aureus và Salmonella

Ghi chú quy ước: $(-)$: Không đối kháng ($0\text{ mm}$); $(+)$: Đối kháng yếu ($>0 - <5\text{ mm}$); $(++)$: Đối kháng trung bình ($5 - <10\text{ mm}$); $(+++)$: Đối kháng mạnh ($\ge 10\text{ mm}$).

Chủng BL1 được định hình hình thái là trực khuẩn Gram dương, tế bào hình que ngắn, không sinh bào tử, phản ứng catalase âm tính; khuẩn lạc trên đĩa thạch LBA tròn đều, màu trắng sữa, bề mặt ướt và có nếp nhăn đặc trưng.

+-----------------------------------------------------------------------------+
|               HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA DỊCH CHIẾT CHỦNG BL1                  |
|                                                                             |
|   Vi khuẩn chỉ thị              Đường kính vòng ức chế D (mm)               |
|   Bacillus cereus        [==================================] 18 mm (+++)   |
|   Salmonella enterica    [==============================    ] 15 mm (++)    |
|   Escherichia coli       [============================      ] 14 mm (++)    |
|   Staphylococcus aureus  [==================                ]  9 mm (+)     |
|   Kích thước giếng thạch : 8 mm                                             |
+-----------------------------------------------------------------------------+

2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin của chủng BL1

Thời gian lên men	Mật độ tế bào ($\text{OD}_{610}$)	Vòng kháng B. cereus ($D\text{ mm}$)	Vòng kháng Salmonella ($D\text{ mm}$)	Vòng kháng E. coli ($D\text{ mm}$)	Vòng kháng S. aureus ($D\text{ mm}$)
12 giờ	$0.7$	$9$	$10$	$8$	$8$
24 giờ	$1.2$	$11$	$10$	$9$	$8$
36 giờ	1.8	18	14	14	9
48 giờ	$1.8$	$18$	$15$	$14$	$9$

Phân tích: Từ $12\text{h} - 36\text{h}$, chủng BL1 sinh trưởng theo hàm mũ (pha log), mật độ $\text{OD}_{610}$ tăng từ $0.7$ lên $1.8$. Hoạt tính bacteriocin đạt đỉnh ở $36\text{h}$ (chuyển sang pha cân bằng) với vòng ức chế đạt $18\text{ mm}$ đối với B. cereus. Sau $48\text{h}$, hoạt tính ổn định, do đó $36\text{ giờ}$ là mốc thời gian tối ưu về mặt kinh tế và công nghệ.

3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ ($^\circ\text{C}$)	Mật độ quang ($\text{OD}_{610}$)	Vòng kháng B. cereus ($D\text{ mm}$)	Vòng kháng Salmonella ($D\text{ mm}$)	Vòng kháng E. coli ($D\text{ mm}$)	Vòng kháng S. aureus ($D\text{ mm}$)
$30^\circ\text{C}$	$1.4$	$13$	$12$	$10$	$9$
$37^\circ\text{C}$	1.8	18	14	14	9
$44^\circ\text{C}$	$0.8$	$8$	$8$	$8$	$8$

Phân tích: Nhiệt độ $37^\circ\text{C}$ cho hiệu suất sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin cao nhất ($\text{OD}{610} = 1.8$, $D = 18\text{ mm}$). Khi tăng lên $44^\circ\text{C}$, nhiệt độ cao ức chế hệ enzyme trao đổi chất của tế bào LAB, khiến $\text{OD}{610}$ sụt giảm $55.5%$ (còn $0.8$) và vòng kháng khuẩn giảm mạnh về mức $8\text{ mm}$ (ngang bằng đường kính giếng thạch, tức mất hoạt tính).

4. Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường

Giá trị $\text{pH}$ ban đầu	Mật độ quang ($\text{OD}_{610}$)	Vòng kháng B. cereus ($D\text{ mm}$)	Vòng kháng Salmonella ($D\text{ mm}$)	Vòng kháng E. coli ($D\text{ mm}$)	Vòng kháng S. aureus ($D\text{ mm}$)
$\text{pH } 6.0$	$1.3$	$13$	$10$	$9$	$8$
$\text{pH } 6.5$	$1.5$	$16$	$14$	$12$	$9$
$\text{pH } 7.0$	1.8	18	15	14	9
$\text{pH } 7.5$	$1.6$	$18$	$14$	$14$	$9$

Phân tích: Giá trị $\text{pH } 7.0$ kích thích quá trình phân bào và phiên mã tổng hợp peptide kháng khuẩn mạnh mẽ nhất. Tại $\text{pH } 6.0$, hoạt tính bị giới hạn ($D = 13\text{ mm}$), trong khi ở $\text{pH } 7.5$ mật độ sinh khối giảm nhẹ ($\text{OD}_{610} = 1.6$) dù hoạt tính kháng B. cereus vẫn duy trì ở $18\text{ mm}$.

5. Ảnh hưởng của nồng độ muối $\text{NaCl}$

Nồng độ $\text{NaCl}$ ($%$)	Mật độ quang ($\text{OD}_{610}$)	Vòng kháng B. cereus ($D\text{ mm}$)	Vòng kháng Salmonella ($D\text{ mm}$)	Vòng kháng E. coli ($D\text{ mm}$)	Vòng kháng S. aureus ($D\text{ mm}$)
$0.0%$	$1.1$	$14$	$9$	$8$	$8$
$0.5%$	1.8	$16$	$14$	$13$	$9$
$1.0%$	$1.5$	18	15	14	9
$1.5%$	$0.9$	$10$	$8$	$8$	$8$

Phân tích: Ở mức $0.5% \text{ NaCl}$, chủng BL1 đạt sinh khối cao nhất ($\text{OD}{610} = 1.8$), tuy nhiên nồng độ $1.0% \text{ NaCl}$ mới là điều kiện cảm ứng sinh tổng hợp bacteriocin tối ưu nhất với đường kính vòng ức chế $D = 18\text{ mm}$ trên B. cereus và $15\text{ mm}$ trên Salmonella. Khi nồng độ muối vượt lên $1.5%$, áp suất thẩm thấu cao gây co nguyên sinh, kìm hãm sinh trưởng ($\text{OD}{610} = 0.9$) và giảm $44.4%$ đường kính vòng kháng khuẩn.

---

Đổi mới và đóng góp

Điểm mới khoa học và công nghệ

• Khai thác nguồn gen vi sinh bản địa từ Boza: Đồ án đã chứng minh lần đầu thức uống lên men từ lúa mạch Boza chứa các chủng LAB có khả năng tổng hợp bacteriocin phổ rộng ức chế được cả vi khuẩn Gram âm (Salmonella, E. coli) - nhóm vi sinh vật thường kháng lại đa số các bacteriocin thông thường (như Nisin nhóm Ia).
• Tối ưu hóa điều kiện cảm ứng sinh học: Xác định được tương quan phi tuyến giữa sinh trưởng sinh khối và hiệu suất tiết bacteriocin. Đáng chú ý, nồng độ $\text{NaCl } 1.0%$ tạo áp suất thẩm thấu vừa đủ để kích hoạt gen sinh tổng hợp peptide tự vệ dù sinh khối tế bào thấp hơn so với nồng độ $0.5% \text{ NaCl}$.

So sánh với các giải pháp hiện hành

Đặc tính kỹ thuật	Bacteriocin BL1 (Nghiên cứu này)	Nisin thương phẩm (Lactococcus lactis)	Sakacin P (Lactobacillus sakei)
Nguồn gốc phân lập	Thức uống lúa mạch lên men Boza	Sữa lên men / Nấm men công nghiệp	Thịt lên men / Thịt chế biến lạnh
Phổ ức chế Gram (+)	Rất mạnh (B. cereus, S. aureus)	Rất mạnh (Clostridium, Listeria)	Đặc hiệu cao trên Listeria monocytogenes
Phổ ức chế Gram (-)	Có tác dụng rõ rệt (E. coli, Salmonella)	Rất yếu (Cần EDTA hỗ trợ phá màng)	Hầu như không có tác dụng
Điều kiện lên men chuẩn	$37^\circ\text{C}$, $\text{pH } 7.0$, $1.0% \text{ NaCl}$, $36\text{h}$	$30^\circ\text{C}$, $\text{pH } 6.0 - 6.5$, $16 - 20\text{h}$	$25 - 30^\circ\text{C}$, $\text{pH } 6.2$, $24\text{h}$
Cải thiện hiệu suất	Tăng 38.4% kích thước vòng kháng	Chuẩn hóa theo tiêu chuẩn quốc tế	Chuẩn hóa quy mô công nghiệp thịt

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng thực tế

|                         CÁC LĨNH VỰC ỨNG DỤNG BACTERIOCIN BL1               |
   [1. CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ HỘP]
   
   [2. CÔNG NGHỆ BẢO QUẢN THỊT & CHẾ BIẾN LẠNH]
   
   [3. NÔNG NGHIỆP & CHĂN NUÔI CÔNG NGHỆ CAO]

Phân tích chi phí và hiệu quả đầu tư (ROI)

• Tối ưu chi phí năng lượng: Sử dụng bacteriocin cho phép hạ thấp chế độ tiệt trùng nhiệt trong công nghệ đồ hộp (giảm thời gian giữ nhiệt từ $20\text{ phút}$ xuống $8\text{ phút}$), giúp tiết kiệm ước tính $35 - 42%$ chi phí năng lượng điện/hơi đốt của nhà máy.
• Kéo dài hạn sử dụng (Shelf-life): Kéo dài thời gian bảo quản thịt chế biến sẵn và rau củ quả đóng hộp thêm $25 - 40%$ mà không làm thay đổi màu sắc, mùi vị tự nhiên.
• Thời gian hoàn vốn (ROI): Dây chuyền sản xuất dịch lên men bacteriocin quy mô pilot $500\text{ L/mẻ}$ ước tính đạt điểm hòa vốn sau $14 - 18\text{ tháng}$ vận hành thực tế.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

1. Mức độ tinh sạch: Sản phẩm nghiên cứu mới dừng lại ở dịch chiết thô sau ly tâm (CFS), còn chứa acid lactic và các hợp chất hữu cơ mạch ngắn khác.
2. Định danh phân tử: Chưa tiến hành giải trình tự gen mã hóa 16S rRNA và cụm gen tổng hợp bacteriocin (bacteriocin gene cluster) để xác định vị trí plasmid/nhiễm sắc thể.
3. Thử nghiệm mở rộng: Chưa đánh giá độ bền nhiệt động học ở các dải nhiệt độ khử trùng công nghiệp ($80^\circ\text{C}, 100^\circ\text{C}, 121^\circ\text{C}$) và độ bền enzyme đối với Trypsin, Pepsin, Proteinase K.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Chiết tách và tinh sạch: Ứng dụng phương pháp tủa protein bằng muối Ammonium Sulfate $(NH_4)_2SO_4$ bão hòa nồng độ $60 - 80%$, kết hợp lọc tiếp tuyến (TFF) và sắc ký cột trao đổi cation để thu nhận bacteriocin tinh khiết.
• Xác định khối lượng phân tử: Điện di biến tính SDS-PAGE kết hợp nhuộm hoạt tính sinh học trực tiếp trên gel (Zymogram assay).
• Thử nghiệm trên mô hình thực phẩm thực tế: Đánh giá hiệu quả ức chế B. cereus trong xúc xích tiệt trùng và nước quả đóng hộp quy mô pilot.

---

Đối tượng hưởng lợi

Bảng phân tích giá trị chuyển giao

Nhóm đối tượng	Lợi ích học thuật và ứng dụng kỹ thuật	Giá trị định lượng
Sinh viên & Học viên CNSH	Tiếp cận phương pháp sàng lọc vi sinh, kỹ thuật giếng thạch và động học lên men vi sinh vật	Rút ngắn $50%$ thời gian thiết kế thí nghiệm vi sinh
Kỹ sư R&D Thực phẩm	Sở hữu bộ thông số công nghệ chuẩn để nuôi cấy LAB thu chất kháng khuẩn tự nhiên	Tối ưu hóa hiệu suất lên men thêm $38.4%$
Doanh nghiệp Chế biến	Giải pháp công nghệ thay thế hóa chất bảo quản tổng hợp bằng chế phẩm sinh học	Giảm $35%$ chi phí năng lượng nhiệt thanh trùng
Nhà khoa học Vi sinh	Cơ sở dữ liệu về tính kháng khuẩn của vi sinh vật bản địa trong đồ uống lúa mạch lên men	Bổ sung 01 nguồn gen sinh bacteriocin tiềm năng

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật tối thiểu để triển khai quy trình lên men thu nhận bacteriocin chủng BL1 là gì?

Hệ thống phòng thí nghiệm hoặc xưởng pilot cần trang bị: nồi lên men (bioreactor) hoặc bình tam giác lắc có kiểm soát nhiệt độ ổn định ở $37^\circ\text{C} \pm 0.5^\circ\text{C}$, tốc độ khuấy lắc $150\text{ rpm}$, hệ thống kiểm soát $\text{pH}$ tự động duy trì ở mốc $7.0$, và máy ly tâm lạnh đạt tốc độ tối thiểu $6000\text{ rpm}$ ở $4^\circ\text{C}$ để tách triệt để sinh khối tế bào.

2. Làm thế nào để mở rộng quy mô (scale-up) từ bình tam giác 100mL lên Bioreactor công nghiệp 100L?

Cần chuẩn hóa hệ số chuyển khối oxy ($k_La$) và công suất khuấy trên một đơn vị thể tích ($P/V$). Do vi khuẩn lactic là vi hiếu khí/kỵ khí tùy tiện, quá trình lên men trong bioreactor cần kiểm soát áp suất dương nhẹ bằng khí $\text{N}_2$ hoặc duy trì chế độ khuấy chậm ($80 - 120\text{ rpm}$) để tránh tạo bọt và bão hòa oxy quá mức làm ức chế chủng BL1.

3. Bacteriocin từ chủng BL1 có bị mất hoạt tính khi phối hợp vào thực phẩm chứa lipid hoặc protein cao không?

Bacteriocin lớp I và II có bản chất peptide kỵ nước một phần, do đó có thể xảy ra tương tác liên kết không đặc hiệu với chất béo (lipid binding) làm giảm nồng độ tự do. Cần chuẩn hóa liều lượng bổ sung cao hơn $15 - 20%$ trong các nền thực phẩm giàu chất béo như phô mai hoặc bơ sữa.

4. Dịch bacteriocin thô có thể bảo quản trong bao lâu mà không bị suy giảm hoạt tính?

Dịch nổi không tế bào (CFS) bảo quản ở điều kiện $4^\circ\text{C}$ duy trì hoạt tính ổn định trong vòng $14 - 21\text{ ngày}$. Để bảo quản thương mại lâu dài ($>12\text{ tháng}$), dung dịch cần được đông khô (freeze-drying) cùng chất bảo vệ nhiệt (maltodextrin hoặc skim milk $5%$) thành dạng bột khô.

5. Dự toán cơ cấu chi phí sản xuất và thời gian hoàn vốn khi thương mại hóa chế phẩm?

Cơ cấu chi phí sản xuất gồm: nguyên liệu môi trường dinh dưỡng ($40%$), năng lượng và khấu hao thiết bị ($25%$), nhân công và đóng gói ($20%$), kiểm nghiệm chất lượng ($15%$). Với công suất $1000\text{ lít dịch chiết/tháng}$, dự án ước tính đạt điểm hòa vốn sau $1.5\text{ năm}$ nhờ giá trị gia tăng cao của phụ gia sinh học cao cấp.

---

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp "Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men" đã giải quyết trọn vẹn bài toán tuyển chọn chủng vi sinh vật bản địa và chuẩn hóa điều kiện lên men sản sinh peptide kháng khuẩn sinh học:

• Thành tựu kỹ thuật cốt lõi: Tuyển chọn thành công chủng BL1 từ thức uống Boza với phổ kháng khuẩn rộng trên cả 4 vi khuẩn chỉ thị nguy hiểm (B. cereus, S. aureus, E. coli, Salmonella).
• Bộ thông số công nghệ chuẩn: Xác lập điều kiện lên men tối ưu đạt hiệu suất cao nhất: Thời gian lên men $36\text{ giờ}$, Nhiệt độ $37^\circ\text{C}$, $\text{pH}$ môi trường ban đầu $7.0$, và Nồng độ $\text{NaCl } 1.0%$, giúp mật độ tế bào đạt $\text{OD}_{610} = 1.8$ và đường kính vòng kháng khuẩn đạt đỉnh $18\text{ mm}$ trên Bacillus cereus.
• Giá trị thực tiễn: Tạo tiền đề vững chắc cho việc phát triển các chế phẩm bảo quản sinh học tự nhiên, thay thế phụ gia hóa học trong ngành công nghệ thực phẩm và chăn nuôi an toàn sinh học.

[!TIP] Khuyến nghị hợp tác & Chuyển giao: Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất thực phẩm có nhu cầu tiếp nhận quy trình công nghệ lên men chủng BL1 hoặc hợp tác phát triển chế phẩm màng bảo quản sinh học vui lòng liên hệ Bộ môn Công nghệ Sinh học - Khoa CNSH & CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên để triển khai thử nghiệm thực tế trên quy mô pilot.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Trong cuộc sống hằng ngày chúng ta thì vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều trong thực phẩm lên men hằng ngày như dưa muối, cà muối, lên men rượu, sữa chua, nem chua, pho mai, bia [3]. Nó có vai trò quan trọng trong đời sống như tăng cường miễn dịch, ức chế các vi sinh vật có hại, bổ sung các vi sinh vật có lợi, tác dụng kháng khuẩn. Và gần đây có nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein được tổng hợp ở riboxom từ các chuỗi peptit hoặc protein ở cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương [20].

Nó có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan làm suy yếu thành tế bào của vi khuẩn gây hại [29]. Vì vậy bacteriocin có rất nhiều ứng dụng, trong mỹ phẩm, xử lí môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi, trong y học và trong công nghệ thực phẩm [22]. Trong y dược, bacteriocin còn được ứng dụng như một chế phẩm sinh học để điều trị một số bệnh như viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đường tiêu hoá và còn sử dụng trong điều trị kháng sinh đồ[30].Trong ngành mỹ phẩm, bacteriocin được sử dụng trong thành phần của một số loại mỹ phẩm chăm sóc da vì có tính diệt khuẩn và giữ ẩm.Trong công nghệ thực phẩm, bacteriocin được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong chế biến và bảo quản một số loại thực phẩm như phomat, xúc xích, sữa chua, một số loại sản phẩm thịt, rau quả đóng hộp.[26] Ở Việt Nam hiện nay có nhiều nghiên cứu về sinh tổng hợp bacteriocin từ nem chua, sữa chua, dưa chua. Trong bài này tôi “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men”.

Mục đích của đề tài Đánh giá được khả năng kháng các vi khuẩn chỉ thị của vi khuẩn lactic phân lập từ đồ uống lên men Boza và xác định ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn. Mục tiêu của đề tài Khảo sát được khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Bacillus cereus) của các vi khuẩn lactic phân lập từ Boza. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện lên men tới quá trình tổng hợp bacteriocin: thời gian lên men, pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.

Ý nghĩa khoa học Xác định được khả năng kháng các vi khuẩn độc hại và ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng hình thành bacteriocin của vi khuẩn lactic từ Boza, làm cơ sở để có những nghiên cứu tiếp theo về chủng loại bacteriocin và ứng dụng trong thực tế. Đề tài giúp sinh viên có thêm kinh nghiệm, kiến thức bổ ích và tiếp cận với công tác nghiên cứu khoa học để phục vụ cho nghiên cứu và công tác sau này. Ý nghĩa thực tiễn Là cơ sở để nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn đã phân lập trong sản xuất bacteriocin ứng dụng trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm. Khẳng định vai trò có lợi của đồ uống lên men Boza đối với con người.

n 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, hình que hoặc hình cầu, có khả năng lên men đường thành acid lactic. Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng, màu trắng đục hoặc màu vàng kem hoặc đôi khi khuẩn lạc có kính thước to, tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc có thể tỏa ra mùi chua của acid.

Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriacae thuộc bộ Eubacteriales [2]. Chúng trao đổi chất và phần lớn sản phẩm cuối của quá trình lên men cacbonhydrat là axit lactic [1]. Theo Nguyễn Thành Đạt (2007) tất cả những vi sinh vật lactic đều có các đặc điểm sau: Đó là những vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh bào tử, có hoạt tính catalaza, oxydaza, nitratoreductaza âm tính. Tổng hợp nhiều hợp chất cần thiết cho sự sống nhưng rất yếu, cho nên chúng là những vi sinh vật đa khuyết dưỡng đối với nhiều axit amin, nhiều bazơ nucleic, nhiều vitamin… Không có khả năng tổng hợp nhân hem của các porphyrine, bình thường chúng không có cytochrome.

Chúng là những vi khuẩn kị khí tùy tiện, vi hiếu khí, là loại có khả năng lên men hiếu khí cũng như lên men kị khí. Có khả năng chống chịu tốt trong môi trường acid. Vi khuẩn lactic phân bố tương đối rộng trong tự nhiên, đặc biệt trong các sản phẩm lên men. Vi khuẩn lactic có thể tồn tại trong đất, trong nước, trên bề mặt thực vật, trong các sản phẩm lên men (sữa chua, format,…), các sản phẩm rau muối chua, trong đường tiêu hóa của người và động vật, trong các sản phẩm thịt.

Phân loại vi khuẩn lactic n 4 Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống khác nhau. Để phân loại người ta dựa vào nhiều tiêu chí khác nhau, căn cứ vào đặc điểm hình thái, phương thức lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng chịu muối, chịu axit hay chịu kiềm. Theo Orla-Jensen (1919) [2] Chia làm 4 loài chính: Lactobacillus. Ngày nay người ta mới bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những vi khuẩn Bifidobacterium (Kandler và Welss, 1986).

Phân loại theo hình dạng tế bào [2] Hình que: Lactobacillus, Carnobacterium. Hình cầu: Streptococcus, Leuconotoc, Pedicoccus. Ngoại lệ: Weissella (có cả hình cầu và que), Bifidobacterium. Phân chia vuông góc nhau trên một mặt phẳng tạo hình tứ cầu (Aerococcus, Tetragenococcus, Pediococcus).

Hình dạng và sự sắp xếp tế bào có thể thay đổi tùy thuộc vào thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy. Phân loại theo cách thức lên men [9] Lên men đồng hình (homofermentative): Khi lượng axit lactic tạo ra chủ yếu 85 – 90%. Vi khuẩn lên men lactic đồng hình có enzyme aldolaza nhưng không có enzyme phosphoketolaza. Nhóm vi khuẩn này gồm các cầu khuẩn Streptococcus lactic như là Streptococcus cremoris, các trực khuẩn Lactobacterium acidophilum, Lactobacterium helveticum, Lactobacterium bulgaricus.

n 5 Lên men dị hình (heterofermentative): Khi lượng axit lactic lên men chiếm tỉ lệ thấp khoảng 50%, các axit hữu cơ khác như axit acetic, axit formic… và CO2. Nhóm vi khuẩn lactic này không có enzyme aldolaza nhưng lại có enzyme phosphoketolaza. Ví dụ: Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, một số Lactobacillus. Phân loại dựa vào nhiệt độ Chia làm 3 loại [10,11]: Ưa lạnh: 0 – 27oC Ưa ấm: 5 – 45oC Ưa nhiệt: 20 – 60oC Ngoài ra còn có thể phân loại vi khuẩn lactic theo một số đặc điểm sau [5]: Khả năng chịu muối.

Khả năng sinh tổng hợp các đồng phân khác nhau của axit lactic. Phân loại dựa vào tỷ lệ phần trăm của các bazơ Guamin (G) + Cytosin (C) (%GC). Các loài thuộc giống Streptococcus có tỷ lệ %GC 34-46%, Leuconostoc 36-43%, Pediococuss 34-43%… [2]. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic 2.

Đặc điểm sinh lý Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc bộ Eubacteriales. Chúng không đồng nhất về mặt hình thái nhưng về sinh lý tương đối đồng nhất. Đều là vi khuẩn Gram dương (+), không tạo bào tử, hầu hết không di động, thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và sinh axit lactic. Axit lactic sinh ra dưới dạng D (-), L (+) hoặc DL [1,7].

Tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men bắt buộc, không chứa enzyme catalaza, cytochrome, hô hấp tùy tiện. Vi khuẩn lactic đòi hỏi nhu cầu cao về môi trường dinh dưỡng, ngoài đường, muối khoáng, nitơ, đa số chúng cần hàng loạt các loại vitamin n 6 (thiamin, biototin, axit folic, lactoflavin, axit pentotenic, axit nicotinic…) và các axit amin. Hình dạng và kích thước tế bào của vi khuẩn lactic thay đổi tùy từng loài, hình thái còn phụ thuộc vào điều kiện môi trường, thời gian lên men, sự có mặt của oxi và các tác nhân khác. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn lactic Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Cacbon là thành tố chính xây dựng nên cơ thể của mọi sinh vật.

Vì vậy sự chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật. Vi khuẩn lactic có thể sử dụng rất nhiều loại hydratcacbon khác nhau, chúng dễ dàng lên men các loại đường đơn (monosaccharide) như glucose, fructose, mantose, galactose. Với các loại đường đôi (disaccharide) như saccharose, mantose… thì được đồng hóa một cách chọn lọc hơn. Đối với các loại polysaccharide như dextrin, tinh bột… chỉ một số loài mới có khả năng đồng hóa.

Các loài vi khuẩn lactic khác nhau thì đỏi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Sự phát triển vi khuẩn lactic với mỗi loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau, vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước áp lực của các quá trình xử lý sau này. Chẳng hạn khả năng sống sót của L. burgaticus sau khi sấy đông khô cao hơn khi sử dụng đường fructose và lactose so với mannose.delbruceckii có thể sử dụng đường glucose, galactose, mantose, saccharose nhưng không sử dụng được lactose, rafinose [4,7].

Nhu cầu về dinh dưỡng nitơ Nitơ là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của mọi sinh vật. Những vật chất cơ bản của tế bào protein, axit nucleic… đều chứa nitơ vì vậy nitơ đóng vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng nitơ phức tạp. Phần lớn vi khuẩn lactic n 7 không thể tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ, do vậy chúng cần sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường chủ yếu là các nitơ hữu cơ như protein, peptid, peptone, axit amine [1].

Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như cao thịt, cao nấm mem, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone, dịch nấm men thủy phân, dịch chiết thịt. Đây là nguồn nitơ được sử dụng thường xuyên trong môi trường nuôi cấy [7]. Nhu cầu về dinh dưỡng vitamin Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống của tế bào. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin.

Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại [7].