Luận văn đáp ứng ở mức độ phân tử của dòng tế bào ung thư đại trực tràng ht 29 đối với thuốc selumetinib kết quả nghiên cứu invitro

Chuyên khảo phân tích Luận văn đáp ứng ở mức độ phân tử của dòng tế bào ung thư đại trực tràng ht 29 đối với thuốc, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu

• Tác giả: Trinh Thi Hai
• Người hướng dẫn: TS. Duong Hong Quan
• Trường học: Trường Đại học Y tế Công cộng
• Chuyên ngành: Kỹ thuật Xét nghiệm Y học
• Đề tài: Đáp ứng ở mức độ phân tử của dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 đối với thuốc Selumetinib: Kết quả nghiên cứu in vitro
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• TÓM TẮT NGHIÊN CỨU
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Ung thư đại trực tràng
• 1.1.1. Các yếu tố nguy cơ ung thư đại trực tràng
• 1.1.2. Phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng
• 1.1.2.1. Chẩn đoán lâm sàng
• 1.1.2.2. Chẩn đoán cận lâm sàng
• 1.2. Các phương pháp kỹ thuật xét nghiệm sử dụng trong nghiên cứu
• 1.2.1. Phương pháp Western Blot
• 1.2.2. Kỹ thuật MTS
• 1.2.3. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
• 1.2.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
• 1.3. Kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29
• 1.3.1. Tế bào HT-29
• 1.3.2. Phương pháp điều trị đích
• 1.3.3. Cơ chế tác dụng của Selumetinib trên tế bào ung thư đại trực tràng HT-29
• 1.3.4. Thực trạng kháng thuốc Selumetinib
• 1.4. Cấu trúc phân tử và cơ chế kháng thuốc của tế bào
• 1.4.1. Cấu tạo tế bào
• 1.4.2. Cơ sở tế bào và phân tử của ung thư
• 1.4.3. Một số cơ chế sinh học phân tử trong kháng thuốc điều trị ung thư
• 1.5. Tình hình nghiên cứu về UTĐTT ở Việt Nam và trên thế giới
• 1.5.1. Giới thiệu về nghiên cứu gốc
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Thiết kế nghiên cứu
• 2.4. Cỡ mẫu và chọn mẫu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6. Biến số nghiên cứu
• 2.7. Xử lý và phân tích số liệu
• 2.8. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thay đổi khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29/P ban đầu và tế bào kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR
• 3.1.1. Kết quả tạo dòng tế bào UTĐTT kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR từ dòng tế bào HT-29/P ban đầu
• 3.1.2. Khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào bằng kỹ thuật MTS
• 3.1.3. Khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào bằng kỹ thuật tạo dòng khuẩn lạc
• 3.2. Sự biến đổi ở mức độ phân tử của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu
• 3.2.1. Kết quả đánh giá con đường tín hiệu nội bào MAPK giữa dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu
• 3.2.2. Kết quả đánh giá con đường tín hiệu nội bào AKT1/2 giữa dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu
• 3.2.3. Sự biến đổi phân tử đáp ứng sự kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu
• 3.2.4. Sự biểu hiện của dấu ấn sinh học quyết định tính kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29/P ban đầu và tế bào kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR
• 4.1.1. Đặc điểm dòng tế bào HT-29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib
• 4.1.2. Khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của dòng tế bào ung thư đại trực tràng ban đầu HT-29/P và tế bào kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR
• 4.2. Sự biến đổi ở mức độ phân tử của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR so với dòng tế bào ung thư đại trực tràng ban đầu HT-29/P
• 4.2.1. Mối liên quan giữa các con đường tín hiệu nội bào MAPK, AKT trong dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu
• 4.2.2. Sự biến đổi phân tử kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu
• 4.2.3. Mối liên quan của Caveolin-1 với tính kháng thuốc Selumetinib ở ung thư đại trực tràng
• KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH ẢNH

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu in vitro về tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 và phản ứng của chúng với Selumetinib đã chỉ ra tầm quan trọng của việc hiểu rõ cơ chế kháng thuốc trong điều trị ung thư. Selumetinib là một loại thuốc điều trị đích, được sử dụng cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng mang đột biến BRAF. Tuy nhiên, nhiều bệnh nhân đã phát triển tình trạng kháng thuốc, dẫn đến việc cần thiết phải nghiên cứu sâu hơn về các yếu tố phân tử ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng thuốc. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu đánh giá sự thay đổi trong khả năng đáp ứng của các dòng tế bào HT-29 kháng thuốc so với dòng tế bào ban đầu, từ đó xác định các dấu hiệu sinh học có thể dự đoán tính kháng thuốc.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp nuôi cấy tế bào, Western Blot, và RT-PCR để phân tích sự biểu hiện của các protein và RNA trong các dòng tế bào HT-29. Các dòng tế bào HT-29 được nuôi cấy trong môi trường thích hợp và tiếp xúc với Selumetinib ở các nồng độ khác nhau. Kỹ thuật MTS được áp dụng để đánh giá khả năng sống sót của tế bào sau khi điều trị. Kết quả từ các phương pháp này sẽ giúp xác định sự khác biệt trong khả năng đáp ứng thuốc giữa các dòng tế bào kháng thuốc và không kháng thuốc, từ đó cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế kháng thuốc của tế bào ung thư đại trực tràng.

III. Kết quả nghiên cứu

Kết quả cho thấy rằng dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc có khả năng sống sót cao hơn so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu khi tiếp xúc với Selumetinib. Sự biểu hiện của các protein như E-Cadherin và Vimentin cũng cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa hai dòng tế bào. Đặc biệt, mức độ biểu hiện của Caveolin-1 trong dòng tế bào kháng thuốc tăng lên, cho thấy vai trò quan trọng của nó trong cơ chế kháng thuốc. Những phát hiện này không chỉ cung cấp cái nhìn sâu sắc về cơ chế kháng thuốc mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

IV. Bàn luận

Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc hiểu rõ các cơ chế phân tử liên quan đến kháng thuốc trong điều trị ung thư đại trực tràng. Việc xác định các dấu hiệu sinh học như Caveolin-1 có thể giúp dự đoán khả năng đáp ứng của bệnh nhân với Selumetinib. Điều này không chỉ có ý nghĩa trong việc tối ưu hóa phác đồ điều trị mà còn góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các liệu pháp kết hợp nhằm vượt qua tình trạng kháng thuốc, từ đó cải thiện hiệu quả điều trị cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư đại trực tràng hiện là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến hàng đầu với tỷ lệ mắc mới và tử vong ở mức đáng báo động trên phạm vi toàn cầu. Theo báo cáo của tổ chức ung thư toàn cầu GLOBOCAN, thế giới ghi nhận hơn 1.800.000 trường hợp mắc mới và trên 881.000 ca tử vong mỗi năm, đưa ung thư đại trực tràng lên vị trí thứ ba về tỷ lệ mắc và thứ tư về nguyên nhân gây tử vong do ung thư. Tại Việt Nam, thống kê năm 2020 chỉ ra căn bệnh này gây ra hơn 16.426 ca mắc mới cùng 8.203 trường hợp tử vong, với tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi tại khu vực Hà Nội đạt mức 7,5/100.000 dân.

Vấn đề cốt lõi trong thực hành điều trị lâm sàng hiện nay nằm ở tình trạng kháng thuốc đối với các liệu pháp điều trị trúng đích. Khoảng 10% đến 13% bệnh nhân ung thư đại trực tràng mang đột biến gen BRAF V600E. Nhóm bệnh nhân này thường có tiên lượng xấu, kém đáp ứng với hóa trị kinh điển và nhanh chóng xuất hiện tình trạng kháng các thuốc ức chế điểm đích MEK1/2 như Selumetinib chỉ sau một thời gian ngắn điều trị.

Mục tiêu cụ thể của luận văn tập trung vào hai nội dung trọng tâm:

1. Đánh giá sự thay đổi về khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib giữa dòng tế bào ung thư đại trực tràng nguyên bản HT-29/P và dòng tế bào kháng thuốc HT-29/SR được tạo ra trong phòng thí nghiệm.
2. Xác định chi tiết sự biến đổi ở mức độ phân tử, bao gồm các con đường truyền tín hiệu nội bào và mức độ biểu hiện của các dấu ấn sinh học then chốt quy định tính kháng thuốc.

Nghiên cứu được triển khai từ tháng 11/2021 đến tháng 8/2022 tại Trung tâm Xét nghiệm thuộc Trường Đại học Y tế công cộng. Đề tài mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác về cơ chế phân tử, tạo tiền đề xây dựng các phác đồ phối hợp thuốc mới nhằm nâng cao tỷ lệ sống sót sau 5 năm cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng mang đột biến gen.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn vận dụng đồng bộ ba hệ thống lý thuyết và mô hình sinh học phân tử hiện đại:

1. Lý thuyết con đường truyền tín hiệu MAPK và PI3K/AKT: Con đường truyền tín hiệu thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) dẫn truyền qua trục RAS-RAF-MEK-ERK đóng vai trò trung tâm điều hòa quá trình tăng sinh và biệt hóa tế bào. Đột biến BRAF V600E kích hoạt liên tục con đường này bất kể có hay không tín hiệu thượng nguồn. Khi Selumetinib ức chế MEK1/2, tế bào khối u thường kích hoạt con đường tín hiệu song song PI3K/AKT để duy trì sự sống sót.
2. Lý thuyết chuyển đổi biểu mô - trung mô (EMT): Quá trình tế bào biểu mô mất tính phân cực, giảm bám dính liên kết và chuyển đổi sang dạng trung mô có khả năng di động cao, đóng vai trò then chốt trong xâm lấn và kháng thuốc trị liệu.
3. Thuyết chọn lọc dòng kháng thuốc: Quần thể tế bào khối u ban đầu chỉ chứa tỷ lệ tế bào kháng thuốc rất thấp, khoảng 1 trên 100.000 tế bào nhạy cảm. Dưới áp lực của thuốc điều trị, các dòng tế bào đột biến thích nghi sẽ được chọn lọc và tăng sinh chiếm ưu thế.

Các khái niệm chính bao gồm: Selumetinib (chất ức chế chọn lọc MEK1/2), Đột biến BRAF V600E (đột biến điểm T1799A trên exon 15), Caveolin-1 (protein cấu trúc màng tham gia truyền tín hiệu nội bào), E-Cadherin (dấu ấn tế bào biểu mô) và Vimentin (dấu ấn tế bào trung mô).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 chuẩn từ Ngân hàng Tế bào Hoa Kỳ (ATCC HTB-38). Tác giả tiến hành chọn mẫu thực nghiệm có kiểm soát với quy trình tạo dòng kháng thuốc HT-29/SR thông qua việc tăng dần nồng độ Selumetinib từ ngưỡng 0,1 µM lên đến 1,5 µM liên tục trong thời gian 6 tháng.

Cỡ mẫu nghiên cứu được thiết lập dựa trên nguyên tắc lặp lại sinh học: mỗi nồng độ và chỉ số đánh giá được thực hiện trên 3 mẫu lặp lại độc lập trong cùng một đợt và kiểm chứng qua 3 lần thực nghiệm riêng biệt nhằm triệt tiêu sai số ngẫu nhiên.

Các phương pháp phân tích chính bao gồm:

• Kỹ thuật MTS (Microculture Tetrazolium): Xác định tỷ lệ tế bào sống tại mật độ 2.000 tế bào/giếng trên phiến 96 giếng ở các nồng độ thuốc từ 0,1 µM đến 30 µM sau 72 giờ tiếp xúc. Giá trị IC50 được tính toán bằng phần mềm CompuSyn. Lý do lựa chọn: Phương pháp có độ nhạy cao, định lượng quang phổ chính xác ở bước sóng 490 nm và tiết kiệm thời gian.
• Kỹ thuật tạo khuẩn lạc (Clonogenic assay): Đánh giá khả năng tăng sinh đơn dòng ở mật độ 500 tế bào/giếng sau 14 ngày nuôi cấy với các dải nồng độ Selumetinib từ 0 đến 1 µM, nhuộm tím tinh thể.
• Kỹ thuật Western blot: Khảo sát nồng độ biểu hiện protein p-MAPK (Y202/T204), MAPK, p-AKT1/2 (S473), AKT, E-Cadherin, Vimentin, Caveolin-1 và alpha-Tubulin. Sử dụng phần mềm ImageJ để chuẩn hóa và định lượng mật độ quang của các băng tín hiệu.
• Kỹ thuật Realtime RT-PCR: Định lượng tương đối mức độ biểu hiện phiên mã mRNA của gen Caveolin-1 so với gen nội chuẩn GAPDH trên hệ thống Applied Biosystems 7500 theo phương pháp chu trình ngưỡng Livak (2^-ΔΔCt). Độ tinh sạch của RNA sau tách chiết đạt tỷ lệ quang phổ A260/A280 xấp xỉ 2,01.

Toàn bộ quy trình thực nghiệm được thẩm định và phê duyệt bởi Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học theo Quyết định số 156/2022/YTCC-HD3 ngày 20 tháng 05 năm 2022.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 4 phát hiện quan trọng có ý nghĩa phân tử rõ rệt:

1. Sự biến đổi hình thái học và hiện tượng chuyển đổi biểu mô - trung mô (EMT): Dòng tế bào HT-29/P ban đầu có hình thái tròn đều, sắp xếp đồng nhất đặc trưng của tế bào biểu mô. Ngược lại, dòng kháng thuốc HT-29/SR chuyển sang hình thái dẹt, kéo dài dạng sợi thoi không đồng đều giống tế bào trung mô. Kết quả Western blot xác nhận tín hiệu protein E-Cadherin ở HT-29/SR sụt giảm nghiêm trọng, trong khi tín hiệu protein Vimentin tăng vọt so với dòng ban đầu.
2. Khả năng sống sót vượt trội của dòng HT-29/SR dưới tác động của Selumetinib: Thử nghiệm MTS chứng minh ở nồng độ thấp 0,1 µM, tỷ lệ sống của dòng HT-29/P giảm xuống còn 88,5%, trong khi dòng HT-29/SR đạt mức 112%. Khi nồng độ thuốc tăng cao tới 30 µM, dòng nhạy cảm HT-29/P chỉ còn 31,5% tế bào sống sót, trong khi dòng kháng thuốc HT-29/SR duy trì tỷ lệ sống đạt 50,0%.
3. Ưu thế tạo khuẩn lạc của quần thể tế bào kháng thuốc: Khi tiếp xúc với các nồng độ Selumetinib tăng dần từ 0, 0,25, 0,5 đến 1 µM, số lượng khuẩn lạc hình thành ở dòng HT-29/SR lần lượt đạt 75, 63, 51 và 40 khuẩn lạc. Con số này vượt trội hơn hẳn so với dòng HT-29/P với số lượng khuẩn lạc tương ứng là 56, 44, 36 và 25 khuẩn lạc (tại nồng độ 1 µM, khả năng tạo khuẩn lạc của dòng kháng cao hơn 60% so với dòng ban đầu).
4. Tái hoạt hóa con đường MAPK, AKT và sự bộc lộ quá mức của Caveolin-1: Tín hiệu phosphoryl hóa p-MAPK tại vị trí Y202/T204 và p-AKT1/2 tại vị trí S473 ở dòng HT-29/SR tăng mạnh so với HT-29/P. Đặc biệt, mức độ biểu hiện mRNA của Caveolin-1 ở dòng HT-29/SR tăng gấp 2,01 lần trên phân tích RT-PCR, đồng thời tín hiệu protein Caveolin-1 trên Western blot cũng bộc lộ đậm nét.

Thảo luận kết quả

Các dữ liệu thực nghiệm phản ánh cơ chế thích nghi phức tạp của tế bào ung thư đại trực tràng khi đối mặt với thuốc ức chế đích. Việc gia tăng đồng thời p-MAPK và p-AKT1/2 cho thấy tế bào HT-29/SR không chỉ tìm cách vượt qua sự ức chế MEK1/2 bằng cách tái kích hoạt dòng thác MAPK xuôi dòng, mà còn kích hoạt bù trừ con đường sinh tồn PI3K/AKT. Đây là cơ chế giải thích nguyên nhân thất bại của các phác đồ đơn trị liệu bằng chất ức chế MEK trên lâm sàng.

Sự biến đổi nồng độ Caveolin-1 đóng vai trò là tâm điểm của nghiên cứu. Caveolin-1 là thành phần cấu trúc chính của hang màng caveolae, tham gia điều hòa không gian màng tế bào và đóng vai trò như bệ đỡ trung gian khuếch đại tín hiệu sinh tồn. Mức tăng phiên mã 2,01 lần của Caveolin-1 gắn liền chặt chẽ với quá trình EMT, tạo điều kiện cho tế bào duy trì trạng thái kháng thuốc bền vững.

Trong công bố khoa học, các dữ liệu này được thể hiện trực quan qua đồ thị đường cong đáp ứng liều (Dose-Response Curves) từ kỹ thuật MTS, biểu đồ cột so sánh số lượng khuẩn lạc sống sót ở từng mốc nồng độ, và biểu đồ mật độ quang tương đối chuẩn hóa theo alpha-Tubulin từ các bản chụp Western blot. Kết quả này hoàn toàn tương đồng với các công bố quốc tế về tính kháng thuốc mắc phải, đồng thời cung cấp thêm bằng chứng cụ thể trên mô hình tế bào mang đột biến BRAF V600E.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các phát hiện phân tử thực nghiệm, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp và khuyến nghị hành động:

1. Phát triển phác đồ điều trị phối hợp đa đích:

   • Hành động: Nghiên cứu phối hợp Selumetinib với các chất ức chế PI3K/AKT hoặc các hoạt chất ức chế biểu hiện Caveolin-1.
   • Chỉ số mục tiêu: Giảm tỷ lệ sống sót của quần thể tế bào ung thư kháng thuốc xuống dưới 20% so với đơn trị liệu.
   • Thời gian thực hiện: Giai đoạn 2024–2025.
   • Chủ thể thực hiện: Các viện nghiên cứu dược lý học, trung tâm thử nghiệm tiền lâm sàng và nhóm nghiên cứu ung thư học.

2. Mở rộng quy mô nghiên cứu trên phổ đột biến đa dạng:

   • Hành động: Thử nghiệm cơ chế đáp ứng thuốc trên ít nhất 5 dòng tế bào ung thư đại trực tràng khác nhau mang đột biến KRAS (như codon 12, 13) và các đột biến BRAF ngoài V600E.
   • Chỉ số mục tiêu: Thiết lập bản đồ đáp ứng phân tử toàn diện đạt độ bao phủ trên 80% các dạng đột biến phổ biến.
   • Thời gian thực hiện: 12 đến 18 tháng tới.
   • Chủ thể thực hiện: Các phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ sinh học y dược.

3. Ứng dụng Caveolin-1 làm dấu ấn sinh học theo dõi kháng thuốc:

   • Hành động: Xây dựng quy trình định lượng biểu hiện Caveolin-1 thông qua RT-qPCR và hóa mô miễn dịch để theo dõi sớm nguy cơ kháng thuốc ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng.
   • Chỉ số mục tiêu: Đạt độ nhạy xét nghiệm trên 90% và độ đặc hiệu trên 85% trong phát hiện sớm tình trạng đề kháng.
   • Thời gian thực hiện: Giai đoạn 2025–2026.
   • Chủ thể thực hiện: Khoa xét nghiệm y học, trung tâm sinh học phân tử tại các bệnh viện chuyên khoa ung bướu.

4. Triển khai thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình động vật in vivo (PDX):

   • Hành động: Đánh giá hiệu quả ức chế khối u của các phác đồ kết hợp trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch mang khối u ghép từ bệnh nhân.
   • Chỉ số mục tiêu: Đạt mức thu nhỏ thể tích khối u trên 60% mà không làm gia tăng độc tính toàn thân.
   • Thời gian thực hiện: 24 tháng.
   • Chủ thể thực hiện: Các cơ sở nghiên cứu y sinh học phối hợp cùng các doanh nghiệp dược phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả nghiên cứu của luận văn mang lại giá trị thiết thực cho 4 nhóm đối tượng chuyên môn:

1. Bác sĩ chuyên khoa Ung bướu và Tiêu hóa:

   • Lợi ích: Cập nhật cơ sở phân tử của tình trạng kháng thuốc ức chế MEK1/2 trên nhóm bệnh nhân mang đột biến BRAF V600E (chiếm 10% đến 13% ca bệnh).
   • Tình huống ứng dụng: Tham khảo cơ chế để cân nhắc phác đồ điều trị cá thể hóa, dự phòng nguy cơ kháng thuốc khi sử dụng các thuốc nhắm đích trong thực hành lâm sàng.

2. Kỹ thuật viên và chuyên viên Xét nghiệm Y học:

   • Lợi ích: Nắm vững quy trình kỹ thuật chuẩn xác về nuôi cấy tế bào ung thư, kỹ thuật tạo dòng kháng thuốc in vitro, phương pháp đo quang phổ MTS, Western blot và RT-qPCR.
   • Tình huống ứng dụng: Ứng dụng trực tiếp vào việc chuẩn hóa quy trình phân tích sinh học phân tử và vận hành thiết bị tại các phòng xét nghiệm đạt chuẩn ISO 17025.

3. Học viên sau đại học, nghiên cứu sinh ngành Khoa học Y Sinh:

   • Lợi ích: Tiếp cận phương pháp luận nghiên cứu thực nghiệm chuẩn mực, cách xử lý số liệu bằng phần mềm CompuSyn, ImageJ, SPSS và phương pháp phân tích chu trình ngưỡng Livak (2^-ΔΔCt).
   • Tình huống ứng dụng: Làm tài liệu tham khảo cấu trúc, thiết kế nghiên cứu cho các đề tài thạc sĩ, tiến sĩ chuyên ngành Y học thực nghiệm và Hóa dược.

4. Các đơn vị R&D Dược phẩm và Công nghệ Sinh học:

   • Lợi ích: Khai thác dữ liệu về vai trò của Caveolin-1 và các con đường bù trừ tín hiệu MAPK/AKT để định hướng thiết kế các phân tử thuốc mới.
   • Tình huống ứng dụng: Phát triển các dòng kít xét nghiệm chẩn đoán phân tử và phát triển thuốc ức chế kép khắc phục tính kháng thuốc trong điều trị ung thư.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao dòng tế bào HT-29 lại được chọn làm mô hình nghiên cứu kháng Selumetinib? Dòng tế bào HT-29 có nguồn gốc từ ung thư biểu mô tuyến đại trực tràng người và mang đặc trưng đột biến gen BRAF V600E (đột biến điểm T1799A trên codon 600 của exon 15). Tỷ lệ đột biến này gặp ở khoảng 10% đến 13% bệnh nhân ung thư đại trực tràng, khiến con đường MAPK luôn bị kích hoạt liên tục. Do đó, HT-29 là mô hình in vitro chuẩn mực quốc tế để khảo sát cơ chế tác động và đánh giá sự kháng thuốc của chất ức chế MEK1/2 Selumetinib.

Hiện tượng chuyển đổi tế bào biểu mô - trung mô (EMT) biểu hiện như thế nào ở dòng kháng thuốc? Sau 6 tháng chịu áp lực nồng độ Selumetinib tăng dần đến 1,5 µM, tế bào HT-29/SR chuyển từ dạng hình tròn đều biểu mô sang dạng hình thoi dài, dẹt trung mô. Trên phương diện phân tử, phân tích Western blot chỉ ra sự sụt giảm nghiêm trọng của protein liên kết biểu mô E-Cadherin song song với sự gia tăng mạnh mẽ của dấu ấn trung mô Vimentin, chứng minh tế bào đã trải qua quá trình EMT để tăng khả năng sinh tồn và chống chịu độc tính.

Vai trò cụ thể của Caveolin-1 trong cơ chế kháng thuốc Selumetinib là gì? Caveolin-1 là protein màng cốt lõi tại các cấu trúc caveolae, đóng vai trò điều phối thụ thể và khuếch đại tín hiệu sinh tồn nội bào. Luận văn ghi nhận mức biểu hiện phiên mã mRNA của Caveolin-1 ở dòng HT-29/SR tăng vọt gấp 2,01 lần thông qua kỹ thuật RT-qPCR, đồng thời tín hiệu protein Caveolin-1 cũng bộc lộ đậm nét trên Western blot. Điều này khẳng định Caveolin-1 là một dấu ấn phân tử trung tâm chi phối tính kháng thuốc Selumetinib.

Các kỹ thuật nào đã được sử dụng để đánh giá khả năng sống và tạo khuẩn lạc của tế bào? Nghiên cứu tích hợp hai phương pháp định lượng thực nghiệm: xét nghiệm MTS đo mật độ quang học ở bước sóng 490 nm với mật độ 2.000 tế bào/giếng để xác định tỷ lệ sống sót sau 72 giờ tiếp xúc thuốc (tại 30 µM, dòng HT-29/SR đạt tỷ lệ sống 50,0% so với 31,5% của dòng gốc); và kỹ thuật tạo khuẩn lạc với mật độ 500 tế bào/giếng trong 14 ngày, ghi nhận số lượng khuẩn lạc của dòng kháng luôn vượt trội ở mọi nồng độ thuốc.

Kết quả nghiên cứu mang lại gợi mở gì cho việc tối ưu hóa phác đồ điều trị ung thư trên lâm sàng? Nghiên cứu chỉ ra rằng việc sử dụng đơn trị liệu Selumetinib sẽ thúc đẩy tế bào khối u kích hoạt các con đường thoát ức chế thông qua tái phosphoryl hóa p-MAPK tại Y202/T204, tăng sinh qua p-AKT1/2 tại S473 và tăng cường Caveolin-1. Do đó, hướng đi bắt buộc trong điều trị ung thư đại trực tràng mang đột biến BRAF là phải xây dựng các phác đồ phối hợp đa đích nhằm đồng thời khóa chặt cả con đường MEK/MAPK và PI3K/AKT để ngăn chặn tái phát.

Kết luận

Những đóng góp cốt lõi và kết luận rút ra từ luận văn bao gồm:

• Tạo dòng thành công: Thiết lập thành công mô hình dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29/SR kháng bền vững Selumetinib ở nồng độ 1,5 µM sau 6 tháng nuôi cấy chọn lọc.
• Đặc trưng kháng thuốc: Chứng minh dòng HT-29/SR có tỷ lệ tế bào sống sót (50,0% tại 30 µM) và khả năng tạo khuẩn lạc (40 khuẩn lạc tại 1 µM) vượt trội rõ rệt so với dòng HT-29/P ban đầu.
• Làm sáng tỏ cơ chế phân tử: Xác định hiện tượng tái hoạt hóa mạnh mẽ tín hiệu nội bào p-MAPK (Y202/T204) và tăng cường tín hiệu bù trừ p-AKT1/2 (S473) ở dòng kháng thuốc.
• Xác nhận quá trình EMT: Ghi nhận sự biến đổi hình thái từ biểu mô sang trung mô, đi kèm với sự suy giảm protein E-Cadherin và gia tăng protein Vimentin.
• Xác định dấu ấn Caveolin-1: Phát hiện Caveolin-1 gia tăng biểu hiện 2,01 lần ở mức độ phiên mã mRNA và tăng mạnh ở mức độ protein, đóng vai trò là dấu ấn phân tử quyết định tính kháng thuốc.

Đóng góp chính của luận văn là làm sáng tỏ mạng lưới phân tử điều hòa tính kháng Selumetinib trên nền đột biến BRAF V600E, đặt nền móng lý thuyết và thực nghiệm vững chắc cho các nghiên cứu phát triển liệu pháp điều trị trúng đích phối hợp.

Kế hoạch hành động tiếp theo trong giai đoạn 2024–2026 tập trung vào việc thử nghiệm các hợp chất ức chế phối hợp trên mô hình động vật in vivo và phát triển kít xét nghiệm dấu ấn sinh học Caveolin-1 trong giám sát điều trị. Bạn đọc và các nhà nghiên cứu quan tâm có thể tham khảo toàn văn luận văn để khai thác chi tiết bộ dữ liệu thực nghiệm và quy trình sinh học phân tử phục vụ cho công tác chuyên môn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN TÀI LIỆỆU.2--<°©sseevveeeertvssesrrer 4 In? iu. Ung thư đại trực tràng. Các yếu tổ nguy cơ ung thư đại trực tràng. Phương pháp chân đoán ung thư đại trực tràng.

Chan dod 1am sang. Chân đoán cận lâm sàng. Các phương pháp kỹ thuật xét nghiệm sử dụng trong nghiên cứu. 6 132K y thuật MS coi ESSHSDGDSHSEOIMORDGEOIRSIYTERISHBSISSwpsspeaai 6 18.

Kỹ thuật nuôi cây tế bảo. Phương pháp tách chiết RNA tổng số. Kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bảo HT-29. Tế bảo HT-29.

Phương pháp điều trị đích. Cơ chế tác dụng của Selumetinib trên tế bào ung thư đại trưc tràng HT-29. Thực trạng kháng thuốc Selumetinib. Cau trúc phân tử và cơ chế kháng thuốc của tế bào.

Cầu tạo tế bảo. Cơ sở tế bào và phân tử của ung thư 1. Một số cơ chế sinh học phân tử trong kháng thuốc điều trị ung thư. Tình hình nghiên cứu về ƯTĐTT ở Việt Nam và trên thế giới.

Dia co nnẽ. Giới thiệu về nghiên cứu gốc.---222+222222+22222222222211222222122222222 cerree 21 iil CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Wat U6wi NHIÊN CŨ: eercsgs0EERSITEREEHGSIDEDIDROEDINEBOEDINESSHRSRASE 23 2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.PhfyngspliáprmphiEiiÐiÊsoseesssssssseniissikindsirisoitiiSEigSES014001S1405501400140530130018 23 2.

Thiết kế nghiên cứu. Cỡ mẫu và chọn mẫu. 2 +2222SE+ES2SE22EEEEE2EE2E12112711217117117121E 211111. Phương pháp nghiên cỨu.

Biến số nghiên cứu 2. Xử lý và phân tích só liệu Z;0.2)g6idUCtlrorIpitig HIỂTHGỨU:secsesssssneniskingSES01408110186360150015140550140140530130018 28 CHUONG 3: KET QUA NGHIÊN CỨU. Thay đổi khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29/P ban đầu và tế bào kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR. Kết quả tạo dòng tế bào UTĐTT kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR từ dòng tế báo HT-Z25ƒP ban đẦN::aoscsecsiotoantraiidbinininDdiD002 001010101 d0ữ100g0cg2ngghagogg 29 3.

Khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bảo bằng kỹ thuật MTS. Khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào bằng kỹ thuật tạo dòng khuẩn lạc. Sự biến đổi ở mức độ phân tử của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT- 29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban dau. Kết quả đánh giá con đường tín hiệu nội bào MAPK giữa dòng tế bào HT- 29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu.

Kết quả đánh giá con đường tín hiệu nội bào AKT1/2 giữa dòng tế bào HT- 29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu. Sự biến đổi phân tử đáp ứng sự kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT- 29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu. Sự biểu hiện của dấu ấn sinh học quyết định tính kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế Bần,D.1S00/U1bnniETDii«ese-eosseoeetoxsedkgkecrteingdggrhuZng2tt23003028g/t7810.g03p1e20xagsEgrterkre- Tố) IV CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN. Khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29/P ban dau và tế bào kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR.

Đặc điểm dòng tế bào HT-29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib.----©222222++2222EEEY2E++22EEE2212EE. Khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của dòng tế bảo ung thư đại trực tràng ban dau HT-29/P và tế bào kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR. Sự biến đổi ở mức độ phân tử của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR so với dòng tế bảo ung thư đại trực tràng ban đầu HT-29/P. Mối liên quan giữa các con đường tín hiệu nội bào MAPK, AKT trong dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dong té bào HT-29/P ban dau.

Sự biến đổi phân tử kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng té bao HT-29/P ban đầu. Mối liên quan của Caveolin-1 với tính kháng thuốc Selumetinib ở ung thư đại TPG [FÄ HD ¿ostccicpinc nhi há tú ene nnn nena eat anion ene 44 (0:i/9)1e186. Sự thay đổi khả năng đáp ứng thuốc Selumetinib của dòng tế bảo ung thư đại trực tràng kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR so với dòng tế bào ung thư đại trực tràng ban đầu HT-29/P. Su bién déi ở mức độ phân tử của dòng tế bào ung thư đại trực tràng kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR so với dòng tế bảo ung thư đại trực tràng ban đầu HT-29/P.

TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái, kích thước và điều kiện nuôi cây dòng tế bào HT- 29/SR kháng thuốc Selumetinib từ đòng tế bào HT-29/P ban đầu.2: Kết quả đánh giá tỷ lệ tế bào sóng giữa dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib và dòng tế bào HT-29/P ban đầu tiếp xúc với thuốc Selumetinib bằng kỹ thuật MTS M Bảng 3.3: Kết quả đánh giá tỷ lệ tạo khuân lạc giữa dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bảo HT-29/P ban đầu khi tiếp xúc với thuốc Selumetinib ở nồng độ khác nhau.4: Kết quả xác định nồng độ RNA tách từ dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib và dòng tế bào HT-29/P ban đầu.---2-2222-z22222zzz>z 36 VI DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1. Hình ảnh tế bào HT-29 nuôi cây với mật độ tế bào thấp và mật độ tế bào cao. Một số thuốc tác động vào sự phát triển và biệt hóa tế bảo. Tình trạng kháng thuốc ở các phương pháp điều trị ung thư.

Câu trúc nhân của tế bảo. Quy trình tạo dòng tế UTĐTT kháng thuốc Selumetinib HT-29/SR. Đặc điểm kích thước, hình thái và sự phân bố tế bào giữa dòng tế bào HT-29/P ban dau va dong tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib. Tỉ lệ sống của dòng tế bào HT-29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib sau tiếp xúc với thuốc Selumetinib ở các nồng độ khác nhau.

Hình ảnh tạo khuẩn lạc của dòng tế bảo HT-29/P ban đầu và của tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib sau khi tiếp xúc với Selumetinib ở các nồng độ khác nhau.4: Kết quả đánh giá sự biến đổi tín hiệu nội bào MAPK giữa dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu bằng kỹ THunt WGdtbriit:DÌBELo:sscsvissssssststisttosisdhogtEAitdugttdtg3'Gv0t050 01 i250001501801E. Kết quả đánh giá sự biến đổi tín hiệu nội bào AKT1/2 giữa dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bảo HT-29/P ban đầu bằng kỹ thuật Western blot.6: Kết quả đánh giá sự biến đôi phân tử của dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban dau bằng kỹ thuật Westem blot. Kết quả đánh giá sự biến đổi RNA dấn ấn phân tử quyết định tính kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu. Kết quả đánh giá sự biến đổi protein dân ấn phân tử quyết định tính kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib so với đồng tế báo HT-29/P bạn đẦU soccsocntssosEitregsSiOtioSSOOOCiAldQnxntiunsoasg 37 vil TOM TAT NGHIEN CUU Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và bệnh tật trên thế giới (1).

Ngày nay cùng với liệu pháp miễn dịch, liệu pháp điều trị đích được biết đến như là phác đồ điều trị hiệu quả và thích hợp trong điều trị UTĐTT dựa trên đặc điểm gen của từng người bệnh. Thuốc điều trị đích Selumetinib đã và đang được sử dụng trong điều trị thử nghiệm người bệnh UTĐTT có mang đột biến BRAF. Mặc dù vậy, một số lớn người bệnh UTĐTT đã bị kháng thuốc điều trị đích Selumetinib sau một thời gian tiến hành điều trị dẫn tới làm ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị người bệnh UTĐTT. Do vậy, xác định các chỉ thi/d4u ấn sinh học quan trọng có liên quan đến UTĐTT (tế bào HT-29) giúp tăng hiệu quả đáp ứng thuốc điều trị đích Selumetinib từ đó góp phần nâng cao hiệu quả điều trị người bệnh UTĐTT mang đột biến BRAF, cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế phân tử liên quan tới tính kháng thuốc điều trị đích Selumetinib.

Để đánh giá sự thay đổi đáp ứng thuốc Selumetinib của các dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetimb so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu và xác định sự biến đổi ở mức độ phân tử của các dòng tế bào HT-29/P kháng thuốc Selumetinib so với dòng tế bào HT-29/P, chúng tôi đã sử dụng các quy trình kỹ thuật gồm kỹ thuật tạo dòng tế bào kháng thuốc, kỹ thuật nuôi cay tế bào, kỹ thuật MTS, kỹ thuật Western Blot, ky thuật RT- PCR. Trong nghiên cứu này, khi chúng tôi tăng dần nồng độ Selumetinib thì tỉ lệ tế bào sống của dòng tế bào HT-29/P ban đầu giảm, cũng như số lượng khuẩn lạc của dòng tế bào HT-29/P ban đầu giảm, đặc biệt ở dòng té bao HT-29/SR khang thuốc Selumetinib, số lượng khuẩn lạc nhiều hơn ở tất cả các nông độ Selumetinib. Điều này chứng tỏ khả năng đáp ứng thuốc ở dòng tế bảo HT-29/P ban đầu và dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib là khác nhau. Con đường tin hiéu néi bao MAPK (p-MAPK tai Y202/T204) va AKT1/2 (p-AKT1/2 tai S473) ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib tăng mạnh hơn so với dòng tế bao HT-29/P ban đầu.

Hình ảnh tín hiệu protein E-Cadherin ở dòng tế bảo HT-29/P ban đầu mạnh hơn so với dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib. Hình ảnh tín hiệu protein Vimentin thì ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib tăng mạnh hơn so với dòng tế bào HT-29/P ban đầu. Hơn thế nữa, mức độ biểu hiện vill của Caveolin-l của dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib tăng mạnh hơn so với dòng tế bào HT-29/P ban dau, điều nay cho thay Caveolin-1 có thé là đâu ấn phân tử quyết định sự kháng thuốc Selumetinib ở dòng tế bào HT-29/SR kháng thuốc Selumetinib. Thực hiện nghiên cứu xác định khả năng đáp ứng thuốc điều trị đích Selumetinib trên nhiều dòng tế bào UTĐTT, đặc biệt với các dòng tế bào UTĐTT mang đột biến KRAS hoặc BRAF đề làm cơ sở nghiên cứu và đánh giá cơ chế phân tử kháng thuốc Selumetinib ở UTĐTT.

DAT VAN DE Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và bệnh tật trên thế giới (1). Với hơn 1,360,600 trường hợp mắc mới và hơn 693,900 ca tử vong môi năm, UTĐTT hiện đang là loại ung thư phô biến đứng hàng thứ 3 và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 4 trên thế giới (2). Tỷ lệ tử vong do UTĐTT ở các nước Đông Âu, Chau My La Tinh va Chau A đứng hàng đầu trên thế giới (3). Đặc biệt, ở hầu hết các khu vực trên thế giới, tỉ lệ mắc mới và tử vong do UTĐTT ở nam giới thường cao hơn ở nữ giới.

Ở Việt nam, theo số liệu công bố của Tổ chức nghiên cứu ung thư Quốc tế mỗi năm có khoảng 7367 bệnh nhân mắc mới, 4131 bệnh nhân chết do căn bệnh UTĐTT. Tỷ lệ mắc và chết do UTĐTT đứng vị trí thử 4 ở nam, đứng vị trí thử 6 ở nữ (4). Những khác biệt về vị trí địa lý dân đến những khác biệt về chế độ ăn uống và điều kiện môi trường sống, cùng với nền tảng di truyền đã quyết định nguyên nhân gây ung thư hiệu quả cũng như tính kháng thuốc điều trị UTĐTT(4).