Luận Văn Thạc Sĩ Sinh Học: Hoạt Tính Kháng Sinh Và Gây Độc Tế Bào Của Vi Nấm Nội Sinh Trên Cây Thông Đỏ Taxus Chinensis

• Tác giả: Bùi Thị Liên
• Người hướng dẫn: PGS. Phí Quyết Tiến
• Trường học: Vietnam Academy of Science and Technology
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ Taxus chinensis
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY DƯỢC LIỆU
• 1.1.1. Giới thiệu về vi nấm nội sinh
• 1.1.2. Sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh
• 1.1.2.1. Hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm
• 1.1.2.2. Hoạt chất gây độc tế bào ung thư
• 1.1.2.3. Hoạt chất kháng virus
• 1.1.2.4. Cây thông đỏ (Taxus spp. Các chất kháng sinh và gây độc tế bào ung thư từ vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ
• 1.1.2.5. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong sàng lọc vi nấm nội sinh sinh paclitaxel và dẫn xuất của paclitaxel
• 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM VỀ VI NẤM NỘI SINH
• 1.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.3.1. Hóa chất, thiết bị
• 1.3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.3.2.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
• 1.3.2.2. Tách chiết các hoạt chất sinh học thô từ vi nấm nội sinh
• 1.3.3. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư
• 1.3.3.1. Khảo sát khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng tuyển chọn
• 1.3.3.2. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp paclitaxel thông qua sàng các gen chỉ thị
• 1.3.3.3. Xác định đặc điểm hình thái và bào tử của các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn
• 1.3.3.4. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn bằng giải và phân tích trình tự vùng ITS
• 1.3.3.5. Xử lý thống kê số liệu
• 2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 2.1. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ
• 2.2. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH
• 2.3. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ DỊCH CHIẾT THÔ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM
• 2.4. SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH PACLITAXEL CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM
• 2.5. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TQF6, TQF25, TDF6, TDF7
• 2.5.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và cuống sinh bào tử của các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn
• 2.5.2. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn bằng giải và phân tích trình tự ITS
• 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Hoạt tính kháng sinh của vi nấm nội sinh

Nghiên cứu tập trung vào hoạt tính kháng sinh của các chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis). Các chủng nấm này được đánh giá khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh thông qua các thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Kết quả cho thấy một số chủng nấm có khả năng kháng khuẩn mạnh, đặc biệt là đối với các vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Điều này mở ra tiềm năng ứng dụng trong việc phát triển các loại kháng sinh tự nhiên mới, giúp giải quyết vấn đề kháng thuốc kháng sinh hiện nay.

1.1. Cơ chế kháng khuẩn

Các hoạt chất kháng khuẩn được sinh tổng hợp từ vi nấm nội sinh thường thuộc nhóm alkaloid, peptide, và terpenoid. Những hợp chất này có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn bằng cách phá vỡ màng tế bào hoặc ức chế quá trình tổng hợp protein. Ví dụ, hợp chất penicimenolidyu AB từ chủng Penicillium cataractum đã chứng minh hiệu quả kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa.

1.2. Ứng dụng thực tiễn

Việc khai thác hoạt tính kháng sinh từ vi nấm nội sinh không chỉ giúp phát triển các loại thuốc mới mà còn giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường. Các hợp chất này có thể được sử dụng trong nông nghiệp để kiểm soát bệnh cây trồng, thay thế cho các hóa chất độc hại.

II. Hoạt tính gây độc tế bào của vi nấm nội sinh

Nghiên cứu cũng đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các chủng vi nấm nội sinh trên dòng tế bào ung thư như A-549 (ung thư phổi) và MCF7 (ung thư vú). Kết quả cho thấy một số chủng nấm có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư với giá trị IC50 thấp, chứng tỏ tiềm năng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư.

2.1. Cơ chế gây độc tế bào

Các hợp chất gây độc tế bào từ vi nấm nội sinh thường tác động lên quá trình phân chia tế bào hoặc gây ra quá trình apoptosis. Ví dụ, hợp chất paclitaxel được sản xuất bởi các chủng nấm nội sinh trên cây thông đỏ đã được chứng minh có khả năng ức chế sự hình thành vi ống, ngăn cản sự phân chia tế bào ung thư.

2.2. Tiềm năng ứng dụng

Việc phát hiện các hợp chất gây độc tế bào từ vi nấm nội sinh mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị ung thư. Đặc biệt, các hợp chất này có thể được sản xuất với chi phí thấp hơn so với việc chiết xuất trực tiếp từ cây thông đỏ.

III. Phân loại và đặc điểm sinh học của vi nấm nội sinh

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử như giải trình tự gen ITS để phân loại các chủng vi nấm nội sinh. Kết quả cho thấy các chủng nấm được nghiên cứu thuộc các chi Penicillium, Fusarium, và Phomopsis, đây là những chi nấm phổ biến có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học cao.

3.1. Đặc điểm hình thái

Các chủng vi nấm nội sinh được nghiên cứu có đặc điểm hình thái đa dạng, bao gồm khuẩn lạc màu sắc khác nhau và cấu trúc bào tử đặc trưng. Ví dụ, chủng TQF6 có khuẩn lạc màu trắng và bào tử hình cầu, trong khi chủng TDF7 có khuẩn lạc màu xanh lá và bào tử hình elip.

3.2. Phân tích trình tự gen

Phân tích trình tự gen ITS cho phép xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng nấm. Kết quả cho thấy các chủng nấm được nghiên cứu có độ tương đồng cao với các chủng nấm đã được công bố trước đây, chứng tỏ tính chính xác của phương pháp phân loại.

Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh kháng thuốc kháng sinh gia tăng và nguy cơ tuyệt chủng của nhiều loài cây dược liệu quý hiếm, việc tìm kiếm các nguồn hoạt chất sinh học mới từ vi sinh vật nội sinh trở thành hướng nghiên cứu cấp thiết. Vi nấm nội sinh trên cây dược liệu, đặc biệt là cây thông đỏ (Taxus chinensis), được xem là nguồn tài nguyên tiềm năng để khai thác các hợp chất kháng sinh và chất gây độc tế bào ung thư. Cây thông đỏ là loài cây quý hiếm, phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam như Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai, với thời gian phát triển lâu dài trên 35 năm. Paclitaxel, một hoạt chất điều trị ung thư quan trọng, được chiết xuất từ cây thông đỏ nhưng với hiệu suất thấp (khoảng 10 g paclitaxel từ 1 kg vỏ cây), khiến việc khai thác từ vi nấm nội sinh trở thành giải pháp thay thế đầy triển vọng.

Mục tiêu nghiên cứu là tuyển chọn và đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp các hoạt chất kháng sinh và gây độc tế bào ung thư của các chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ tại Hà Giang. Nghiên cứu tập trung vào sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật, đánh giá độc tính tế bào ung thư, khả năng chống oxy hóa, cũng như xác định khả năng sinh tổng hợp paclitaxel thông qua chỉ thị phân tử. Phạm vi nghiên cứu bao gồm 25 chủng vi nấm nội sinh phân lập từ các mẫu cây thông đỏ thu thập năm 2019 tại huyện Quản Bạ và Đồng Văn, tỉnh Hà Giang. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển nguồn nguyên liệu sinh học mới cho ngành dược phẩm, đồng thời góp phần bảo tồn loài cây thông đỏ quý hiếm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên lý thuyết về mối quan hệ cộng sinh giữa vi nấm nội sinh và cây chủ, trong đó vi nấm không gây hại mà còn sản sinh các hợp chất sinh học có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và gây độc tế bào ung thư. Giả thuyết chuyển gen ngang (horizontal gene transfer) được áp dụng để giải thích khả năng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp paclitaxel tương tự cây chủ. Các khái niệm chính bao gồm:

• Vi nấm nội sinh: vi sinh vật cư trú trong mô tế bào thực vật không gây hại.
• Hoạt tính kháng sinh: khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh.
• Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: khả năng ức chế hoặc tiêu diệt tế bào ung thư.
• Chỉ thị phân tử: sử dụng gen ts, dbat, bapt làm dấu hiệu sinh tổng hợp paclitaxel.
• Phân loại vi nấm dựa trên đặc điểm hình thái và trình tự gen ITS.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm 25 chủng vi nấm nội sinh phân lập từ cây thông đỏ tại Hà Giang năm 2019, cùng các chủng vi sinh vật kiểm định và dòng tế bào ung thư A-549 (ung thư phổi) và MCF-7 (ung thư vú). Phương pháp phân tích bao gồm:

• Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch, đo đường kính vòng kháng khuẩn.
• Tách chiết hoạt chất sinh học thô bằng ethyl acetate từ dịch nuôi cấy vi nấm.
• Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro theo phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB), tính IC50.
• Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa qua khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH.
• Sàng lọc khả năng sinh paclitaxel bằng PCR khuếch đại gen chỉ thị ts, dbat, bapt.
• Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và phân loại vi nấm bằng giải trình tự gen ITS.
• Cỡ mẫu: 25 chủng vi nấm, chọn lọc 4 chủng tiềm năng cho phân tích sâu.
• Phân tích số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2016, tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn.

Thời gian nghiên cứu kéo dài từ năm 2019 đến 2021, tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Hoạt tính kháng sinh: Trong 25 chủng vi nấm nội sinh, 12 chủng (48%) có khả năng ức chế ít nhất một chủng vi sinh vật kiểm định. Tỷ lệ kháng cao nhất là với Staphylococcus epidermidis kháng methicilin (MRSE) chiếm 36%, tiếp theo là Bacillus cereus chiếm 32%. Bốn chủng TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 thể hiện phổ kháng rộng với đường kính vòng kháng khuẩn từ 7 đến 30 mm.

2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Cao chiết từ 4 chủng vi nấm tiềm năng cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư A-549 và MCF-7 khác nhau. Chủng TDF7 có tỷ lệ ức chế tế bào A-549 đạt 93,91% và MCF-7 đạt 89,22%, với IC50 lần lượt là 13,4 µg/mL và 17,82 µg/mL. Chủng TDF6 cũng có hoạt tính cao với IC50 7,61 µg/mL trên A-549 và 16,92 µg/mL trên MCF-7. Hai chủng TQF6 và TQF25 có hoạt tính gây độc tế bào thấp hơn 50%.

3. Hoạt tính chống oxy hóa: Cao chiết tổng của 4 chủng vi nấm có khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH cao, tăng theo nồng độ. Ở nồng độ 400 µg/mL, hoạt tính loại bỏ gốc tự do của TQF6 và TQF25 đạt trên 93%, TDF6 đạt 89%, trong khi TDF7 thấp hơn với 60,71%.

4. Khả năng sinh tổng hợp paclitaxel: Kết quả PCR cho thấy gen dbat được khuếch đại thành công ở 3 chủng TQF6, TQF25, TDF6; gen bapt chỉ xuất hiện ở TQF25. Chủng TDF7 không có gen chỉ thị paclitaxel, khẳng định không sinh paclitaxel nhưng vẫn có tiềm năng sinh các hoạt chất sinh học khác.

5. Phân loại vi nấm: Dựa trên đặc điểm hình thái và giải trình tự gen ITS, 4 chủng được định danh gồm Neofusicoccum italicum (TQF6), Hypoxylon sp. (TQF25), Fusarium sp. (TDF6 và TDF7). Các chủng này thuộc các chi nấm có tiềm năng sinh tổng hợp các hợp chất sinh học đa dạng.

Thảo luận kết quả

Hoạt tính kháng sinh của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ tại Hà Giang cao hơn so với một số nghiên cứu trên cây thông đỏ ở Nepal và các cây dược liệu khác, cho thấy tiềm năng khai thác nguồn vi nấm bản địa. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh của chủng TDF6 và TDF7 tương đồng với các nghiên cứu quốc tế về nấm nội sinh trên cây thông đỏ và các cây dược liệu khác, góp phần mở rộng nguồn nguyên liệu cho dược phẩm chống ung thư.

Khả năng chống oxy hóa cao của các chủng vi nấm cũng đồng nhất với các báo cáo về vi nấm nội sinh sản xuất các chất chống oxy hóa tự nhiên, có thể hỗ trợ trong điều trị các bệnh liên quan đến stress oxy hóa. Việc phát hiện gen dbat và bapt trong một số chủng vi nấm khẳng định giả thuyết chuyển gen ngang và khả năng sinh tổng hợp paclitaxel của vi nấm nội sinh, mở ra hướng nghiên cứu sản xuất paclitaxel quy mô công nghiệp với chi phí thấp hơn.

Phân loại vi nấm dựa trên gen ITS và hình thái học giúp xác định chính xác các chủng tiềm năng, đồng thời cung cấp cơ sở cho nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm sinh học và ứng dụng của từng chủng. Các dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tỉ lệ chủng vi nấm có hoạt tính kháng sinh, biểu đồ IC50 gây độc tế bào ung thư và biểu đồ hoạt tính chống oxy hóa theo nồng độ cao chiết.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tăng cường nghiên cứu và phát triển quy trình nuôi cấy tối ưu nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp paclitaxel và các hoạt chất sinh học từ các chủng vi nấm nội sinh tiềm năng, đặc biệt là TQF6, TQF25 và TDF6. Thời gian thực hiện dự kiến 1-2 năm, do các viện nghiên cứu sinh học phân tử và công nghệ sinh học chủ trì.

2. Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế các hợp chất sinh học từ vi nấm nội sinh để phục vụ nghiên cứu tiền lâm sàng và phát triển thuốc, tập trung vào các chủng có hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào cao như TDF7. Thời gian 1 năm, phối hợp giữa viện nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm.

3. Mở rộng khảo sát đa dạng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ và các cây dược liệu khác tại các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam nhằm khai thác nguồn gen đa dạng và tiềm năng sinh học phong phú. Thời gian 2-3 năm, do các trường đại học và viện nghiên cứu thực hiện.

4. Phát triển công nghệ sinh học phân tử và bioinformatics để sàng lọc nhanh các chủng vi nấm có khả năng sinh paclitaxel và các hợp chất sinh học khác, giảm chi phí và thời gian nghiên cứu. Thời gian 1-2 năm, do các trung tâm công nghệ sinh học và tin sinh học đảm nhiệm.

5. Tăng cường hợp tác quốc tế và đào tạo nguồn nhân lực chuyên sâu về vi nấm nội sinh và công nghệ sinh học nhằm nâng cao năng lực nghiên cứu và ứng dụng trong nước. Chủ thể thực hiện là các cơ sở đào tạo và viện nghiên cứu, thời gian liên tục.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học, công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp dữ liệu thực nghiệm chi tiết về vi nấm nội sinh, phương pháp phân tích hoạt tính sinh học và phân loại vi nấm, hỗ trợ nghiên cứu chuyên sâu và phát triển đề tài mới.

2. Doanh nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học: Thông tin về tiềm năng sinh tổng hợp paclitaxel và các hợp chất kháng sinh từ vi nấm nội sinh giúp doanh nghiệp phát triển sản phẩm mới, tối ưu quy trình sản xuất và giảm chi phí nguyên liệu.

3. Cơ quan quản lý và bảo tồn tài nguyên thiên nhiên: Nghiên cứu góp phần bảo tồn loài cây thông đỏ quý hiếm thông qua khai thác vi nấm nội sinh thay thế, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho chính sách bảo vệ đa dạng sinh học.

4. Chuyên gia y học và lâm sàng: Các kết quả về hoạt tính gây độc tế bào ung thư và chống oxy hóa từ vi nấm nội sinh mở ra hướng ứng dụng trong phát triển thuốc điều trị ung thư và các bệnh liên quan đến stress oxy hóa.

Câu hỏi thường gặp

1. Vi nấm nội sinh là gì và tại sao chúng quan trọng trong nghiên cứu dược liệu?
   Vi nấm nội sinh là vi sinh vật sống bên trong mô tế bào thực vật mà không gây hại. Chúng quan trọng vì có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất sinh học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư, giúp khai thác nguồn dược liệu mới mà không làm tổn hại cây chủ.

2. Phương pháp nào được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng sinh của vi nấm nội sinh?
   Phương pháp đục lỗ thạch được áp dụng, trong đó dịch nuôi cấy vi nấm được đưa vào giếng trên môi trường thạch chứa vi sinh vật kiểm định, sau đó đo đường kính vòng kháng khuẩn để đánh giá hiệu quả.

3. Làm thế nào để xác định vi nấm nội sinh có khả năng sinh paclitaxel?
   Sử dụng kỹ thuật PCR khuếch đại các gen chỉ thị như ts, dbat, bapt liên quan đến con đường sinh tổng hợp paclitaxel. Sự hiện diện của các gen này cho thấy khả năng sinh paclitaxel của vi nấm.

4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được đánh giá như thế nào?
   Được xác định bằng phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB) trên các dòng tế bào ung thư A-549 và MCF-7, tính IC50 để xác định nồng độ ức chế 50% sự phát triển tế bào.

5. Tại sao việc nghiên cứu vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ lại có ý nghĩa bảo tồn?
   Bởi vì cây thông đỏ là loài quý hiếm, dễ bị khai thác quá mức. Khai thác vi nấm nội sinh giúp tạo nguồn nguyên liệu thay thế, giảm áp lực lên cây chủ, góp phần bảo tồn đa dạng sinh học và phát triển bền vững.

Kết luận

• Đã tuyển chọn 4 chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ có hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào ung thư cao, trong đó TDF6 và TDF7 thể hiện hoạt tính mạnh nhất.
• Gen chỉ thị sinh tổng hợp paclitaxel dbat và bapt được phát hiện ở một số chủng, khẳng định khả năng sinh paclitaxel của vi nấm nội sinh.
• Hoạt tính chống oxy hóa của các chủng vi nấm nội sinh cũng rất đáng chú ý, mở rộng ứng dụng trong y học.
• Phân loại vi nấm dựa trên đặc điểm hình thái và gen ITS giúp xác định chính xác các chủng tiềm năng.
• Nghiên cứu tạo nền tảng cho phát triển công nghệ sinh học sản xuất paclitaxel và các hợp chất sinh học từ vi nấm nội sinh, đồng thời góp phần bảo tồn cây thông đỏ quý hiếm.

Hành động tiếp theo: Tối ưu quy trình nuôi cấy và chiết xuất, mở rộng khảo sát đa dạng vi nấm nội sinh, phát triển công nghệ sinh học phân tử để ứng dụng trong sản xuất dược phẩm. Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp được khuyến khích hợp tác để khai thác tiềm năng này.