ĐẶT VẤN ĐỀ Việc sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống để nghiên cứu về vi sinh vật đã gặp phải sự giới hạn. Đã có đánh giá chỉ ra rằng có 99% vi sinh vật không thể nuôi cấy một cách dễ dàng. Nhiều vấn đề khác nhau mà người nghiên cứu phải đối mặt nổ lực trong suốt quá trình để nuôi cấy vi sinh vật. Hơn mười năm qua, “Metagenomics” là một kỹ thuật phân tích bộ gen của các vi sinh vật không dựa vào bước nuôi cấy, kỹ thuật này đã phát triển và khắc phục một số khó khăn.
Đất được xem như là một môi trường phức tạp, nó dự trữ nguồn đa dạng vi sinh vật chính yếu. Việc tiếp cận kỹ thuật Metagenomic hứa hẹn làm tăng hiệu quả tiếp cận nguồn gen chứa trong đất. Ứng dụng Metagenomics Một vài vi sinh vật có thể giảm thiểu những sản phẩm phế thải, làm ra những thuốc mới cho những ứng dụng trong y dược, sản xuất nhựa thân thiện với môi trường, hay thận chí làm ra một vài thực phẩm cho chúng ta ăn. Bằng sự phân lập DNA từ những vi sinh vật này, nó cung cấp chúng ta cơ hội lạc quan áp dụng những phương pháp của chúng vào sử dụng trong cuộc sống.
Một giá trị ứng dụng khác của Metagenomics là nó cung cấp năng suất một cách hiệu quả đặc tính và tính di truyền đa dạng hiện diện trong nước, đất và dạ dày, không kể đến những mẫu nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Metagenomics là một lĩnh vật mới và thú vị về sinh học phân tử. Nó dần được phát triển kỹ thuật hiện đại để hiểu sâu về đa dạng sinh học. Trong đề tài này chúng ta chỉ quan tâm đế n gen endo-β-1,4-glucanase (endoglucanase, CMCase) từ Metagenomic đấ t với khả năng phân giải nguyên liê ̣u gỗ vu ̣n nhằ m ta ̣o ra sản phẩ m ứng du ̣ng cao như trong thực phẩ m , chấ t tẩ y , ngành vải hay nhiên liệu biofeul.
SVTH : Lạc Kiện Hỷ 7 Công nghệ vi sinh Khóa luận tốt nghiệp năm 2011 PHẦN I TỔNG QUAN SVTH : Lạc Kiện Hỷ 8 Công nghệ vi sinh Khóa luận tốt nghiệp năm 2011 1. KHÁI NIỆM METAGENOMIC 1.1 Giới thiệu : Metagenomics là gì ? Được đúc kết bởi Handelsman và những thành viên trong trường đại học Wisconsin, khoa bệnh lý thực vật trong năm 1982, Metagenomics là lĩnh vực nghiên cứu mới nó cho phép nghiên cứu bộ gen được thu về từ mẫu môi trường. Metagenomics có thể định nghĩa là “sự áp dụng những kỹ thuật genomic hiện đại để nghiên cứu về cộng đồng vi sinh vật một cách trực tiếp trong môi trường sống tự nhiên của chúng”, đường tắc để phân lập và sự nuôi cấy cá thể loài vi sinh vật trong phòng thí nghiệm. Kỹ thuật Metagenomic phân tích hỗn hợp bộ gen vi sinh vật không dựa vào sự nuôi cấy.
[15] Phương pháp Metagenomics đã được phát triển như là công cụ đắt lực cho sự khám phá những sản phẩm sinh học mới và chức năng của vi sinh vật. Nó có thể được mô tả như là sự áp dụng của những công nghệ gemomic thích hợp để loại bỏ công đoạn nuôi cấy vi sinh vật. Khởi đầu của sự nghiên cứu về DNA cổ xưa và hệ vi sinh vật chưa qua nuôi cấy là những mồi mục tiêu mà phương pháp Metagenomics thực hiện. Tuy nhiên, ngày nay, kỹ thuật được áp dụng trong việc nghiên cứu những sự đa dạng tập hợp vi sinh vật như là hệ vi sinh vật vùng biển sâu, vi sinh vật đất và hệ sinh thái tiêu hóa của con người và động vật.
Nhiều cuộc nghiên cứu chứng tỏ chỉ 0,001 – 0,1% tổng số vi sinh vật trong nước biển, 0,25% trong nước sạch, 0,25% trong trầm tích và chỉ 0,3% số vi sinh vật trong đất có thể được nuôi cấy trong ống nghiệm. những nghiên cứu hiện hành của kỹ thuật Metagenomic đã có một tiến triển lớn lao nhờ những cấu trúc vector tạo dòng gen hiệu quả như là nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (BACs) hay cosmids. Nó cho phép tạo dòng và biểu hiện những đoạn DNA lớn và phức tạp. [15] SVTH : Lạc Kiện Hỷ 9 Công nghệ vi sinh Khóa luận tốt nghiệp năm 2011 Sự đa dạng vi sinh vật toàn cầu hiện diện với số lượng lớn, phần lớn chưa định danh được tính di truyền và tính sinh hóa chung mà có thể khai thác cho việc nghiên cứu những gen mới, những phân tử sinh học cho con đưuờng biến dưỡng và những sản phẩm với giá tri khác nhau.
Mặt dù tính quan trọng rõ ràng của vi sinh vật, nhưng chỉ rất ít sự hiểu biết về sự đa dạng của chúng. Ví dụ là có bao nhiêu loài hiện diện trong môi trường và mỗi loài có chức năng gì đối với sinh thái mà chúng đang sống? Cho đến gần đây, không có một kỹ thuật thích hợp nào có thể dùng được để trả lời những câu hỏi quan trọng này. Bởi do sự giới hạn trong việc nuôi cấy vi sinh vật. Theo phương pháp truyền thống nuôi cấy vi sinh vật trong thì sự phân tích sẽ bị giới hạn trong điều kiện phòng thí nghiệm.2 Công nghệ Metagenomic : Phương pháp thực hiện.
Metagenomics mang ý nghĩa của sự nghiên cứu có hệ thống phân loại và tận dụng toàn bộ vật liệu di truyền được phân tách từ mẫu thu được trong môi trường sống. Phương pháp thực hiện bao gồm sự phân tách DNA từ những nguồn môi trường và tạo dòng chúng vào vectors. Để tăng bản sao bằng việc nuôi cấy vi sinh vật chứa vector tạo dòng đó. Phương pháp Metagenomics dựa vào tính hiệu quả của 3 bước chính : 1.
Sự chuẩn bị mẫu và sự tách chiết acids nucleic 2. Tạo thư viện 3. Phân tích thư viện Metagenomics ❖ Sự chuẩn bị mẫu và tách chiết acids nucleic Trong phương pháp Metagenomics. Những mẫu có thể từ bất kỳ môi trường nào, đất hay môi trường sống kể cả hệ thống sinh thái trong ruột.
Một cách rõ ràng, cộng đồng vi sinh vật đất là hỗn hợp vi sinh vật thái cổ, vi khuẩn và sinh vật nguyên sinh, thể hiện sự đa dạng đặc tính thành tế bào và sự khác nhau về tính tan của chúng. Vì thế, cần có mộ yêu cầu kỹ thuật đặc biệt được cho việc tách chiết đối với chúng. Mặc dù, những kit khác nhau đã được thương mại sẵn sàng SVTH : Lạc Kiện Hỷ 10 Công nghệ vi sinh Khóa luận tốt nghiệp năm 2011 cho sự tách chiết DNA từ mẫu môi trường. Nhiều phòng thí nghiệm đã phát triển những phương pháp tách chiết riêng của họ với mục đích tách chiết được khả quan và giảm bớt khuynh hướng tan thất thường của các thành viên khác nhau trong cộng đồng vi sinh vật đất.
Có hai loại kỹ thuật tách chiết : 1. Trực tiếp, tại chỗ, việc tách chiết nơi mà những tế bào được hòa tan ngay trong mẫu đất và sau đó DNA được thu lại 2. Gián tiếp, kỹ thuật tách chiết nơi mà những tế bào được tách từ đất và sau đó được làm tan để thu nhận DNA. Đất là một phức hỗn hợp đặc biệt chứa đựng nhiều chất như humics acids.
Nó có thể được ly trích phụ trong suốt quá trình phân tách DNA. Việc loại bỏ humics acids là cần thiết trước khi DNA có thể được tiến hành các bước tách chiết tiếp theo. Với mục đích này, việc sắp xếp những kỹ thuật trong việc tinh sạch DNA đã được phát triển. Sephadex G-200 ly tâm đã tỏ ra là một trong các hướng tốt nhất để loại bỏ các chất ô uế từ DNA đất.
Gần đây, lĩnh vực điện di sử dụng 2 pha thạch agarose, trong đó có một pha chứa polyvinylpyrrolidone, được phát triển để loại bỏ humics.3 Cộng đồng vi sinh vật đất và kỹ thuật Metagenomic Đất là một môi trường phức tạp, nó là kho dữ trữ chủ yếu về đa dạng di truyền vi sinh vật. Đất được chiếm ưu thế bởi pha rắn và những vi sinh vật định cư liên kết với tiền tố đất, chẳng hạn với những phức chất hữu cơ đất sét. Những vi sinh vật có thể được tìm thấy như là những tế bào đơn hoặc là những tập đoàn vi sinh vật. Biến đổi của chúng và những tác động qua lại với những sinh vật khác và với tiền tố đất đã dựa trên những điều kiện sống ở cấp độ vi mô, nó thường khác nhau giữa các môi trường sống vi mô dù chỉ cách nhau một khoảng cách rất nhỏ.
Môi trường sống vi mô cho những vi sinh vật đất bao gồm những vi lỗ và những bề mặt tập hợp đất với thành phần và những kích thước khác nhau.[15] SVTH : Lạc Kiện Hỷ 11 Công nghệ vi sinh Khóa luận tốt nghiệp năm 2011 Sự đa dạng vi sinh vật đất vượt trội hơn các môi trường khác và nhiều hơn những vi sinh vật nhân thật. một gram đất có thể chứa lên tới 10 tỷ vi sinh vật với hàng nghìn loài khác nhau. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật đất đã được đánh giá xác định bởi sự tái tổ hợp DNA, chưa kể đến sự có mặt của những bộ gen hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá, như những phân tích đã chỉ ra rằng kích thước gen chung của đất tương đương 6.000 bộ gen của E.[15] Trong khi phân tích kết quả tái tổ hợp của tổng thể DNA vi khuẩn trong 30 g mẫu đất đã được báo cáo rằng nó chứ đựng hơn 500. Những kết quả này làm sáng tỏ về tính đa dạng di truyền của metagenome đất là dồi dào và đa phần chưa phát hiện hết những nguồn enzyme công nghiệp mới và phức tạp có hoạt tính sinh học.
Chỉ đếm sơ một nơi về tính đa dạng vi sinh vật đất thì nó đã gồm từ 3.000 bộ gen/1 gam đất với ít hơn 1% có thể nuôi cấy được thông qua những kỹ nghệ, đây là khái quát tương tự đối với nhiều nguồn vi sinh vật khác. Nuôi cấy để phân tích những vi sinh vật đã tỏ ra rằng chúng là nguồn dồi dào về những phức hợp liệu pháp mới như là kháng sinh, kháng ung thư, tăng hệ miễn dịch, mở rộng giá trị sản phẩm công nghệ sinh học. Tuy nhiên, sự tiếp cận dựa vào nuôi cấy bị giới hạn bởi phần lớn vi sinh vật hiện diện trong đất không thể được nuôi cấy dưới các điều kiện của phòng thí nghiệm. [15] SVTH : Lạc Kiện Hỷ 12 Công nghệ vi sinh Khóa luận tốt nghiệp năm 2011 1.