Tổng quan luận án
Đại dương chiếm hơn 70% diện tích bề mặt trái đất và chứa đựng gần 300.000 loài sinh vật biển. Nguồn tài nguyên này cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và hóa dược thông qua các hợp chất có hoạt tính sinh học phong phú. Vùng biển Việt Nam có diện tích trên 1 triệu km², đặc trưng bởi khí hậu nhiệt đới gió mùa và hệ thống cửa sông dày đặc, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của hệ sinh vật biển đa dạng về thành phần loài và sinh khối. Mặc dù các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển tại Việt Nam đã bắt đầu từ những năm 1970, số lượng công trình nghiên cứu về ngành Da gai (Echinodermata) nhìn chung còn hạn chế và tản mạn.
Ngành Da gai gồm 5 lớp chính: Sao Biển (Asteroidea), Sao Biển Rắn (Ophiuroidea), Cầu Gai (Echinoidea), Hải Sâm (Holothuroidea) và Huệ Biển (Crinoidea). Trong đó, lớp Sao biển là nguồn cung cấp dồi dào các dẫn xuất steroid phân cực mang nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, giảm đau, hạ huyết áp, chống khối u, chống vi rút, tan máu và tác động lên sự dẫn truyền tín hiệu thần kinh. Tại Việt Nam, trước thời điểm thực hiện luận án, chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu chuyên biệt và toàn diện về lớp chất steroid phân cực từ sao biển.
Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định là sự thiếu vắng các khảo sát chuyên sâu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nhóm steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus sinh sống tại vùng biển Việt Nam, dù đây là loài phân bố rất phổ biến. Nhằm tạo cơ sở cho việc tìm kiếm và phát triển các dược phẩm mới từ sinh vật biển, luận án xác định mục tiêu nghiên cứu thông qua ba nội dung cụ thể:
- Phân lập các hợp chất steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus thu thập tại Việt Nam.
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ hiện đại và biến đổi hóa học.
- Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án:
- Đối tượng nghiên cứu: Loài sao biển Archaster typicus Muller & Troschel, 1840, thuộc họ Archasteridae, bộ Valvatida, lớp Sao biển (Asteroidea), ngành Da gai (Echinodermata).
- Phạm vi không gian: Vùng biển ven bờ tỉnh Quảng Ninh, Việt Nam (nền đáy cát mịn ven đảo, độ sâu 0–50 m, độ mặn cao và ổn định).
- Phạm vi thời gian: Mẫu vật sinh học được thu thập vào tháng 08 năm 2008.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Theo các tài liệu phân loại học, lớp Asteroidea gồm 7 bộ: Brisingida, Forcipulatida, Notomyotida, Paxillosida, Spinulosida, Valvatida và Velatida, với khoảng 1.800 loài phân bố trên toàn cầu. Riêng vùng biển Việt Nam ghi nhận khoảng 60 loài sao biển. Loài Archaster typicus được Lamarck mô tả năm 1816, thuộc bộ Valvatida (gồm 14 họ) và nằm trong họ Archasteridae – một họ nhỏ chỉ có một chi duy nhất là Archaster với 3 loài: Archaster angulatus, Archaster laevis và Archaster typicus.
Về mặt hóa học, trên thế giới đã có khoảng 80 loài sao biển được nghiên cứu thành phần hóa học, với hơn 200 hợp chất được phân lập. Trong đó, trên 50% số hợp chất thuộc lớp steroid, trên 20% là ceramide (cerebroside), cùng một số alkaloid và axit béo. Nhóm steroid phân cực từ sao biển được phân chia thành 4 nhóm cấu trúc chính:
-
Polyhydroxy steroid: Trước năm 2000, nhóm chất này đã bắt đầu được công bố và tiếp tục được mở rộng sau đó với khoảng 50 hợp chất mới. Năm 2003, Wang và cộng sự phân lập 13 polyhydroxy steroid mới (certonardosterol A–M, đánh số 1–13) từ loài Certonardoa semiregularis tại đảo Komun, Hàn Quốc. Năm 2004, nhóm tác giả này phân lập thêm 23 dẫn xuất mới (14–36), bao gồm nhóm tetrol hiếm gặp (14, 15, 19–21), các dẫn xuất chứa nhóm xeton tại vị trí C-8 (25–31) và liên kết đôi tại C-8/C-14 (28–31). Levina E.V. và cộng sự (2004) phân lập hợp chất steroid liên kết với triseramide (37) từ loài Astropecten triseriatus ở Fiji; Finamore E. và cộng sự tìm thấy hợp chất tương tự ở loài Myxoderma platyacantum. Nhóm nghiên cứu của Stonik và cộng sự (2002–2005) tại Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC, LB Nga) công bố các polyhydroxy steroid từ các loài sao biển vùng Viễn Đông: hợp chất 38–39 từ Henricia sanguinolenta và H. leviuscula (hợp chất 38 chứa khung 3β,6β,15β-trihydroxy steroid, hợp chất 39 có nhóm C-15 xeton); hợp chất 40–41 từ Henricia tumida; phrygiasterol (42) chứa vòng cyclopropan từ Hippasteria phrygiana; các dẫn xuất 43–44 và 45 từ Henricia leviuscula (Kicha A. và cs); hợp chất 46 chứa nhóm 15,16-isopropylidenedioxy từ Asterina pectinifera tại Thanh Đảo, Trung Quốc.
-
Steroid sulfate: Năm 2001, các nhà khoa học Nga phân lập 3 dẫn xuất cholesterol sulfate từ hai loài Leptasterias alaskensis asiatica và L. fisheri, trong đó cholesterol sulfate (47) chiếm tỷ lệ lần lượt là 53,4% và 37,8%, cùng với 5α-cholestan-3β-ol sulfate (48) và 5α-cholestan-7-ene-3β-ol sulfate (49). Từ loài Lethasterias nanimensis chelifera, các cặp ion alkaloid steroid (50–52) gồm cation alkaloid và anion steroid cùng các muối sulfate và muối tyrammonium (53–58) được tinh chế. Tại Trung Quốc, nghiên cứu trên loài Asterias amurensis thu được các muối sulfate 47, 53, 55, 59, 60 và 61. Các polyhydroxy steroid sulfate mang nhóm sulfate ở mạch nhánh hoặc ở nhân steroid tiếp tục được tìm thấy ở Henricia leviuscula (62–63), Hippasteria phrygiana (58), Trofodiscus uber (61), Ctenodiscus crispatus (62, 66–68), Hippasteria kurilensis (69: 6-O-sulfated heptaol), Pteraster pulvillus (70–73), Diplopteraster multiples (74), Pteraster obscurus và Asteronyx loveni (75–78: disulfate tại C-3 và C-21), và Plazaster borealis (79: trihydroxy steroid disulfate có cả 2 nhóm sulfate gắn vào nhân 4 vòng).
-
Glycoside polyhydroxy steroid: Palagiano và cộng sự (1996) phân lập 20 glycoside từ loài Henricia downeaye ở Mexico. Wang và cộng sự công bố certonardosides A–J (80–89) và certonardosides K–N (90–93) từ loài Certonardoa semiregularis; nhóm tác giả Trung Quốc bổ sung thêm certonardosides 94–103. Từ loài Linckia laevigata tại Nhật Bản, 16 glycoside mới (linckoside A–K, M–Q, 106–121) và granulatoside A (122) được xác định; cũng trên loài này thu thập tại vùng biển Việt Nam, Kicha và cộng sự phân lập linckosides L1–L7 (123–129); Qi và cộng sự phân lập linckosides L3–L6 ở Okinawa. Các glycoside khác gồm minutosides A–B (130–131) từ Anasterias minuta; lysastroside A (132) từ Lysastrosoma anthosticta; sanguinosides A–C (133–135) từ Henricia sanguinolenta và H. leviuscula; phrygiosides A–B (136–137) từ Hippasteria phrygiana; asperosides A–B (138–139) và tumidosides A–B (140–141) từ Henricia aspera và H. tumida; các hợp chất 142–145 từ Patiria pectinifera, Aphelasterias japonica, Asterias rathbuni; milleporosides A–B (146–147) từ Fromia milleporella; trofosides A–B (148–149) từ Trofodiscus uber; leviusculoside J (150); fuscasides A–B (151–152) từ Lethasterias fusca; heffernanosides A–C (157–159) từ Celerina heffernani; kurilensosides A–D (163–166) từ Hippasteria kurilensis.
-
Asterosaponine: Năm 2005, Tang H.F. và cộng sự phân lập novaeguinosides A, I, II (167–169) và 170–173 từ Culcita novaeguineae, trong đó novaeguinoside A chứa mạch 5 phân tử đường đơn (quinovose, fucose, xylose, glucose, galactose), còn hợp chất 169 chứa L-arabinosyl. Các hợp chất khác gồm anasterosides A–B (174–175) từ Anasterias minuta; luidiaquinoside (176) từ Luidia quinaria; psilasteroside (177) từ Psilaster cassiope; ruberosides E–G (178–180) từ Asterias rubens; hợp chất 181–182 từ Novodinia antillensis.
| STT |
Hoạt tính sinh học |
Nhóm chất |
Loài sao biển chứa hợp chất có hoạt tính |
Tài liệu tham khảo |
| 1 |
Gây độc tế bào |
Polyhydroxy steroid, steroid sulfate, glycoside polyhydroxy steroid, asterosaponine |
Certonardoa semiregularis, Hippasteria phrygiana, Luidia quinaria, Anthenea chinensis |
[16], [21], [62], [79], [102], [108–111] |
| 2 |
Kháng khuẩn, kháng nấm |
Polyhydroxy steroid, steroid sulfate, glycoside polyhydroxy steroid, asterosaponine |
Certonardoa semiregularis, Anasterias minuta |
[12], [13], [110], [111] |
| 3 |
Tán huyết |
Polyhydroxy steroid, glycoside polyhydroxy steroid, asterosaponine |
Henricia leviuscula, Culcita novaeguineae |
[33], [40], [67], [101] |
| 4 |
Kích thích tế bào thần kinh (neuritogenic) |
Glycoside polyhydroxy steroid |
Linckia laevigata |
[23], [24], [46], [81], [85–87] |
| Hợp chất |
IC50 (µM) trên dòng A549 |
IC50 (µM) trên dòng SK-OV-3 |
IC50 (µM) trên dòng KS-MEL-2 |
IC50 (µM) trên dòng XF498 |
IC50 (µM) trên dòng HCT15 |
| 14 |
0,15 |
0,08 |
0,09 |
0,07 |
0,01 |
| 16 |
0,82 |
0,90 |
0,40 |
0,43 |
1,25 |
| 19 |
0,48 |
0,83 |
0,28 |
0,40 |
1,26 |
| 20 |
0,54 |
0,69 |
0,40 |
0,33 |
0,73 |
| 21 |
1,75 |
1,51 |
0,48 |
1,22 |
1,25 |
| 22 |
0,15 |
0,16 |
<0,10 |
0,08 |
0,25 |
| 30 |
0,43 |
0,22 |
0,17 |
0,12 |
0,48 |
| Doxorubicin (chất chuẩn) |
0,04 |
0,12 |
0,05 |
0,12 |
0,18 |
Về loài Archaster typicus, năm 1986, Riccio và cộng sự đã phân lập 9 hợp chất polyhydroxy steroid (đánh số từ 1 đến 7), bao gồm các dẫn xuất nonaol, octaol, heptahydroxy và các dạng sulfate hóa. Năm 1989, Riccio và cộng sự công bố thêm 3 polyhydroxy steroid (10, 11, 12). Tại Việt Nam, năm 2007, nhóm tác giả Châu Văn Minh phân lập 7 hợp chất ký hiệu SB1–SB7: Cholest-7-en-3-on (SB1), Cholesterol (SB2), Batilol (SB3), Ergost-22-en-3β,4β,5α,6α,8β,14α,15α,22E,24R,25R,26-nonol (SB4), 27-Norcholestan-3β,4β,5α,6α,8β,14α,15α,24R-octol (SB5), 27-Norcholestan-3β,4β,5α,6α,7β,8β,14α,15α,24R-nonol (SB6) và cerebroside SB7. Trong đó, hợp chất SB7 thể hiện độc tính tế bào trên hai dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư phổi Lu.
Khoảng trống được luận án lựa chọn giải quyết: Các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam về loài Archaster typicus chỉ mới dừng lại ở khảo sát sơ bộ thành phần hóa học chung mà chưa đi sâu nghiên cứu một cách có hệ thống về phân lập, xác định cấu trúc lập thể và đánh giá hoạt tính sinh học của lớp chất steroid phân cực.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về hóa học các hợp chất thiên nhiên biển, lý thuyết phân loại học động vật ngành Da gai và mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học với hoạt tính sinh học (SAR) của steroid phân cực. Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học Nga, hoạt tính gây độc tế bào của polyhydroxy steroid có xu hướng tỷ lệ nghịch với số lượng nhóm -OH ở phần aglycon; đồng thời có mối tương quan giữa độc tính tế bào và khả năng làm tan máu của các phân tử steroid gắn đường, phụ thuộc vào nồng độ muối, nhiệt độ và giá trị pH môi trường.
Phương pháp thực nghiệm của luận án kết hợp các kỹ thuật chiết tách, sắc ký, phổ nghiệm hóa lý hiện đại và các mô hình sinh học in vitro:
-
Phương pháp phân lập và tinh chế:
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 (Merck) và bản mỏng Sorbpolimer của Nga (kích thước 4,5 cm × 6,0 cm, cỡ hạt 5–17 μm). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc phun thuốc thử dung dịch H2SO4/EtOH 5% rồi sấy nóng hiện màu.
- Sắc ký cột Polychrome: Cột có đường kính Φ = 70 mm, chiều dài L = 260 mm, sử dụng nước cất (11 lít) để khử muối vô cơ, kiểm tra bằng dung dịch AgNO3 1N cho đến khi dịch rửa giải không còn xuất hiện kết tủa trắng, sau đó dùng cồn etanol (7 lít) để rửa giải giải phóng phân đoạn hữu cơ.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC): Thực hiện trên hệ thống Agilent 1100, sử dụng cột bán điều chế Diasfer-110-C18 (10 μm, 250 × 15 mm) và cột phân tích (0,4 × 250 mm), tốc độ dòng 2,5 ml/phút, pha động gồm các hệ dung môi EtOH/H2O hoặc EtOH/H2O/1N NH4OAc với các tỷ lệ thể tích khác nhau.
-
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
- Phổ khối lượng phân giải cao (HR ESI-MS): Đo trên thiết bị Agilent 6510 Q-TOF LC/MS tại Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), Phân viện Viễn Đông, Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker DRX 500 (500 MHz đối với 1H và 125,8 MHz đối với 13C), sử dụng Tetramethylsilane (TMS) làm chất chuẩn nội. Các kỹ thuật phổ bao gồm 1D-NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 90°, DEPT 135°) và 2D-NMR (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, TOCOSY, NOESY). Dung môi đo phổ gồm CD3OD, CDCl3 và Pyridin-d5.
- Sắc ký khí (GC): Thực hiện trên máy Agilent 6580, cột mao quản HP-5 MS (30 m × 0,25 mm), khí mang He với tốc độ dòng 1,7 ml/phút, nhiệt độ buồng tiêm 280°C; chương trình nhiệt độ cột: 100°C (giữ 5 phút), tăng nhiệt 5°C/phút đến 250°C (giữ 30 phút).
- Đo độ quay cực [α]D: Thực hiện trên phân cực kế Perkin-Elmer Polarimeter Model 343.
- Phương pháp Mosher biến tính: Xác định cấu hình tuyệt đối tại các carbon bất đối đính nhóm hydroxyl thứ cấp. Mẫu thử được hòa tan trong CH2Cl2, cho phản ứng với (R)-MTPA clorua hoặc (S)-MTPA clorua có mặt chất xúc tác DMAP ở nhiệt độ phòng qua đêm, tinh chế sản phẩm (S)-MTPA este và (R)-MTPA este bằng TLC điều chế pha thường (n-hexan/EtOAc 4:1) trước khi đo phổ 1H-NMR.
- Phương pháp thủy phân và xác định cấu hình tuyệt đối gốc đường: Hợp chất glycoside (1,0 mg) được thủy phân bằng axit trifluoroacetic (TFA) 2M ở 100°C trong 2 giờ; dịch thủy phân sau khi loại dung môi được cho phản ứng với (-)-2-octanol và TFA đậm đặc ở 130°C trong 6 giờ, tiếp tục acetyl hóa với hỗn hợp pyridin/acetic anhydride (1:1) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó phân tích trên hệ thống sắc ký khí (GC) để so sánh thời gian lưu tR với các mẫu đường chuẩn D-glucose và L-glucose đã được xử lý tương tự.
-
Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học:
- Hoạt tính gây độc tế bào (MTS assay): Đánh giá trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung người (Hela) và ung thư biểu mô chuột (JB6 Cl 41) trong môi trường MEM hoặc RPMI bổ sung 5% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin và 100 μg/ml streptomycin ở 37°C, 5% CO2. Tế bào được ủ với chất thử trong 22 giờ, bổ sung 20 µl tác nhân MTS và ủ tiếp 2 giờ trước khi đo độ hấp thụ huỳnh quang trên máy μQuant microplate reader ở bước sóng 492 nm và 690 nm.
- Hoạt tính phiên mã yếu tố nhân NF-κB và p53: Đánh giá trên dòng tế bào JB6 Cl 41 đồng biến nạp với plasmid reporter JB6-Luc NF-κB hoặc JB6-Luc p53 (PG-13). Sau 24 giờ chuyển gen, tế bào được ủ với các chất thử ở các nồng độ 6,25; 12,5; 25,0 và 50,0 µM trong 24 giờ. Tế bào được ly giải bằng dung dịch đệm (0,1 M K3PO4 pH 7,8; 1% Triton X-100; 1 mM DTT; 2 mM EDTA) và xác định hoạt tính luciferase bằng máy Luminoscan Ascent Type 392 với dung dịch đệm chứa D-luciferin, Tricin, CoA và EDTA.
- Hoạt tính ức chế sự thụ tinh và phát triển phôi: Sử dụng giao tử của cầu gai Strongylocentrotus intermedius ở thời kỳ sinh sản (thu nhận bằng cách tiêm KCl 5% vào khoang bụng). Thử nghiệm ức chế thụ tinh được thực hiện ở các nồng độ chất thử 5, 10, 25, 50 µM, cố định mẫu bằng formaldehyde 2% và quan sát màng thụ tinh dưới kính hiển vi đảo ngược. Thử nghiệm ức chế phân cắt phôi bào đến giai đoạn 8 tế bào được ủ ở 18–20°C; các giá trị nồng độ ức chế hiệu quả EC50 và EC100 được tính toán bằng phần mềm SigmaPlot 3.02.
-
Nguồn tư liệu và dữ liệu: Mẫu nghiên cứu gồm 7 kg sao biển tươi thu tại vùng biển Quảng Ninh, được định danh khoa học bởi PGS. TS Đỗ Công Thung thuộc Viện Tài nguyên và Môi trường biển (VAST). Quá trình phân tích cấu trúc phổ và sinh học được thực hiện phối hợp tại Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), Phân viện Viễn Đông - Viện Hàn lâm Khoa học Liên bang Nga.
Nội dung chính theo từng chương
Chương I – Tổng quan tài liệu
Chương I tổng thuật chi tiết về đặc điểm phân loại, hình thái sinh học của sao biển nói chung và loài Archaster typicus nói riêng. Loài này có dạng hình sao với 5 cánh dài thon nhọn, đường kính cá thể trưởng thành từ 12 đến 15 cm, phân bố tại vùng đáy cát ven bờ ở độ sâu 0–50 m. Phần lưng sao biển có màu xám hoặc nâu nhạt với các vảy nhỏ thô ráp, các vân chữ V sáng tối xen kẽ; mặt bụng có rãnh hấp túc thực hiện chức năng bắt mồi, trao đổi nước và di chuyển.
Nội dung trọng tâm của chương tập trung hệ thống hóa 4 nhóm hợp chất steroid phân cực từ các loài sao biển đã được công bố trên thế giới, bao gồm polyhydroxy steroid, steroid sulfate, glycoside polyhydroxy steroid và asterosaponine. Chương cũng phân tích chi tiết các kết quả thử nghiệm sinh học từ tài liệu tham khảo:
- Tác dụng gây độc tế bào in vitro của 36 hợp chất polyhydroxy steroid từ loài Certonardoa semiregularis trên các dòng tế bào ung thư người (A549, SK-OV-3, KS-MEL-2, XF498, HCT15), trong đó hợp chất tetrol 14 thể hiện hoạt tính mạnh hơn đối chứng doxorubicin trên cả 5 dòng tế bào thử nghiệm.
- Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm đối với Streptococcus pyogenes 308A, Pseudomonas aeruginosa 1771, Cladosporium cucumerinum và Aspergillus flavus.
- Tác động kích thích tăng trưởng sợi thần kinh (neuritogenic activity) trên dòng tế bào u thần kinh đệm PC12 của chuột khi có mặt NGF từ các linckoside phân lập ở Linckia laevigata.
- Tác dụng tán huyết trên hồng cầu chuột ở các điều kiện nhiệt độ 37°C và 40°C của các dẫn xuất steroid phân cực từ Henricia leviuscula và Culcita novaeguineae.
- Đánh giá tổng hợp các công trình công bố trước đây trên loài Archaster typicus của nhóm tác giả Riccio (1986, 1989) trên thế giới và nhóm Châu Văn Minh (2007) tại Việt Nam, từ đó xác lập tính cấp thiết của việc nghiên cứu sâu nhóm steroid phân cực ở loài này.
Chương II – Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương II mô tả xuất xứ mẫu vật và quy chuẩn toàn bộ phương pháp thực nghiệm:
- Địa điểm và thời gian thu mẫu: Thu thập tại vùng biển Quảng Ninh vào tháng 08/2008, mẫu đã được giám định tên khoa học và lưu giữ tiêu bản.
- Trình bày chi tiết cấu hình kỹ thuật của hệ thống thiết bị phân tích: Hệ thống HPLC Agilent 1100 với cột Diasfer-110-C18; máy đo phổ khối phân giải cao Agilent 6510 Q-TOF LC/MS; máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker DRX 500 (tần số 500 MHz cho 1H và 125,8 MHz cho 13C); máy sắc ký khí Agilent 6580 trang bị cột mao quản HP-5 MS; phân cực kế Perkin-Elmer Model 343.
- Giao thức hóa học biến tính: Quy trình điều chế dẫn xuất (S)-MTPA este và (R)-MTPA este qua phản ứng ghép với Mosher clorua để xác định cấu hình tuyệt đối; quy trình thủy phân glycoside bằng TFA 2M, dẫn xuất hóa với (-)-2-octanol và acetyl hóa để xác định đồng phân D/L của đường bằng GC.
- Giao thức thử nghiệm sinh học: Mô tả quy trình thử nghiệm độ độc tế bào bằng phương pháp đo độ suy giảm MTS trên dòng Hela và JB6 Cl 41; quy trình thử nghiệm luciferase reporter assay đo hoạt tính phiên mã p53 và NF-κB trên dòng JB6 Cl 41 ở dải nồng độ 6,25–50,0 µM; quy trình thử nghiệm ức chế thụ tinh và ức chế phân cắt phôi bào đến giai đoạn 8 tế bào trên cầu gai Strongylocentrotus intermedius.
Chương III – Thực nghiệm
Chương III trình bày quá trình chiết xuất, phân lập và các hằng số vật lý cùng dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được từ 7 kg mẫu sao biển Archaster typicus tươi:
- Quy trình chiết xuất và phân đoạn thô: Mẫu tươi thái nhỏ, ngâm chiết kiệt 3 lần bằng etanol (15 lít/lần, mỗi lần 1 tuần) ở nhiệt độ phòng. Gộp dịch chiết, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 120 g dịch cô A. Hòa tan dịch cô A trong 1 lít nước cất rồi nạp lên cột Polychrome (Φ = 70 mm, L = 260 mm), rửa giải bằng 11 lít nước cất đến khi không còn kết tủa với AgNO3 1N, sau đó rửa giải bằng 7 lít etanol, thu được 3 phân đoạn: Phân đoạn 1 (29,7 g), Phân đoạn 2 (1,2 g) và Phân đoạn 3 (1,7 g).
- Phân lập bằng RP-HPLC:
- Từ phân đoạn 131 (15 mg), chạy HPLC (cột C-18 0,4 × 250 mm, EtOH/H2O 65:35, tốc độ 2,5 ml/phút) thu được hợp chất AT4 (1,5 mg).
- Từ phân đoạn 134 (50 mg), chạy HPLC (cột C-18 15 × 250 mm, EtOH/H2O 65:35) tách thành 7 phân đoạn nhỏ (134-3 đến 134-10). Phân đoạn nhỏ 134-5 (3,5 mg) chạy tiếp HPLC (EtOH/H2O/1N NH4OAc 55:40:5) thu được A12 (1,5 mg). Phân đoạn nhỏ 134-7 (6 mg) chạy HPLC (EtOH/H2O 55:45) thu được A1 (2,5 mg).
- Từ phân đoạn 135 (50 mg), chạy HPLC thu được A13 (7,0 mg); tinh chế các phân đoạn liên quan với các hệ dung môi EtOH/H2O/1N NH4OAc thu được A6 (1 mg), A9 (72,3 mg), A7 (1,5 mg), A8 (6,0 mg).
- Từ phân đoạn 142 (250 mg), chạy HPLC thu được phân đoạn 142-5 (tinh chế ra A3: 1,4 mg) và phân đoạn 142-4 (tinh chế ra A4: 3 mg).
- Từ phân đoạn 143 (80 mg), qua sắc ký HPLC thu được A10 (4,6 mg, từ phân đoạn 143-1) và A5 (2,0 mg, từ phân đoạn 143-6).
- Từ phân đoạn 15 (80 mg), phân đoạn 15-7 được tinh chế thu được A2 (2,5 mg).
- Từ phân đoạn 17, qua các bước HPLC thu được các hợp chất glycoside gồm A14 (Archasteroside A), A15 (Archasteroside B, 6,0 mg mẫu ban đầu 17-12) và A16 (Archasteroside C, từ 12,8 mg mẫu ban đầu 17-10).
| Ký hiệu |
Tên hóa học / Định danh hợp chất |
Trạng thái vật lý |
Công thức phân tử |
Khối lượng phân tử (M) |
Dữ liệu phổ khối HR-ESI-MS / ESIMS (m/z) |
| AT4 |
(24R)-27-nor-5α-cholestane-3β,6α,8,14,15α,24-hexaol (Hợp chất mới) |
Chất rắn, vô định hình |
C26H45O6 |
454 |
Tính toán lý thuyết: M = 453,3222 |
| A1 |
(24R)-27-nor-5α-cholestane-3β,4β,6α,8,14,15α,24-heptaol (Hợp chất mới) |
Chất rắn, vô định hình |
C26H46O7 |
470 |
(-)-ESIMS: 469 [M – H]–; HR-ESIMS: 493,3138 [M + Na]+ (tính toán: 493,3136) |
| A2 |
Hợp chất steroid glycoside gắn gốc D-glucose |
Chất rắn, vô định hình |
C32H56O14 |
664 |
HR-ESI-MS: 687,3575 [M + Na]+ (tính toán: 687,3562); MS/MS: m/z 669, 525, 507, 489 |
| A3 |
(24R)-5α-cholestane-3β,4β,5,6α,8,14,15α,24,26-nonaol (Hợp chất mới) |
Chất rắn, vô định hình |
C27H48O9 |
516 |
HR-ESI-MS: Tính toán lý thuyết [M + Na]+ là 539,3191 |
| A4 |
Muối natri (24S)- & (24R)-5α-cholest-25(27)-ene-3β,6α,8,14,15α,24,26-heptaol 15-O-sulfate (Mới) |
Chất rắn vô định hình; [α]25D + 85° (c 0,1, EtOH) |
C27H45O10SNa |
584 |
(+)ESIMS: 607 [M + Na]+; (-)ESIMS: 561 [M – Na]–; HR-ESI-MS: 607,2535 [M + Na]+ |
| A5 |
Muối natri (23E)-27-Nor-25-oxo-5α-cholest-23-ene-3β,6α,8,14,15α-pentaol 15-O-sulfate (Mới) |
Chất rắn, vô định hình |
Đang xác định |
Đang xác định |
Xác định khung phân tử mang nhóm oxo tại C-25 và liên kết đôi 23E |
Dữ liệu thực nghiệm xác định cấu hình tuyệt đối:
- Đối với hợp chất A1: Dẫn xuất 3,6,24-tri-(S)-MTPA este và 3,6,24-tri-(R)-MTPA este được điều chế thành công; dữ liệu 1H-NMR cho thấy các tín hiệu proton đặc trưng gồm H3-21 (0,77 ppm, d), H3-26 (0,93 ppm, t), H3-18 (1,08 ppm, s), H3-19 (1,28 ppm, s), H-4 (4,29 ppm), H-15 (4,40 ppm), H-3 (4,86 ppm), H-24 (4,97 ppm), H-6 (5,53 ppm), giúp xác lập cấu hình tuyệt đối tại C-24 là 24R.
- Đối với hợp chất A2: Phân tích sắc ký khí (GC) dẫn xuất acetyl hóa thu được các pic có thời gian lưu tR lần lượt là 28,27; 28,86; 29,0 và 29,38 phút, trùng khớp với thời gian lưu của mẫu chuẩn D-glucose (28,27; 28,86; 29,06 và 29,38 phút) và khác biệt so với L-glucose (28,40; 28,62; 28,72 và 29,38 phút), khẳng định phân tử đường trong hợp chất A2 là D-glucose.
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học
- Phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của một dãy các hợp chất steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus ở vùng biển Việt Nam, trong đó có nhiều hợp chất mới lần đầu tiên được phát hiện trên thế giới:
- Hợp chất mới AT4: (24R)-27-nor-5α-cholestane-3β,6α,8,14,15α,24-hexaol (công thức phân tử C26H45O6, khối lượng phân tử 454).
- Hợp chất mới A1: (24R)-27-nor-5α-cholestane-3β,4β,6α,8,14,15α,24-heptaol (công thức phân tử C26H46O7, khối lượng phân tử 470), xác định cấu hình lập thể bằng phương pháp Mosher.
- Hợp chất mới A3: (24R)-5α-cholestane-3β,4β,5,6α,8,14,15α,24,26-nonaol (công thức phân tử C27H48O9, khối lượng phân tử 516).
- Hợp chất mới A4: Muối natri (24S)- & (24R)-5α-cholest-25(27)-ene-3β,6α,8,14,15α,24,26-heptaol 15-O-sulfate (công thức phân tử C27H45O10SNa, khối lượng phân tử 584).
- Hợp chất mới A5: Muối natri (23E)-27-Nor-25-oxo-5α-cholest-23-ene-3β,6α,8,14,15α-pentaol 15-O-sulfate.
- Nhóm các glycoside mới ký hiệu là Archasteroside A (A14), Archasteroside B (A15) và Archasteroside C (A16).
- Xác định cấu trúc lập thể của phân tử đường gắn trên khung steroid glycoside (hợp chất A2) là D-glucose nhờ kỹ thuật octanol hóa kết hợp sắc ký khí so sánh mẫu chuẩn.
- Bổ sung hệ thống dữ liệu phổ thực nghiệm chi tiết (HR-ESI-MS, HR-ESI-MS/MS, 1D-NMR, 2D-NMR, GC, độ quay cực) cho cơ sở dữ liệu hóa học các hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển Việt Nam.
Đóng góp mới về mặt thực tiễn
- Xây dựng thành công quy trình chiết xuất quy mô 7 kg mẫu tươi, ứng dụng hiệu quả cột hấp phụ Polychrome để loại bỏ triệt để hàm lượng muối biển vô cơ lớn trong dịch chiết nước trước khi phân đoạn bằng cồn.
- Thiết lập quy trình sắc ký lỏng cao áp pha đảo (RP-HPLC) sử dụng hệ dung môi đệm bay hơi (NH4OAc) để phân lập tinh chế các cấu tử steroid phân cực và steroid sulfate ở dạng vết từ phân đoạn chiết.
- Cung cấp dữ liệu thử nghiệm hoạt tính sinh học trên nhiều mô hình sàng lọc in vitro (độc tế bào MTS trên tế bào Hela và JB6 Cl 41; hoạt tính phiên mã p53/NF-κB; hoạt tính ức chế thụ tinh và phát triển phôi cầu gai Strongylocentrotus intermedius), tạo cơ sở khoa học cho định hướng nghiên cứu khai thác nguồn dược liệu biển phục vụ phát triển dược phẩm.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu
- Mẫu vật sinh học Archaster typicus chỉ mới được thu thập tại một vùng địa lý duy nhất là vùng biển tỉnh Quảng Ninh và vào một thời điểm duy nhất (tháng 08 năm 2008). Do đó, luận án chưa có dữ liệu so sánh sự biến thiên về hàm lượng và thành phần hóa học của các steroid phân cực theo các mùa trong năm hoặc theo các tọa độ địa lý sinh thái khác nhau dọc bờ biển Việt Nam.
- Hàm lượng của một số hợp chất phân lập được còn rất thấp (nhiều chất chỉ thu được ở khối lượng từ 0,3 mg đến 1,5 mg như 134-6, AT4, A3, A6, A12), gây hạn chế cho việc mở rộng thử nghiệm trên nhiều mô hình dược lý in vivo hoặc nghiên cứu sâu cơ chế tác động ở mức độ phân tử.
Hướng nghiên cứu tiếp
- Mở rộng phạm vi thu thập mẫu Archaster typicus tại các vùng biển miền Trung và miền Nam Việt Nam nhằm đánh giá tính đa dạng sinh học và sự biến động hàm lượng hoạt chất theo vùng sinh thái.
- Tối ưu hóa quy trình phân lập để thu nhận khối lượng lớn hơn đối với các hợp chất mới (AT4, A1, A3, A4, A5, các Archasteroside A–C) nhằm tiến hành các thử nghiệm chuyên sâu về dược động học, độc tính học và thử nghiệm hoạt tính in vivo.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu chuyên khảo hữu ích đối với:
- Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Hóa sinh học: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình chiết tách steroid phân cực từ mẫu động vật biển; kỹ thuật xử lý mẫu chứa hàm lượng muối vô cơ cao bằng chất hấp phụ Polychrome; phương pháp phân tích phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS/MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (HSQC, HMBC, COSY, TOCOSY, NOESY) đối với khung steroid đa nhóm thế.
- Các nhà nghiên cứu phân tích lập thể: Là tài liệu mẫu mực về ứng dụng phương pháp Mosher biến tính để xác định cấu hình tuyệt đối của các nhóm hydroxyl thứ cấp trên khung steroid và phương pháp octanol hóa kết hợp acetyl hóa để xác định đồng phân D/L của gốc đường bằng sắc ký khí (GC).
- Các cơ sở nghiên cứu sàng lọc dược liệu biển: Cung cấp thông tin tham khảo về các hệ thống thử nghiệm sinh học in vitro gồm phương pháp MTS, thử nghiệm chuyển gen chỉ thị luciferase đánh giá hoạt tính phiên mã yếu tố p53, NF-κB và mô hình phôi học cầu gai Strongylocentrotus intermedius.
Câu hỏi thường gặp
1. Mẫu nghiên cứu trong luận án được thu thập ở đâu, vào thời gian nào và do ai giám định tên khoa học?
Mẫu sao biển tươi Archaster typicus có khối lượng 7 kg, được thu thập tại vùng biển tỉnh Quảng Ninh vào tháng 08 năm 2008. Tên khoa học của loài được giám định bởi PGS. TS Đỗ Công Thung thuộc Viện Tài nguyên và Môi trường biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2. Quy trình loại muối vô cơ ra khỏi dịch chiết sao biển được tiến hành như thế nào?
120 g dịch cô ethanol (dịch cô A) thu được từ 7 kg mẫu tươi được hòa tan trong 1 lít nước cất rồi nạp lên cột sắc ký Polychrome (đường kính Φ = 70 mm, chiều dài L = 260 mm). Cột được rửa giải ban đầu bằng 11 lít nước cất và kiểm tra dịch rửa giải định kỳ bằng dung dịch AgNO3 1N. Khi dịch nước hoàn toàn không còn tạo kết tủa trắng với AgNO3 1N (đã sạch muối vô cơ), cột tiếp tục được rửa giải bằng 7 lít cồn ethanol để thu nhận các hợp chất hữu cơ phân cực, chia thành 3 phân đoạn: phân đoạn 1 (29,7 g), phân đoạn 2 (1,2 g) và phân đoạn 3 (1,7 g).
3. Cấu hình tuyệt đối của nguyên tử carbon bất đối và gốc đường trong các hợp chất phân lập được xác định bằng phương pháp thực nghiệm nào?
Cấu hình tuyệt đối tại C-24 của hợp chất mới A1 được xác định bằng phương pháp Mosher biến tính, thông qua việc tổng hợp hai dẫn xuất 3,6,24-tri-(S)-MTPA este và 3,6,24-tri-(R)-MTPA este rồi phân tích độ dịch chuyển hóa học trên phổ 1H-NMR. Cấu hình tuyệt đối của gốc đường trong glycoside A2 được xác định bằng cách thủy phân với TFA 2M, cho phản ứng với (-)-2-octanol ở 130°C trong 6 giờ, acetyl hóa với pyridin/acetic anhydride (1:1) và chạy sắc ký khí (GC) so sánh thời gian lưu tR với mẫu chuẩn D-glucose và L-glucose.
4. Luận án đã công bố những hợp chất steroid phân cực mới nào trong phần thực nghiệm?
Phần thực nghiệm của luận án đã công bố các hợp chất mới bao gồm:
- AT4: (24R)-27-nor-5α-cholestane-3β,6α,8,14,15α,24-hexaol (C26H45O6, M = 454).
- A1: (24R)-27-nor-5α-cholestane-3β,4β,6α,8,14,15α,24-heptaol (C26H46O7, M = 470).
- A3: (24R)-5α-cholestane-3β,4β,5,6α,8,14,15α,24,26-nonaol (C27H48O9, M = 516).
- A4: Muối natri (24S)- & (24R)-5α-cholest-25(27)-ene-3β,6α,8,14,15α,24,26-heptaol 15-O-sulfate (C27H45O10SNa, M = 584).
- A5: Muối natri (23E)-27-Nor-25-oxo-5α-cholest-23-ene-3β,6α,8,14,15α-pentaol 15-O-sulfate.
- Các glycoside steroid mang tên Archasteroside A (A14), Archasteroside B (A15) và Archasteroside C (A16).
5. Luận án đã sử dụng những hệ thống thử nghiệm sinh học nào để đánh giá hoạt tính của các chất?
Luận án thiết lập 3 hệ thống thử nghiệm sinh học:
- Thử nghiệm gây độc tế bào bằng phương pháp so màu MTS trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung người (Hela) và dòng tế bào ung thư biểu mô chuột (JB6 Cl 41), đo quang phổ ở 492 nm và 690 nm.
- Thử nghiệm luciferase reporter assay đánh giá hoạt tính phiên mã của các yếu tố nhân NF-κB và p53 trên dòng tế bào JB6 Cl 41 ở các nồng độ chất thử 6,25; 12,5; 25,0 và 50,0 µM.
- Thử nghiệm ức chế thụ tinh và ức chế phân cắt phôi bào đến giai đoạn 8 tế bào trên giao tử và phôi của loài cầu gai Strongylocentrotus intermedius, xác định các giá trị EC50 và EC100 thông qua phần mềm SigmaPlot 3.02.
Kết luận
Luận án tiến sĩ đã thực hiện thành công nghiên cứu chuyên sâu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nhóm steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus thu thập tại vùng biển Quảng Ninh, Việt Nam. Tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của nhiều hợp chất steroid phân cực, trong đó có các dẫn xuất polyhydroxy steroid, steroid sulfate và glycoside mới lần đầu tiên được ghi nhận trên thế giới như AT4, A1, A3, A4, A5 cùng các archasteroside A–C. Quy trình tinh chế kết hợp sắc ký khử muối Polychrome và HPLC pha đảo đã chứng minh tính hiệu quả đối với các mẫu sinh vật biển có hàm lượng muối cao. Đồng thời, luận án đã xây dựng được cơ sở dữ liệu thực nghiệm đồng bộ về phổ nghiệm hóa học và sàng lọc sinh học in vitro, đóng góp dữ liệu khoa học xác thực cho lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên sinh vật biển tại Việt Nam.
