Nghiên cứu một số giải pháp công nghệ làm khả năng sinh tổng hợp gsh của nấm men saccharomyces cerevisiae

Nghiên cứu các giải pháp công nghệ nâng cao khả năng sinh tổng hợp GSH của nấm men Saccharomyces cerevisiae, góp phần cải thiện chất lượng sản phẩm.

• Tác giả: Trần Thị Hoa
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Liên Hà
• Trường học: Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Một Số Giải Pháp Công Nghệ Làm Tăng Khả Năng Sinh Tổng Hợp GSH Của Nấm Men Saccharomyces Cerevisiae
• Loại tài liệu: Luận Văn Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. PHẦN 1: CẤU TRÚC CỦA GLUTATHIONE
• 1.1. Cấu trúc của glutathione
• 1.2. Chức năng của glutathione
• 1.3. Công nghệ sản xuất glutathione
• 1.3.1. Lịch sử cấu trúc phân tử của glutathione
• 1.3.2. Tổng hợp glutathione bằng phương pháp hoá học
• 1.3.2.1. Phương pháp tổng hợp từ N-benzyloxycarbonyl cysteine
• 1.3.2.2. Phương pháp tổng hợp từ Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-cystine
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 2.2. Môi trường nuôi cấy
• 2.3. Thiết bị nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp phân tích
• 2.6. Phương pháp thiết kế thí nghiệm
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Khảo sát và lựa chọn các nguyên liệu thay thế để tạo môi trường cải tiến trong sinh tổng hợp GSH của nấm men
• 3.1.1. Nguồn dinh dưỡng cacbon
• 3.1.2. Nguồn dinh dưỡng nitơ
• 3.1.3. Nguyên tố vi lượng
• 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của axit amin tới quá trình sinh tổng hợp GSH bởi nấm men S.
• 3.3. Nghiên cứu lựa chọn và tối ưu hoá điều kiện lên men sinh tổng hợp glutathione
• 3.3.1. Tối ưu hoá điều kiện nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy và tỷ lệ nhân giống
• 3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ thông khí tới quá trình sinh tổng hợp GSH của nấm men S.
• 3.3.3. Dựng đường cong sinh trưởng của nấm men S.
• 3.3.4. Khảo sát thời gian và nồng độ bổ sung axit amin tiền chất và cơ chất phụ trợ năng lượng
• 3.3.4.1. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung L-cysteine đến quá trình lên men sinh tổng hợp GSH
• 3.3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ L-cysteine đến quá trình lên men sinh tổng hợp GSH
• 3.3.4.3. Nghiên cứu lựa chọn thời điểm và nồng độ bổ sung natri citrate
• 3.3.5. Động học sinh trưởng chủng nấm men S.
• 3.4. Khảo sát điều kiện thu hồi glutathione từ sinh khối nấm men bằng phương pháp trích ly cồn ethanol
• 3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ cồn ethanol đến hiệu suất trích ly GSH
• 3.4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly GSH
• 3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly GSH
• 3.4.4. Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu suất trích ly GSH
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về GSH và nấm men Saccharomyces cerevisiae

Glutathione (GSH) là một tripeptide quan trọng trong cơ thể sống, đặc biệt là trong tế bào nhân thực. GSH đóng vai trò chủ yếu trong việc chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch và khử độc tế bào. Nấm men Saccharomyces cerevisiae là một trong những nguồn chính để sản xuất GSH thông qua quá trình lên men. Việc nghiên cứu và tối ưu hóa quy trình sản xuất GSH từ nấm men này đang trở thành một xu hướng quan trọng trong công nghệ sinh học.

1.1. GSH và vai trò của nó trong tế bào

GSH có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa. Nó tham gia vào nhiều quá trình sinh lý như vận chuyển axit amin và giải độc các chất ngoại bào. Việc thiếu hụt GSH có thể dẫn đến nhiều vấn đề sức khỏe nghiêm trọng.

1.2. Saccharomyces cerevisiae và ứng dụng trong sản xuất GSH

Nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng rộng rãi trong sản xuất GSH nhờ khả năng sinh tổng hợp cao. Nghiên cứu cho thấy rằng việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy có thể làm tăng đáng kể hàm lượng GSH trong nấm men.

II. Thách thức trong việc tổng hợp GSH từ nấm men

Mặc dù GSH có nhiều lợi ích, việc sản xuất GSH từ nấm men Saccharomyces cerevisiae vẫn gặp nhiều thách thức. Các yếu tố như điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường và quy trình chiết tách đều ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp GSH. Việc hiểu rõ các yếu tố này là cần thiết để cải thiện quy trình sản xuất.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp GSH

Nhiệt độ, pH, và thời gian nuôi cấy là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp GSH. Nghiên cứu cho thấy rằng việc tối ưu hóa các thông số này có thể làm tăng hàm lượng GSH lên đến 3,6 lần.

2.2. Vấn đề trong quy trình chiết tách GSH

Quy trình chiết tách GSH từ sinh khối nấm men cũng gặp nhiều khó khăn. Các yếu tố như nồng độ ethanol, thời gian trích ly và tỷ lệ sinh khối/dung môi đều cần được khảo sát để tối ưu hóa hiệu suất thu hồi GSH.

III. Phương pháp tối ưu hóa sản xuất GSH từ nấm men

Để tăng cường khả năng sinh tổng hợp GSH từ nấm men Saccharomyces cerevisiae, nhiều phương pháp đã được nghiên cứu. Các phương pháp này bao gồm cải tiến thành phần môi trường nuôi cấy và tối ưu hóa các thông số của quá trình lên men.

3.1. Cải tiến thành phần môi trường nuôi cấy

Việc lựa chọn nguyên liệu cho môi trường nuôi cấy là rất quan trọng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung các thành phần như rỉ đường, glucose và các axit amin có thể làm tăng khả năng sinh tổng hợp GSH.

3.2. Tối ưu hóa các thông số lên men

Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) kết hợp với mô hình Box-Behnken (BBD) giúp tối ưu hóa các thông số như nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy, từ đó nâng cao hiệu suất sản xuất GSH.

IV. Ứng dụng thực tiễn của GSH trong y học và công nghiệp

GSH không chỉ có vai trò quan trọng trong sinh lý mà còn được ứng dụng rộng rãi trong y học và công nghiệp thực phẩm. Các sản phẩm chứa GSH đang ngày càng được ưa chuộng nhờ vào lợi ích sức khỏe mà nó mang lại.

4.1. GSH trong điều trị bệnh

GSH được sử dụng trong điều trị nhiều bệnh lý như xơ gan, viêm phổi và các bệnh lý thần kinh. Nghiên cứu cho thấy GSH có khả năng cải thiện sức khỏe và tăng cường miễn dịch.

4.2. GSH trong ngành công nghiệp thực phẩm

GSH được sử dụng như một phụ gia thực phẩm và trong sản xuất mỹ phẩm. Sự phát triển của các sản phẩm chứa GSH đang mở ra nhiều cơ hội cho ngành công nghiệp này.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu GSH

Nghiên cứu về GSH và các giải pháp công nghệ để tăng cường tổng hợp GSH từ nấm men Saccharomyces cerevisiae đang mở ra nhiều triển vọng. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất không chỉ giúp giảm chi phí mà còn nâng cao chất lượng sản phẩm.

5.1. Tương lai của nghiên cứu GSH

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp mới để tối ưu hóa quy trình sản xuất GSH, từ đó đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.

5.2. Khuyến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo nên xem xét các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách GSH và phát triển các công nghệ mới để cải thiện hiệu suất sản xuất GSH từ nấm men.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thị trường glutathione toàn cầu được định giá 219,4 triệu USD vào năm 2019 và dự kiến đạt 361 triệu USD vào năm 2027, với sản lượng tiêu thụ hàng năm khoảng 200 tấn dạng tinh thể tinh khiết. Glutathione (GSH) là một tripeptide tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong việc chống oxy hóa, tăng cường hệ miễn dịch và khử độc tế bào. Mặc dù nhu cầu sử dụng GSH trong y tế, mỹ phẩm và thực phẩm bảo vệ sức khỏe tại Việt Nam liên tục tăng cao, nguồn cung hiện nay gần như phụ thuộc hoàn toàn vào nhập khẩu với giá thành đắt đỏ.

Vấn đề nghiên cứu trọng tâm là tìm kiếm giải pháp công nghệ nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp GSH nội bào từ vi sinh vật và tối ưu quy trình thu hồi, nhằm giảm chi phí sản xuất. Đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học của tác giả Trần Thị Hoa, dưới sự hướng dẫn của PGS. Trần Liên Hà và TS. Trương Hương Lan tại Đại học Bách khoa Hà Nội, đã tập trung giải quyết mục tiêu cải tiến môi trường lên men, tối ưu hóa các thông số nuôi cấy và hoàn thiện công nghệ trích ly GSH từ chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae YM22.

Nghiên cứu được triển khai từ năm 2020 đến năm 2022 tại Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm kết hợp với Viện Công nghiệp Thực phẩm. Các chỉ số mục tiêu đạt được rất ấn tượng: năng suất sinh khối đạt trên 6,35 g/L, hàm lượng GSH sinh tổng hợp tăng gấp 3,6 lần so với điều kiện ban đầu, và giảm hơn 87% lượng tạp chất protein hòa tan trong quá trình trích ly dịch chiết.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên nền tảng chu trình gamma-glutamyl và con đường chuyển hóa hai bước phụ thuộc năng lượng ATP để sinh tổng hợp GSH trong tế bào nấm men. Bước đầu tiên là phản ứng tạo liên kết giữa L-glutamate và L-cysteine dưới sự xúc tác của enzyme gamma-glutamylcysteine synthetase (gamma-GCS, EC 6.3.2.2). Bước tiếp theo gắn glycine vào phân tử dipeptide trung gian nhờ enzyme glutathione synthetase (GS, EC 6.3.2.3) để tạo thành tripeptide GSH hoàn chỉnh. Trong quá trình này, enzyme gamma-GCS chịu cơ chế ức chế phản hồi nghiêm ngặt bởi nồng độ GSH nội bào tích lũy.

Bên cạnh đó, mô hình điều hòa dòng chuyển hóa năng lượng bằng cơ chất phụ trợ được ứng dụng để kích thích các con đường đường phân Embden-Meyerhof-Parnas và hexose monophosphate. Việc bổ sung natri citrate đóng vai trò then chốt trong việc gia tăng nồng độ NADH qua chuỗi hô hấp ty thể, nâng cao tỷ lệ ATP/ADP nội bào mà không cần bổ sung nguồn ATP ngoại sinh đắt tiền. Các khái niệm cốt lõi bao gồm: trạng thái khử thiol-nonprotein, hiệu ứng Crabtree trong quá trình chuyển hóa đường của nấm men, và phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) kết hợp mô hình Box-Behnken để phân tích tương tác phi tuyến tính giữa các biến số công nghệ.

Phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae YM22 được phân lập từ syro mơ mật ong thuộc bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp Thực phẩm. Thiết kế thí nghiệm áp dụng mô hình Box-Behnken (BBD) với 4 yếu tố độc lập gồm nhiệt độ (22 - 34°C), pH ban đầu (5,0 - 7,0), thời gian lên men (48 - 72 giờ) và tỷ lệ cấp giống (5 - 15%). Cỡ mẫu thực nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần cho mỗi điểm thí nghiệm nhằm đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy thống kê cao.

Phương pháp lấy mẫu được tiến hành định kỳ 4 giờ một lần trong suốt quá trình nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 50 L với thể tích làm việc 30 L. Nồng độ chất khô hòa tan được xác định bằng khúc xạ kế, độ ẩm sinh khối xác định theo phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi (AOAC 927.05). Hàm lượng GSH được định lượng bằng phương pháp alloxan tại bước sóng quang phổ 305 nm với dung dịch alloxan monohydrate 1 mg/mL. Toàn bộ số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phần mềm Excel, phân tích phương sai ANOVA một chiều theo chuẩn Tukey trên SPSS và tối ưu hóa toán học trên phần mềm Design-Expert 13.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, việc khảo sát nguồn dinh dưỡng carbon cho thấy glucose (25 g/L) mang lại hàm lượng GSH cao nhất đạt 54,15 mg/L và sinh khối khô 6,35 g/L. Tuy nhiên, rỉ đường mía sau khi xử lý loại tạp chất ở nồng độ 50 g/L cho kết quả rất khả quan với sinh khối 6,21 g/L và hàm lượng GSH đạt 50,56 mg/L (tương đương 93,4% so với glucose tinh khiết), mở ra cơ hội hạ giá thành nguyên liệu nuôi cấy.

Thứ hai, tối ưu hóa điều kiện lên men bằng phương pháp RSM xác định được điểm tối ưu tại nhiệt độ 28°C, pH 6,0, thời gian nuôi cấy 60 giờ và tỷ lệ cấp giống 10%. Tại điều kiện này, nồng độ GSH tổng hợp trong dịch lên men tăng vọt gấp 3,6 lần so với công thức đối chứng ban đầu.

Thứ ba, việc bổ sung 1,0 - 1,5 g/L tiền chất L-cysteine tại thời điểm 24 giờ kết hợp với 2,0 g/L natri citrate tại thời điểm 15 - 20 giờ của pha sinh trưởng đã giải phóng sự kìm hãm của enzyme gamma-GCS, đồng thời cung cấp đầy đủ nguồn năng lượng ATP nội sinh cho quá trình liên hợp tripeptide.

Thứ tư, phương pháp trích ly GSH bằng dung môi ethanol 25% ở nhiệt độ 25°C trong 2 giờ với tỷ lệ sinh khối 100 g/L đạt năng suất thu hồi 0,31 g/g, tương đương với phương pháp chiết bằng nước nóng 95°C nhưng chỉ giải phóng 5,4 g/L protein hòa tan so với 42,3 g/L ở phương pháp nhiệt.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả vượt trội của rỉ đường mía kết hợp cao chiết đậu tương được lý giải bởi sự hiện diện phong phú của các vitamin nhóm B, khoáng chất vi lượng (Zn2+, Mg2+) và các axit amin tự nhiên, giúp nấm men duy trì sinh trưởng ổn định và giảm thiểu hiện tượng stress thẩm thấu. Việc bổ sung L-cysteine vào thời điểm 24 giờ (cuối pha logarit) là điểm mấu chốt giúp tế bào hấp thụ trọn vẹn tiền chất mà không làm ức chế sinh trưởng của nấm men ở giai đoạn đầu. Cơ chế bổ trợ của natri citrate kích hoạt mạnh mẽ chu trình tạo ATP, đáp ứng đủ nhu cầu năng lượng cho 2 phản ứng tổng hợp GSH.

Các kết quả động học lên men và trích ly được biểu diễn trực quan thông qua đồ thị đường cong sinh trưởng, biểu đồ hồi quy đáp ứng bề mặt 3D và các bảng so sánh đa biến. So với các nghiên cứu sử dụng chủng vi khuẩn biến đổi gen E. coli cho năng suất từ 5.780 đến 15.210 mg/L nhưng có nguy cơ tồn dư nội độc tố endotoxin, việc sử dụng chủng nấm men S. cerevisiae YM22 tự nhiên đem lại sản phẩm có độ an toàn sinh học tuyệt đối, đáp ứng hoàn hảo các tiêu chuẩn khắt khe của ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Chuẩn hóa quy trình xử lý nguyên liệu rỉ đường mía và cao đậu tương: Doanh nghiệp sản xuất cần triển khai quy trình thủy phân axit rỉ đường ở pH 1,5 bằng H2SO4, trung hòa bằng Ca(OH)2 về pH 7,5 trong quý 1 để giảm 30% chi phí môi trường mà vẫn duy trì nồng độ GSH trên 50 mg/L.
2. Ứng dụng hệ thống kiểm soát cấp cơ chất tự động theo mẻ: Các kỹ sư công nghệ sinh học tại cơ sở sản xuất cần cài đặt thiết bị bổ sung tự động L-cysteine nồng độ 1,0 g/L tại mốc 24 giờ và natri citrate 2,0 g/L tại mốc 15 - 20 giờ trong vòng 6 tháng tới để nâng cao sản lượng GSH đạt trên 200 mg/L ở quy mô pilot 50 L.
3. Chuyển đổi công nghệ thu hồi sang trích ly bằng cồn ethanol 25%: Bộ phận nghiên cứu và phát triển sản phẩm cần thiết kế hệ thống chiết lạnh ở 25°C trong 2 giờ kết hợp tháp thu hồi cồn tuần hoàn trong thời hạn 9 tháng, giúp giảm 87,2% protein tạp nhiễm và tiết kiệm 40% chi phí năng lượng gia nhiệt.
4. Xây dựng hồ sơ tiêu chuẩn cơ sở và đăng ký lưu hành sản phẩm: Viện nghiên cứu phối hợp với doanh nghiệp dược phẩm hoàn thiện hồ sơ kiểm nghiệm độc tính và hoạt tính chống oxy hóa của bột nấm men giàu GSH trong vòng 12 tháng nhằm phục vụ thương mại hóa chế phẩm viên nang bảo vệ gan và viên uống trắng da.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Sinh viên và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Kỹ thuật Hóa học và Công nghệ Thực phẩm: Nắm vững phương pháp thiết kế thực nghiệm bề mặt đáp ứng Box-Behnken, kỹ thuật định lượng quang phổ alloxan và phương pháp phân tích động học lên men vi sinh vật.
2. Kỹ sư R&D và chuyên viên công nghệ tại các nhà máy sản xuất sinh phẩm: Vận dụng công thức môi trường giá rẻ từ rỉ đường và chiến lược bổ sung chất trợ lực natri citrate để tối ưu hóa quy trình lên men nấm men công nghiệp.
3. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm: Tiếp cận giải pháp công nghệ chiết xuất xanh bằng ethanol nồng độ thấp nhằm tạo ra nguồn nguyên liệu GSH tự nhiên, an toàn, không chứa biến đổi gen (non-GMO).
4. Các nhà khoa học và giảng viên tại các viện nghiên cứu chuyên ngành: Sử dụng làm tài liệu tham khảo chuyên sâu về chuyển hóa thiol-nonprotein, cơ chế chống stress oxy hóa ở nấm men và dữ liệu vận hành hệ thống bioreactor 50 L.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nghiên cứu lại ưu tiên nấm men Saccharomyces cerevisiae hơn vi khuẩn biến đổi gen để sản xuất GSH? Mặc dù vi khuẩn tái tổ hợp có thể đạt nồng độ GSH cao từ 5.780 đến 15.210 mg/L, chúng mang nguy cơ lớn về nội độc tố endotoxin và rào cản pháp lý khi sử dụng trong thực phẩm. Nấm men Saccharomyces cerevisiae đạt chuẩn an toàn sinh học cao (GRAS), sở hữu hệ thống đường phân tái tạo ATP mạnh mẽ và phù hợp trực tiếp cho chế biến thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

Chất trợ lực natri citrate đóng vai trò cụ thể như thế nào trong quá trình lên men? Natri citrate hoạt động như một chất điều hòa dòng chuyển hóa carbon, kích thích phản ứng dehydrogenase liên kết NAD+ để sinh ra lượng lớn NADH. Qua chuỗi hô hấp tế bào, NADH thúc đẩy tổng hợp ATP nội bào, cung cấp đủ năng lượng cho 2 phản ứng phụ thuộc ATP của enzyme gamma-GCS và GS mà không cần bổ sung nguồn ATP ngoại sinh đắt tiền.

Phương pháp trích ly bằng cồn ethanol 25% có ưu thế gì so với phương pháp trích ly bằng nước nóng? Trích ly bằng ethanol 25% ở 25°C trong 2 giờ cho năng suất thu hồi GSH tương đương nước nóng ở 95°C (khoảng 0,31 g/g), nhưng chỉ giải phóng 5,4 g/L protein tạp vào dịch chiết so với 42,3 g/L ở nước nóng. Điều này giúp giữ nguyên vẹn màng tế bào, giảm 87,2% lượng protein nhiễm tạp và giảm chi phí tinh sạch hạ nguồn.

Làm thế nào để kiểm soát hiện tượng ức chế phản hồi của enzyme gamma-GCS trong tế bào? Nghiên cứu khắc phục sự kìm hãm phản hồi bằng cách kiểm soát thời điểm bổ sung L-cysteine (1,0 - 1,5 g/L) vào đúng mốc 24 giờ của pha sinh trưởng, kết hợp kiểm soát tốc độ sục khí từ 0,1 đến 0,6 vvm và nhiệt độ 28°C nhằm duy trì thế oxy hóa khử tối ưu bên trong tế bào nấm men.

Quy trình xử lý rỉ đường mía trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy được thực hiện ra sao? Rỉ đường được pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:1, hạ pH xuống 1,5 bằng H2SO4 98% và đun sôi trong 30 phút để thủy phân bã hữu cơ. Sau đó dung dịch được làm nguội, nâng pH lên 7,5 bằng Ca(OH)2, lắng cặn trong 12 giờ, lọc loại kết tủa và tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút trước khi sử dụng.

Kết luận

• Tuyển chọn thành công nguồn nguyên liệu rỉ đường mía (50 g/L) và cao đậu tương thay thế, đảm bảo hiệu suất sinh tổng hợp GSH đạt 50,56 mg/L và giảm đáng kể chi phí môi trường nuôi cấy.
• Tối ưu hóa 4 thông số lên men (28°C, pH 6,0, 60 giờ, tỷ lệ cấp giống 10%) bằng mô hình Box-Behnken, giúp nâng cao năng suất sinh tổng hợp GSH gấp 3,6 lần so với điều kiện ban đầu.
• Xác định chính xác chế độ bổ sung 1,0 g/L L-cysteine ở mốc 24 giờ và 2,0 g/L natri citrate ở mốc 15 - 20 giờ, giúp tăng cường tái tạo ATP nội bào và kích hoạt tối đa hoạt tính enzyme tổng hợp.
• Làm chủ công nghệ trích ly xanh bằng ethanol 25% ở 25°C trong 2 giờ, thu hồi GSH hiệu quả cao đồng thời giảm 87,2% lượng tạp chất protein hòa tan.
• Khẳng định tính khả thi của quy trình công nghệ qua thử nghiệm động học sinh trưởng ổn định trên hệ thống lên men pilot dung tích 50 L.

Đóng góp quan trọng nhất của luận văn là hoàn thiện một giải pháp công nghệ đồng bộ từ khâu tận dụng phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ, kiểm soát lên men hiếu khí đến công nghệ trích ly thân thiện với môi trường, mở ra tiềm năng sản xuất glutathione quy mô công nghiệp tại Việt Nam. Trong giai đoạn 12 - 24 tháng tới, quy trình cần tiếp tục được mở rộng thử nghiệm ở quy mô 500 L và hoàn thiện công nghệ sấy phun tạo chế phẩm bột nấm men giàu GSH. Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm có thể kết nối với nhóm tác giả tại Đại học Bách khoa Hà Nội để nhận chuyển giao công nghệ và hợp tác thương mại hóa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

LỜI MỞ ĐẦU Glutathione (GSH) là thành phần thiol-nonprotein dồi dào nhất trong cơ thể sinh vật sống, đặc biệt chiếm ưu thế trong tế bào nhân thực. Có tới 90% glutathione hoạt động ở dạng khử trong tế bào (vi khuẩn), mô, plasma. GSH tham gia và đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý khác nhau, tuy nhiên có thể khái quát vai trò của GSH trong 3 chức năng chính: chống oxy hoá, tăng cường miễn dịch và khử độc tế bào trong các sinh vật nhân thực bậc cao. Do đó GSH được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y sinh và có tiềm năng to lớn sử dụng trong ngành thực phẩm và mỹ phẩm.

Theo các nhà khoa học, việc thiếu hụt GSH có liên quan đến nhiều vấn đề sức khoẻ nghiêm trọng. Chẳng hạn như hội chứng suy giảm miễn dịch HIV, xơ gan, bệnh phổi, viêm dạ dày và tuyến tuỵ, bệnh tiểu đường, các bệnh lý về thần kinh và lão hoá. Phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong sản xuất GSH là lên men bởi nấm men Candida utilis và Saccharomyces cerevisiae. GSH được tổng hợp trong tế bào nấm men (nội bào), và chỉ tiết một lượng nhỏ ra ngoài môi trường nuôi cấy.

GSH tinh khiết được thu nhận bằng cách chiết tách từ sinh khối nấm men, tinh sạch và tạo chế phẩm dạng dung dịch hay bột sấy khô. Hiện nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều sản phẩm chứa GSH, được sử dụng rộng rãi như thực phẩm bổ sung, viên uống chứa GSH chống lão hoá trong công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Các sản phẩm trên cũng đã được tiêu thụ tại Việt Nam, tuy nhiên chủ yếu là các mặt hàng nhập khẩu với giá thành cao. Chính vì vậy, việc tìm ra giải pháp công nghệ giúp cải tiến, hoàn thiện quá trình sản xuất GSH, nhằm hạ giá thành sản xuất là điều cần thiết, là mục tiêu mà các nhà khoa học cũng như các doanh nghiệp trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng đang hướng tới.

HVTH: Trần Thị Hoa 1 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan PHẦN 1. Cấu trúc của glutathione Glutathione là một chất chống oxy hoá trong cơ thể sống.

Đây là một tripeptide bao gồm các đơn phân L-glutamate, L-cysteine và glycine (hình 1. GSH có thể được tìm thấy trong nhiều loại động thực vật, trong đó được tìm thấy nhiều nhất trong nấm men, mầm lúa mạch, và gan động vật [44]. Cấu trúc của GSH chứa một nhóm thiol có tính khử mạnh (R-SH). Glutathione ổn định ở trạng thái rắn nhưng dễ bị oxy hoá trong môi trường nước.

Ở dạng oxy hoá, glutathione disulfide (GSSG) được minh hoạ ở hình 1. Dạng oxy hoá của của GSH được liên kết bằng liên kết disulfide, thu được bằng cách khử hydro ở hai nguyên tử GSH. GSSG bị khử thành GSH bằng enzyme glutathione reductase [31]. Phương trình (1.1) thể hiện phản ứng hoá học này [43],[51].1) +2H Glutathione có thể tồn tại cả ở trạng thái khử và trạng thái oxy hoá trong các tế bào, mô và màng plasma [4].

Trong tế bào và mô khoẻ mạnh, có hơn 90% GSH tồn tại dưới dạng khử và khoảng dưới 10% tồn tại dưới dạng oxy hoá. Tỷ lệ chuyển đổi GSSG – GSH thường được coi là một dấu hiệu của sự mất cân bằng oxy hoá [21],[32]. Cấu trúc của glutathione [4] HVTH: Trần Thị Hoa 2 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS. Trần Liên Hà, TS.

Trương Hương Lan O NH2 H HO N OH N H O O O S S O O O H N HO N OH H NH2 O Hình 1. Cấu trúc của glutathione disulfide [4] 1. Chức năng của glutathione Glutathione có nhiều chức năng sinh lý quan trọng, thể hiện trong hình 1. GSH liên quan tới quá trình chống sự mất cân bằng oxy hoá; vận chuyển axit amin; ổn định hoạt tính enzyme; giải độc các chất ngoại bào và xenobiotic; chuyển hoá nitơ và lưu huỳnh [55],[57].

Tóm tắt về chức năng của glutathione [58] Glutathione có nhiều chức năng sinh lý khác nhau, có thể tóm tắt trong ba khía cạnh chính: chống oxy hóa, chống lại các phân tử ngoại lai và tăng cường miễn dịch [16],[56]. Các chức năng sinh lý này khiến GSH trở thành một loại sinh phẩm quan trọng dùng trong điều trị nhiều bệnh, chẳng hạn như xơ gan, nhiễm HVTH: Trần Thị Hoa 3 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan HIV và viêm tuyến tụy [35],[83].

Ngày nay, GSH đã được sử dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và phụ gia thực phẩm. Công nghệ sản xuất glutathione 1. Lịch sử cấu trúc phân tử của glutathione Glutathione được phát hiện lần đầu tiên bởi J.de Rey-Paihade vào năm 1888 từ cao nấm men và nhiều loại mô động vật (mô cơ xương và gan bò, cơ xương của cá, ruột non và não của cừu) và trong lòng trắng trứng.de Rey-Paihade còn đặt tên cho hợp chất này là philothion với ý nghĩa là tình yêu và lưu huỳnh trong tiếng Hy Lạp [62]. Năm 1921, Hopkins đã xác định được thành phần của philothion phân lập từ gan, cơ xương và nấm men và cho rằng đây là một dipeptide có chứa cysteine và glutamate.

Tuy nhiên, Hopkins và cộng sự đã bỏ qua sự có mặt của glycine trong cấu trúc của philothion. Và để tôn vinh lịch sử phát hiện ra philothion, Hopkins đã đặt tên cho hợp chất này là ‘glutathione’. Dựa trên hàm lượng nitơ và lưu huỳnh có trong GSH được phân lập từ nấm men, máu và gan, năm 1927, Hunter và Eagles đã chỉ ra rằng GSH không phải là một dipeptide chỉ có chứa glutamate-cysteine mà là một tripeptide chứa glutamate-cysteine và một phân tử amino axit trọng lượng phân tử thấp (có thể là serine). Bằng cách sử dụng phương pháp thuỷ phân axit, năm 1929 Hopkins đã xác định được cấu trúc tripeptide bao gồm glutamate, cysteine và glycine của GSH.

Và kết quả này được củng cố bởi nghiên cứu độc lập của tác giả Kendall và cộng sự vào năm 1929 và 1930. Dựa trên thí nghiệm chuẩn độ GSH trong nước và formaldehyde cũng như các giá trị pK quan sát được, năm 1929, Pirie và Pinhey đã báo cáo cấu trúc của GSH là γ-glutamate – cysteine – glycine. Cấu trúc của GSH đã được xác nhận một lần nữa vào năm 1935 bởi Mead và Harington thông qua tổng hợp hoá học từ N- carbobenzoxycystine và glycine ethyl ester. Một năm sau đó, quá trình tổng hợp hoá học khác của GSH được thực hiện bởi Vigneaud và Miller sử dụng S- benzylcysteinylglycine metyl este và hợp chất acyl clorua của N- carbobenzoxyglutamate- α-methyl ester.

Trong suốt nửa thế kỷ trước, GSH được tìm thấy ở hầu khắp các tế bào. Những hợp chất liên quan đã được báo cáo tới hiện tại bao gồm γ-Glu-Cys-Gly-essenceidine ở E. Tổng hợp glutathione bằng phương pháp hoá học 1. Phương pháp tổng hợp từ N-benzyloxycarbonyl cysteine HVTH: Trần Thị Hoa 4 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.

Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan Quá trình tổng hợp glutathione được mô tả lần đầu tiên bởi Harrington và Mead (Hình 1.4) như sau: N-benzyloxycarbonyl cysteine 1 được chuyển đổi thành acyl clorua 2 và sau đó liên kết với glycine ethyl ester 3, sản phẩm 4 được xử lý với Phosphonium iodide trong axit acetic được chuyển thành cysteylglycyl ethyl ester 5 được phân tách thuận tiện dưới dạng hydroiodide. Sau đó axit N- benzyloxycarbonylglutamic 6 được chuyển thành anhydrit N-benzyloxycarbonyl glutamic acid 7. Xử lý thành phần 7 bởi photpho pentaclorua để tạo acyl clorua 8.

Sau đó acyl clorua 8 sẽ kết hợp với cysteylglycyl ethyl ester 5 để tạo ra ester 9. Nhóm chức ester sau đó sẽ được loại bỏ khỏi 9 bằng cách thuỷ phân cẩn thận trong dung dịch kiềm và axit được loại ra sẽ được xử lý với phosphonium iodide dưới điều kiện thông thường. Từ hỗn hợp phản ứng, thu được lượng nhỏ tripeptide glutathione 10 được chứng minh là giống nhau về mọi mặt với một mẫu GSH thu được từ các nguồn tự nhiên [1]. Sơ đồ phản ứng tổng hợp glutathione từ N-benzyloxycarbonyl cysteine [1] HVTH: Trần Thị Hoa 5 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.

Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan 1. Phương pháp tổng hợp từ Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-cystine Berse và cộng sự (1959) đã mô tả phương pháp sản xuất glutathione (Hình 1. Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-cystine 1 được ngưng tụ với glycine ethyl ester 2 trong sự có mặt của N,N’-dicyclohexylcarbodiimide; ester trung gian 3 bị khử một phần để phá vỡ nhóm amino của L-cysteine mà không phân cắt liên kết disulfate của nó.

Kết quả dietyl L-cysteinyl diglycinat 4 được ngưng tụ với 2 đương lượng mol của p-nitrocarbobenzoxy-L-glutamic 5 để tạo ra ester 6, sau đó cấu trúc GSH được hình thành. Quá trình xà phòng hoá (a) và sự khử một phần (b) của 6 tạo ra GSH oxy hoá. Quá trình hydro hoá với xúc tac paladi tạo ra GSH 7 [7]. Sơ đồ phản ứng tổng hợp Glutathione từ Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-cystine [7] Mặc dù, sản xuất GSH bằng phương pháp hoá học đã được thương mại hoá vào những năm 1950 của thế kỷ trước, nhưng sản phẩm tạo ra bởi phương pháp này thường là hỗn hợp racemic bao gồm cả hai dạng đồng phân D- và L-.

Bởi vì, chỉ có đồng phân dạng L mới có chức năng sinh lý, do đó đòi hỏi thêm giải pháp tối ưu để tách đồng phân dạng L ra khỏi hỗn hợp với đồng phân dạng D. HVTH: Trần Thị Hoa 6 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan Dựa trên sự nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp GSH trong gan và các đặc trưng của quá trình này, năm 1949 Bloch đã khám phá ra con đường sản xuất GSH bằng phương pháp enzyme và lên men vi sinh vật.

Theo đó, GSH được tổng hợp bằng hai phản ứng enzyme phụ thuộc ATP kế tiếp nhau [44]. Đầu tiên dipeptide γ-glutamylcysteine (γ-GC) được tổng hợp từ axit glutamic và L-cysteine bởi enzyme dipeptide γ-glutamylcysteine synthetase (cũng được biết đến với tên gọi glutamate-cysteine ligase, EC 6. Trong bước thứ 2, glycine được gắn vào vị trí C cuối của γ-glutamylcysteine (γ-GC) bởi glutathione synthetase (EC 6.2, GSH II) để tạo thành GSH. Thông thường, hoạt động của GSH I bị ức chế phản hồi bởi GSH để tránh sự tích tụ quá mức GSH, bảo đảm hàm lượng GSH ở mức độ sinh lý [35].

Trong khi đó, GSH nội bào có thể bị phân huỷ bởi glutamyltranspeptidase (γ-GTP) để tạo thành gốc γ-glutamyl – có vai trò quan trọng trong vận chuyển amino axit. Để sản xuất quá mức GSH sử dụng xúc tác sinh học hoặc lên men vi sinh vật cần phải giải phóng GSH I khỏi sự ức chế phản hồi bởi GSH cùng với đó là sự bất hoạt hoặc loại bỏ enzyme γ-GTP [46].6 cung cấp một cái nhìn tổng quan về sinh hoá, cho thấy các con đường sinh tổng hợp, chuyển hoá và minh hoạ các vai trò sinh lý của GSH.