LỜI MỞ ĐẦU Glutathione (GSH) là thành phần thiol-nonprotein dồi dào nhất trong cơ thể sinh vật sống, đặc biệt chiếm ưu thế trong tế bào nhân thực. Có tới 90% glutathione hoạt động ở dạng khử trong tế bào (vi khuẩn), mô, plasma. GSH tham gia và đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý khác nhau, tuy nhiên có thể khái quát vai trò của GSH trong 3 chức năng chính: chống oxy hoá, tăng cường miễn dịch và khử độc tế bào trong các sinh vật nhân thực bậc cao. Do đó GSH được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y sinh và có tiềm năng to lớn sử dụng trong ngành thực phẩm và mỹ phẩm.
Theo các nhà khoa học, việc thiếu hụt GSH có liên quan đến nhiều vấn đề sức khoẻ nghiêm trọng. Chẳng hạn như hội chứng suy giảm miễn dịch HIV, xơ gan, bệnh phổi, viêm dạ dày và tuyến tuỵ, bệnh tiểu đường, các bệnh lý về thần kinh và lão hoá. Phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong sản xuất GSH là lên men bởi nấm men Candida utilis và Saccharomyces cerevisiae. GSH được tổng hợp trong tế bào nấm men (nội bào), và chỉ tiết một lượng nhỏ ra ngoài môi trường nuôi cấy.
GSH tinh khiết được thu nhận bằng cách chiết tách từ sinh khối nấm men, tinh sạch và tạo chế phẩm dạng dung dịch hay bột sấy khô. Hiện nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều sản phẩm chứa GSH, được sử dụng rộng rãi như thực phẩm bổ sung, viên uống chứa GSH chống lão hoá trong công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Các sản phẩm trên cũng đã được tiêu thụ tại Việt Nam, tuy nhiên chủ yếu là các mặt hàng nhập khẩu với giá thành cao. Chính vì vậy, việc tìm ra giải pháp công nghệ giúp cải tiến, hoàn thiện quá trình sản xuất GSH, nhằm hạ giá thành sản xuất là điều cần thiết, là mục tiêu mà các nhà khoa học cũng như các doanh nghiệp trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng đang hướng tới.
HVTH: Trần Thị Hoa 1 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan PHẦN 1. Cấu trúc của glutathione Glutathione là một chất chống oxy hoá trong cơ thể sống.
Đây là một tripeptide bao gồm các đơn phân L-glutamate, L-cysteine và glycine (hình 1. GSH có thể được tìm thấy trong nhiều loại động thực vật, trong đó được tìm thấy nhiều nhất trong nấm men, mầm lúa mạch, và gan động vật [44]. Cấu trúc của GSH chứa một nhóm thiol có tính khử mạnh (R-SH). Glutathione ổn định ở trạng thái rắn nhưng dễ bị oxy hoá trong môi trường nước.
Ở dạng oxy hoá, glutathione disulfide (GSSG) được minh hoạ ở hình 1. Dạng oxy hoá của của GSH được liên kết bằng liên kết disulfide, thu được bằng cách khử hydro ở hai nguyên tử GSH. GSSG bị khử thành GSH bằng enzyme glutathione reductase [31]. Phương trình (1.1) thể hiện phản ứng hoá học này [43],[51].1) +2H Glutathione có thể tồn tại cả ở trạng thái khử và trạng thái oxy hoá trong các tế bào, mô và màng plasma [4].
Trong tế bào và mô khoẻ mạnh, có hơn 90% GSH tồn tại dưới dạng khử và khoảng dưới 10% tồn tại dưới dạng oxy hoá. Tỷ lệ chuyển đổi GSSG – GSH thường được coi là một dấu hiệu của sự mất cân bằng oxy hoá [21],[32]. Cấu trúc của glutathione [4] HVTH: Trần Thị Hoa 2 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS. Trần Liên Hà, TS.
Trương Hương Lan O NH2 H HO N OH N H O O O S S O O O H N HO N OH H NH2 O Hình 1. Cấu trúc của glutathione disulfide [4] 1. Chức năng của glutathione Glutathione có nhiều chức năng sinh lý quan trọng, thể hiện trong hình 1. GSH liên quan tới quá trình chống sự mất cân bằng oxy hoá; vận chuyển axit amin; ổn định hoạt tính enzyme; giải độc các chất ngoại bào và xenobiotic; chuyển hoá nitơ và lưu huỳnh [55],[57].
Tóm tắt về chức năng của glutathione [58] Glutathione có nhiều chức năng sinh lý khác nhau, có thể tóm tắt trong ba khía cạnh chính: chống oxy hóa, chống lại các phân tử ngoại lai và tăng cường miễn dịch [16],[56]. Các chức năng sinh lý này khiến GSH trở thành một loại sinh phẩm quan trọng dùng trong điều trị nhiều bệnh, chẳng hạn như xơ gan, nhiễm HVTH: Trần Thị Hoa 3 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan HIV và viêm tuyến tụy [35],[83].
Ngày nay, GSH đã được sử dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và phụ gia thực phẩm. Công nghệ sản xuất glutathione 1. Lịch sử cấu trúc phân tử của glutathione Glutathione được phát hiện lần đầu tiên bởi J.de Rey-Paihade vào năm 1888 từ cao nấm men và nhiều loại mô động vật (mô cơ xương và gan bò, cơ xương của cá, ruột non và não của cừu) và trong lòng trắng trứng.de Rey-Paihade còn đặt tên cho hợp chất này là philothion với ý nghĩa là tình yêu và lưu huỳnh trong tiếng Hy Lạp [62]. Năm 1921, Hopkins đã xác định được thành phần của philothion phân lập từ gan, cơ xương và nấm men và cho rằng đây là một dipeptide có chứa cysteine và glutamate.
Tuy nhiên, Hopkins và cộng sự đã bỏ qua sự có mặt của glycine trong cấu trúc của philothion. Và để tôn vinh lịch sử phát hiện ra philothion, Hopkins đã đặt tên cho hợp chất này là ‘glutathione’. Dựa trên hàm lượng nitơ và lưu huỳnh có trong GSH được phân lập từ nấm men, máu và gan, năm 1927, Hunter và Eagles đã chỉ ra rằng GSH không phải là một dipeptide chỉ có chứa glutamate-cysteine mà là một tripeptide chứa glutamate-cysteine và một phân tử amino axit trọng lượng phân tử thấp (có thể là serine). Bằng cách sử dụng phương pháp thuỷ phân axit, năm 1929 Hopkins đã xác định được cấu trúc tripeptide bao gồm glutamate, cysteine và glycine của GSH.
Và kết quả này được củng cố bởi nghiên cứu độc lập của tác giả Kendall và cộng sự vào năm 1929 và 1930. Dựa trên thí nghiệm chuẩn độ GSH trong nước và formaldehyde cũng như các giá trị pK quan sát được, năm 1929, Pirie và Pinhey đã báo cáo cấu trúc của GSH là γ-glutamate – cysteine – glycine. Cấu trúc của GSH đã được xác nhận một lần nữa vào năm 1935 bởi Mead và Harington thông qua tổng hợp hoá học từ N- carbobenzoxycystine và glycine ethyl ester. Một năm sau đó, quá trình tổng hợp hoá học khác của GSH được thực hiện bởi Vigneaud và Miller sử dụng S- benzylcysteinylglycine metyl este và hợp chất acyl clorua của N- carbobenzoxyglutamate- α-methyl ester.
Trong suốt nửa thế kỷ trước, GSH được tìm thấy ở hầu khắp các tế bào. Những hợp chất liên quan đã được báo cáo tới hiện tại bao gồm γ-Glu-Cys-Gly-essenceidine ở E. Tổng hợp glutathione bằng phương pháp hoá học 1. Phương pháp tổng hợp từ N-benzyloxycarbonyl cysteine HVTH: Trần Thị Hoa 4 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.
Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan Quá trình tổng hợp glutathione được mô tả lần đầu tiên bởi Harrington và Mead (Hình 1.4) như sau: N-benzyloxycarbonyl cysteine 1 được chuyển đổi thành acyl clorua 2 và sau đó liên kết với glycine ethyl ester 3, sản phẩm 4 được xử lý với Phosphonium iodide trong axit acetic được chuyển thành cysteylglycyl ethyl ester 5 được phân tách thuận tiện dưới dạng hydroiodide. Sau đó axit N- benzyloxycarbonylglutamic 6 được chuyển thành anhydrit N-benzyloxycarbonyl glutamic acid 7. Xử lý thành phần 7 bởi photpho pentaclorua để tạo acyl clorua 8.
Sau đó acyl clorua 8 sẽ kết hợp với cysteylglycyl ethyl ester 5 để tạo ra ester 9. Nhóm chức ester sau đó sẽ được loại bỏ khỏi 9 bằng cách thuỷ phân cẩn thận trong dung dịch kiềm và axit được loại ra sẽ được xử lý với phosphonium iodide dưới điều kiện thông thường. Từ hỗn hợp phản ứng, thu được lượng nhỏ tripeptide glutathione 10 được chứng minh là giống nhau về mọi mặt với một mẫu GSH thu được từ các nguồn tự nhiên [1]. Sơ đồ phản ứng tổng hợp glutathione từ N-benzyloxycarbonyl cysteine [1] HVTH: Trần Thị Hoa 5 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.
Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan 1. Phương pháp tổng hợp từ Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-cystine Berse và cộng sự (1959) đã mô tả phương pháp sản xuất glutathione (Hình 1. Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-cystine 1 được ngưng tụ với glycine ethyl ester 2 trong sự có mặt của N,N’-dicyclohexylcarbodiimide; ester trung gian 3 bị khử một phần để phá vỡ nhóm amino của L-cysteine mà không phân cắt liên kết disulfate của nó.
Kết quả dietyl L-cysteinyl diglycinat 4 được ngưng tụ với 2 đương lượng mol của p-nitrocarbobenzoxy-L-glutamic 5 để tạo ra ester 6, sau đó cấu trúc GSH được hình thành. Quá trình xà phòng hoá (a) và sự khử một phần (b) của 6 tạo ra GSH oxy hoá. Quá trình hydro hoá với xúc tac paladi tạo ra GSH 7 [7]. Sơ đồ phản ứng tổng hợp Glutathione từ Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-cystine [7] Mặc dù, sản xuất GSH bằng phương pháp hoá học đã được thương mại hoá vào những năm 1950 của thế kỷ trước, nhưng sản phẩm tạo ra bởi phương pháp này thường là hỗn hợp racemic bao gồm cả hai dạng đồng phân D- và L-.
Bởi vì, chỉ có đồng phân dạng L mới có chức năng sinh lý, do đó đòi hỏi thêm giải pháp tối ưu để tách đồng phân dạng L ra khỏi hỗn hợp với đồng phân dạng D. HVTH: Trần Thị Hoa 6 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan Dựa trên sự nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp GSH trong gan và các đặc trưng của quá trình này, năm 1949 Bloch đã khám phá ra con đường sản xuất GSH bằng phương pháp enzyme và lên men vi sinh vật.
Theo đó, GSH được tổng hợp bằng hai phản ứng enzyme phụ thuộc ATP kế tiếp nhau [44]. Đầu tiên dipeptide γ-glutamylcysteine (γ-GC) được tổng hợp từ axit glutamic và L-cysteine bởi enzyme dipeptide γ-glutamylcysteine synthetase (cũng được biết đến với tên gọi glutamate-cysteine ligase, EC 6. Trong bước thứ 2, glycine được gắn vào vị trí C cuối của γ-glutamylcysteine (γ-GC) bởi glutathione synthetase (EC 6.2, GSH II) để tạo thành GSH. Thông thường, hoạt động của GSH I bị ức chế phản hồi bởi GSH để tránh sự tích tụ quá mức GSH, bảo đảm hàm lượng GSH ở mức độ sinh lý [35].
Trong khi đó, GSH nội bào có thể bị phân huỷ bởi glutamyltranspeptidase (γ-GTP) để tạo thành gốc γ-glutamyl – có vai trò quan trọng trong vận chuyển amino axit. Để sản xuất quá mức GSH sử dụng xúc tác sinh học hoặc lên men vi sinh vật cần phải giải phóng GSH I khỏi sự ức chế phản hồi bởi GSH cùng với đó là sự bất hoạt hoặc loại bỏ enzyme γ-GTP [46].6 cung cấp một cái nhìn tổng quan về sinh hoá, cho thấy các con đường sinh tổng hợp, chuyển hoá và minh hoạ các vai trò sinh lý của GSH.