LỜI MỞ ĐẦU Xúc tác sinh học ngày càng phố biến trong công nghệ thực phẩm, sinh học và y duoc với các ưu điểm vượt trội như: thân thiện với môi trường, an toàn cho sức khỏe của con người, có tính xúc tác đặc hiệu cao nên sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao hon so voi việc sử dụng chất xúc tác hóa học. Tuy nhiên, việc sử dụng chất xúc tác sinh học van còn tôn tại một số hạn chế như: enzyme tự do khó tách ra khỏi sản phẩm, khó ngừng phản ứng và phải sử dụng các tách nhân biến tính protein để bất hoạt enzyme, không thu hồi và tái chế được. Để khắc phục nhược điểm này, người ta tiến hành cố định enzyme lên chất mang để dễ dàng tách enzyme ra khỏi cơ chất khi muốn ngừng quá trình phản ứng và có thê tái sử dụng enzyme cho những lân sau. Trong sản xuất công nghiệp, enzyme lipase là một trong số những enzym có tính ứng dụng cao, đặc biệt là lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm dé thu được những sản phẩm có lợi cho sức khỏe con người.
Enzyme lipase có bản chất là protein, hoạt động xúc tác tại bề mặt liên pha dầu — nước, tan trong nước cho nên khi ở trạng thái tự do, rất khó dé tách enzyme lipase ra khỏi môi trường phản ứng. Dé góp phan tìm hiểu, cải tiến và tăng khả năng ứng dụng enzyme lipase trong sản xuất thực phẩm nói riêng và các ngành công nghiệp khác, chúng tôi tiễn hành nghiên cứu cô định enzyme Porcine Pancreas trên chất mang hydrotalcite Mg/Al- CO3? đã nung 6 450°C dé làm xúc tác trong phản ứng thủy phân dầu béo. Enzyme Porcine pancreas lipase (PPL) [1] 1. Dinh nghia Porcine pancreas lipase là phan tử protein hình cầu bao gồm mach don chứa 449 amino acid.
Khối lượng phan tử khoảng 50-52 kDa. Thể tích mỗi phân tử 4. Cau trúc và cơ chế hoạt động Câu trúc của Porcine pancreas lipase (PPL) PPL có 3 vùng cấu trúc trong đó 2 vùng xác định. Vùng N có cau trúc dang 0œ/B.
bao gồm nhóm tham gia hoạt động xúc tác chứa Ser, Asp va His ở vị trí thứ 153, 177 và 264. Cau trúc tinh thé của PPL có một vài chỗ vòng, các vòng này tạo thành từ bộ ba các phân tử xúc tác chính. Vị trí không gian của những vòng này có thể là nguyên nhân ngăn cản sự tiếp xúc của cơ chất với vùng xúc tác. Cau trúc mở của PPL ở vùng gấp khúc 6n định nhờ các liên kết hydro giữa vùng gập và colipase — nơi cơ chất thực hiện phản ứng xúc tác.
Vùng C có cấu trúc kẹp, bao gồm từ 337-449 aminoacid thực hiện những phản ứng xúc tác chuyền biệt nhờ hoạt động của colipase. Colipase là một phân tử protein nhỏ có khối lượng phân tử khoảng 10 kDa. [1] N-Terminal Domain C-Terminal ree} Domain S ` Cơ chất Phức hợp cơ chất- colipase-enzyme hoạt hóa Cơ chế hoạt động Theo các nghiên cứu, lipase có các nhóm serine, histidine và aspastic acid ở trung tâm hoạt động. Khi có mặt nhiều nước trong cơ chất, phản ứng thủy phân được ưu tiên.
Hoạt tính của lipase đạt cực đại chỉ khi nó được phân tán vào giữa bề mặt phân pha dầu nước. Quá trình đó được gọi là quá trình hoạt hoá phân pha. Khi không có mặt nước hoặc khi có nước với lượng nhỏ, phan ứng ester hoa được ưu tiền. Trong trường hợp này, những đặc tính như tốc độ xúc tác và tính đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng và bản chất cơ chất (Woolley P.
Khi một phân tử triacylglycerol đến trung tâm hoạt động (vùng ky nước), phân tử này sẽ tiếp xúc với bộ ba xúc tác Ser152, His263 và Asp176. Lúc này, bộ ba xúc tác sẽ thực hiện phản ứng thủy phân. Bộ ba được định hướng khi một trong số các nguyên tử oxygen ở phan cuối của Asp176 liên kết với một nguyên tử nitrogen trong vòng histidine bằng liên kết hydro, giúp cho His263 được định vị để nguyên tử nitrogen khác tạo liên kết hydro với nhóm hydroxyl của Ser152. Liên kết hydro thứ hai này kéo hydro ra xa từ liên kết cộng hóa trị với oxygen một cách tương đối, với định vị nay thi enzyme san sang dé hoạt động.
Bước đầu tiên của phan ứng xảy ra dựa trên phản ứng thé ái nhân của serine va của carbon glycerol thứ nhất của chuỗi ở bên cạnh Ser152. Tác nhân ái nhân là nhóm OH của serine mang điện tích âm tan công vào trung tâm tích điện dương của carbon glycerol thứ nhất, làm cho liên kết giữa carbon glycerol thứ nhất và oxygen của este yếu đi. Oxygen trong liên kết este trở thành nhóm linh động (leaving group) và được thêm một proton H” vào từ nhóm OH’ của Ser152 để trung hòa điện tích âm. Khi oxygen nhận được H”, sản phẩm acid béo từ vị trí đầu tiên được hình thành và hoàn toản tự do.
Lúc này, phần đang chứa glycerol vẫn giữ liên kết với oxygen của Ser152, tuy nhiên liên kết này phải bị phá vỡ dé enzyme duy trì chức năng. Bước thứ hai của cơ chế thủy phân liên quan đến sự hình thành và di chuyển của diglyceride từ nửa đang chứa glycerol. Dé giải phóng ra phân tử glycerol, cần một nhóm hydroxyl để liên kết với carbon đầu tiên của glycerol và một ion H* để thêm một proton trở lại vào oxy của Ser152. Một phân tử nước ở môi trường ngoài cung cấp các thành phân cần thiết này.
Thông qua tương tác hydro, phân tử nước bị phân ly thành H* và OH’. Do sự hình thành cau nối hydro giữa H* với OH’ của hai phân tử nước khác nhau, ion hydronium (H30") được hình thành. lon hydronium có một momen lưỡng cực rất lớn và hoạt động như một tác nhân ái nhần lên carbon glycerol đầu tiên. Thời điểm nay, oxygen của Ser152 rời khỏi nhóm.
Chuỗi bên cạnh tích điện âm của Ser152 nhanh chóng thêm một proton vào bởi ion H” từ nước. Lúc này, sản phẩm diglyceride được hình thành. Liên kết hydro giữa nitrogen thom của His263 và nhóm hydroxyl trên Ser152 được phục hồi trở lại và trở về cau trúc ban đầu của nó, sẵn sàng cho phản ứng khác. Phản ứng thủy phân tiếp theo xảy ra để xúc tác diglyceride vừa mới hình thành thành một acid béo và một monoglyceride.
Cơ chế trong trường hợp này giống hai bước như với thủy phân triglyceride, ngoại trừ các tan công ái nhân lên carbon thứ ba của glycerol. Cơ chế này cho ra một monoglyceride và acid béo mới từ trung tâm hoạt động. và enzyme chuẩn bị tiến đến triglyceride khác. Tinh chất của enzyme Porcine pancreas lipase Khối lượng phân tử va điểm dang điện Porcine pancreas lipase là phân tử protein hình cầu.
Khối lượng phân tử khoảng 50-52 kDa. [4| Điêm đăng điện của enzyme là điêm pH mà tại đó enzyme trung hòa về điện. Đối với PPL thì điểm đăng điện ở pH 6. Hoạt tính của enzyme Porcine pancreas lipase So với lipase thu nhận từ các nguồn như từ vi sinh vat, PPL ít pho biến hơn.
Tuy nhiên, PPL lại có hoạt tính và độ ôn định cao trong môi trường ky nước để thực hiện các phản ứng thủy phân và ester hóa. Hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ các nguồn khác nhau Nguồn thu nhận enzyme Hoạt tính enzyme/ cơ chất ( U/mg) Aspergillus niger 0.2 /triolein Aspergillus oryzae ~50 /triolein Aspergillus sp.2a /triacetin Candida antarctica > ja/triolein Chromobacterium 2000-8000 b/olive oil Human pancreatic >250 b/1.2 diglyceride Mucor miehei >4000 a /olive oi Mucor javanicus >300a /olive oil Penicillium camembertii >50a /vinyl laurate Porci ti ` gang 100-400 b/triacetin hay dâu olive (Type I) Pseudomonas cepacia >30 a/triolein Pseudomonas fluorescens >160 a/triolein Pseudomonas sp. >15a /triglyceride Rhizopus arrhizus ~10a /tributyrin hay triolein Rhizopus niveus >1.5 / dau olive Hoạt tinh cua enzyme Porcine pancreas lipase nói riêng va enzyme lipase được xác định thong qua hoạt độ (độ hoạt động) cua enzyme, bang cach xac dinh lượng co chat bi mat đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng. Hoạt độ cua enzyme được định nghĩa như sau: một đơn vi hoạt độ cua enzyme là lượng enzyme chuyên hóa một micromol co chat hoặc một micromol sản pham tạo thành sau một khoảng thời gian phản ứng tại một nhiệt độ và pH xác định.
Kí hiệu: UI [5] Tính đặc hiệu cơ chất [1] Lipase (EC.3) là enzyme xúc tác trong quá trình thuỷ phân các triglyceride không lẫn nước ở mặt phân cách dầu — nước. Các chất tạo thành của quá trình thuỷ phân là 1,2- hoặc 2,3- diglycerit; 2-monoglycerit; 1- hoặc 3- monoglycerit va glycerol. Lipase là chất xúc tác thuỷ phân chuỗi triglyceride dai hoặc các este metyl alcohol của một chuối dai các acid béo. Các yêu tô ảnh hướng lên tính chat cua Porcine pancreas lipase Anh hưởng của chát nhũ hóa Mục đích chính của việc sử dụng tác nhân nhũ hóa là để làm tăng vùng phân pha dau — nước nhằm làm tăng hiệu quả thủy phân của enzyme.
Hau hết chất nhũ hóa không ảnh hưởng lên hoạt tính của enzyme PPL. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng gum arabic làm chất nhũ hóa. Gum Arabic được sử dụng pho biến nhất trong quá trình thủy phân triacylglycerol, cung cấp hệ nhũ có thé bao quản vài tuần. Gum Arabic tạo hệ nhũ bền ma không gây trở ngại cho hoạt động của enzyme.
Tuy nhiên, nồng độ gum cao có thé làm giảm nghiêm trọng hoạt tính của PPL. Gum Arabic có thành phan chính là các chuỗi polysaccharide, bao gôm các glucuronic acid. O trang thái ion hóa thông thường với pH trung tính, nhóm carboxyl của acid uronic có thé phóng thích H” và tạo môi trường nhũ tích điện âm trên bề mặt. Anh hưởng của pH pH của môi trường ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của enzyme do ảnh hưởng tới mức độ ion hóa của co chat và độ bên protein của enzyme.
PPL biêu hiện hoạt tính cao nhất trong môi trường kiềm ở khoảng pH 7. Khi thủy phân dầu olive, pH thích hợp trong khoảng 7-9. Ảnh hưởng pH lên hoạt tính của enzyme lipase thu nhận từ các nguồn khác nhau Vi khuẩn PHopt Nam moc va nam men PHopt Bacillus sp.0 Bacillus coagulans BTS-3 8.5 Aspergillus oryzae RIBI2S 5.0 Aeromonas sobria LP004 6.5 Anh hưởng cua nhiệt độ PPL hoạt động trong khoảng nhiệt độ 35-45°C. Hoạt tính đạt tối đa khi thủy phân triaglycerols với khoảng nhiệt độ 35 và 40°C, pH 6.
Ở nhiệt độ trung bình PPL có khả năng làm việc trong môi trường ky nước. Ở 35°C PPL vẫn duy trì hoạt tính sau 2 ngày ủ trong đệm phosphate. Sau 1 giờ, duy trì được 85% hoạt tính ở 30°C và 50% hoạt tinh ở 50°C. Hoạt tính và độ ôn định của PPL trong môi trường ky nước có gia tri rất lớn trong ứng dụng tổng hợp chất hữu cơ.