Định Danh Vi Khuẩn Ralstonia solanacearum Gây Bệnh Héo Xanh Trên Cây Họ Cà

Khóa luận nghiên cứu định danh vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà phê qua trình tự gen 16S rDNA và đánh giá đa dạng di truyền.

• Tác giả: Phạm Xuân Mai
• Người hướng dẫn: TS. Lê Khắc Hoàng
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Định Danh Vi Khuẩn Ralstonia solanacearum Gây Bệnh Héo Xanh Trên Cây Họ Cà
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2019 — 2023
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu tổng quan về cây họ cà
• 1.2. Vi khuẩn Ralstonia solanacearum
• 1.2.1. Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum
• 1.2.2. Đặc điểm cấu tạo và điều kiện phát triển của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
• 1.2.3. Hình thức xâm nhập vào cây ký chủ
• 1.3. Biện pháp phòng trừ
• 1.4. Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam và thế giới
• 1.4.1. Tình hình nghiên cứu bệnh ở Việt Nam
• 1.4.2. Tình hình nghiên cứu bệnh ngoài nước
• 1.5. Lịch sử nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn hại cây trồng
• 1.6. Những nghiên cứu về vi khuẩn gây bệnh héo xanh
• 1.7. Phân tích đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị sinh học phân tử
• 1.7.1. Khái niệm đa dạng di truyền
• 1.7.2. Chỉ thị sinh học phân tử - chỉ thị DNA
• 1.7.3. Kỹ thuật ISSR (Inter-simple Sequence Repeats)
• 1.7.4. Đánh giá đa dạng di truyền
• 1.7.5. Một số nghiên cứu về đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum ở Việt Nam và trên thế giới
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Các dòng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm
• 2.2. Dụng cụ, thiết bị máy móc
• 2.3. Môi trường, hóa chất sử dụng
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Định danh vi khuẩn gây bệnh héo xanh bằng trình tự vùng gen 16S-rDNA
• 2.4.1.1. Phương pháp ly trích DNA
• 2.4.1.2. Phân tích PCR
• 2.4.2. Đánh giá đa dạng di truyền
• 2.4.2.1. Phương pháp ly trích DNA
• 2.4.2.2. Phân tích PCR
• 2.4.2.3. Điện di đọc kết quả PCR trên gel agarose
• 2.4.2.4. Đánh giá đa dạng về đặc điểm di truyền
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Định danh vi khuẩn gây bệnh héo xanh bằng sinh học phân tử
• 3.2. Đánh giá sự đa dạng về đặc điểm di truyền của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây họ cà bằng chỉ thị phân tử ISSR
• 3.2.1. Sản phẩm PCR với primer ISSR
• 3.2.2. Phân tích sự đa dạng di truyền của 32 chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây họ cà
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Vi Khuẩn Ralstonia solanacearum Gây Bệnh Héo Xanh

Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum là một trong những vấn đề nghiêm trọng trong nông nghiệp, đặc biệt là đối với cây họ cà. Vi khuẩn này có khả năng lây nhiễm trên hơn 200 loài thực vật, gây thiệt hại lớn cho năng suất cây trồng. Nghiên cứu này nhằm mục đích định danh vi khuẩn và đánh giá sự đa dạng di truyền của chúng, từ đó tìm ra các biện pháp quản lý hiệu quả.

1.1. Đặc Điểm Của Vi Khuẩn Ralstonia solanacearum

Ralstonia solanacearum là vi khuẩn gram âm, hình que, có khả năng tồn tại trong đất và nước. Vi khuẩn này phát triển tốt ở nhiệt độ từ 25 đến 35°C và có thể gây hại cho nhiều loại cây trồng, đặc biệt là cà chua và khoai tây.

1.2. Tác Động Của Ralstonia solanacearum Đến Cây Họ Cà

Vi khuẩn này gây ra triệu chứng héo xanh, làm giảm năng suất cây trồng. Các nghiên cứu cho thấy thiệt hại có thể lên đến 95% nếu không có biện pháp phòng ngừa kịp thời.

II. Vấn Đề Nghiên Cứu Bệnh Héo Xanh Tại Việt Nam

Tình hình bệnh héo xanh do Ralstonia solanacearum gây ra đang ngày càng nghiêm trọng tại Việt Nam. Nhiều vùng trồng cây họ cà bị ảnh hưởng nặng nề, đặc biệt là ở đồng bằng sông Hồng. Việc nghiên cứu và tìm ra các biện pháp phòng trừ hiệu quả là rất cần thiết.

2.1. Tình Hình Nghiên Cứu Bệnh Héo Xanh Ở Việt Nam

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng bệnh héo xanh do Ralstonia solanacearum đang gia tăng, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng cây trồng. Các biện pháp phòng trừ hiện tại chưa đạt hiệu quả cao.

2.2. Thách Thức Trong Quản Lý Bệnh Héo Xanh

Sự đa dạng di truyền của vi khuẩn gây bệnh là một thách thức lớn trong việc phát triển giống cây kháng bệnh. Các yếu tố môi trường cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Định Danh Vi Khuẩn Ralstonia solanacearum

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh vi khuẩn Ralstonia solanacearum thông qua trình tự vùng gen 16S-rDNA. Phương pháp này cho phép xác định chính xác các chủng vi khuẩn gây bệnh.

3.1. Kỹ Thuật PCR Trong Định Danh Vi Khuẩn

Kỹ thuật PCR được sử dụng để khuếch đại vùng gen 16S-rDNA, giúp xác định các chủng vi khuẩn. Kết quả cho thấy độ tương đồng cao với các trình tự đã được công bố.

3.2. Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền Bằng ISSR

Phương pháp ISSR được áp dụng để đánh giá sự đa dạng di truyền của các dòng vi khuẩn. Kết quả cho thấy sự đa dạng cao, với nhiều nhóm vi khuẩn khác nhau.

IV. Ứng Dụng Kết Quả Nghiên Cứu Vào Thực Tiễn

Kết quả nghiên cứu về Ralstonia solanacearum có thể được áp dụng để phát triển các giống cây kháng bệnh và cải thiện quy trình quản lý bệnh héo xanh. Việc áp dụng các biện pháp canh tác hợp lý cũng rất quan trọng.

4.1. Phát Triển Giống Cây Kháng Bệnh

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc phát triển giống cây kháng bệnh là một trong những biện pháp hiệu quả nhất để giảm thiểu thiệt hại do bệnh héo xanh gây ra.

4.2. Biện Pháp Canh Tác Hiệu Quả

Áp dụng biện pháp luân canh và vệ sinh đồng ruộng có thể giúp giảm thiểu sự lây lan của vi khuẩn Ralstonia solanacearum trong các vùng trồng cây họ cà.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Ralstonia solanacearum

Nghiên cứu về Ralstonia solanacearum không chỉ giúp định danh vi khuẩn mà còn cung cấp thông tin quan trọng về sự đa dạng di truyền của chúng. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc quản lý bệnh héo xanh trên cây họ cà.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Về Bệnh Héo Xanh

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp phòng trừ hiệu quả hơn và tìm hiểu sâu hơn về cơ chế kháng bệnh của cây trồng.

5.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Đối Với Nông Nghiệp

Việc hiểu rõ về Ralstonia solanacearum và bệnh héo xanh sẽ giúp nông dân có những biện pháp phòng ngừa hiệu quả, từ đó nâng cao năng suất cây trồng.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Bệnh héo xanh vi khuẩn (Bacterial Wilt) do phức hợp loài Ralstonia solanacearum gây ra là một trong những hiểm họa nghiêm trọng hàng đầu đối với nền nông nghiệp toàn cầu, đặc biệt tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Theo thống kê từ Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) và Trung tâm Nghiên cứu Rau Châu Á (AVRDC), mầm bệnh này có thể tấn công hơn 200 loài thực vật thuộc trên 50 họ khác nhau, gây thiệt hại năng suất từ 15% đến 95%, thậm chí làm mất trắng hoàn toàn 100% diện tích canh tác cà chua (Solanum lycopersicum), khoai tây (Solanum tuberosum) và ớt (Capsicum annuum).

Tại Việt Nam, đặc biệt là các vùng chuyên canh rau trọng điểm như Lâm Đồng và Đồng bằng sông Hồng, vi khuẩn tồn lưu sâu trong đất từ 5 - 6 năm, lây truyền qua nguồn nước tưới và xâm nhiễm vào hệ thống mạch dẫn của rễ. Các biện pháp phòng trừ hóa học gần như không mang lại hiệu quả bền vững do vi khuẩn khu trú bên trong mạch xylem. Trong khi đó, việc chọn tạo giống kháng gặp nhiều trở ngại lớn vì tính kháng của cây trồng dễ bị bẻ gãy trước sự phân hóa di truyền phức tạp và đa dạng sinh học cao của các chủng bản địa.

                  [Vết thương rễ / Lỗ thở tự nhiên]
                     [Xâm nhiễm hệ mạch Xylem]
              [Tăng sinh khối & Tiết Exopolysaccharide (EPS)]
               [Tắc nghẽn mạch dẫn nước & dinh dưỡng]
            [Héo xanh rũ nhanh - Cây chết giữ nguyên màu xanh]

Problem Statement

Phương pháp nhận diện truyền thống dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy KBA (King's B Agar), thử nghiệm sinh hóa phân loại biovar (khả năng oxy hóa đường và rượu) đòi hỏi thời gian ủ dài (3 - 7 ngày), tốn công lao động và không phân biệt được các dòng vi khuẩn có kiểu hình tương đồng nhưng mang biến dị di truyền mức độ phân tử. Sự thiếu hụt dữ liệu về cơ cấu di truyền quần thể R. solanacearum tại thực địa dẫn đến tình trạng mất kiểm soát dịch bệnh và thất bại trong việc bố trí giống kháng thích nghi.

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể

1. Định danh phân tử chính xác: Ly trích DNA tổng số và khuếch đại thành công đoạn gen chỉ thị 16S-rDNA (~1400 - 1500 bp) của 10 đại diện chủng vi khuẩn gây bệnh bằng cặp mồi phổ biến 27F/1492R.
2. Phân tích phả hệ di truyền: Xác định tỷ lệ tương đồng nucleotide thông qua công cụ BLASTn trên cơ sở dữ liệu NCBI GenBank và thiết lập cây phát sinh loài (phylogenetic tree) bằng phần mềm MEGA 11 với kiểm định Bootstrap 1000 lần lặp.
3. Đánh giá đa dạng di truyền: Tối ưu hóa chu trình nhiệt PCR-ISSR cho 8 chỉ thị phân tử (AF80820, AF80821, AF80822, AF80825, UBC808, UBC810, UBC834, UBC841) trên 32 dòng vi khuẩn thu thập tại tỉnh Lâm Đồng.
4. Phân nhóm di truyền: Xây dựng ma trận nhị phân (0/1), tính toán hệ số tương đồng Simple Matching (SM) và thiết lập sơ đồ phân nhánh (dendrogram) bằng giải thuật UPGMA trên phần mềm NTSYSpc v2.1.

Giải pháp và Phạm vi

• Tiếp cận: Kết hợp công nghệ PCR giải trình tự gen 16S-rDNA chuẩn hóa quốc tế với kỹ thuật phân tích vi vệ tinh liên tiếp ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats). Chỉ thị ISSR sở hữu chiều dài mồi lớn (16 - 25 bp), nhiệt độ bắt cặp cao, mang lại độ lặp lại và tỷ lệ phát hiện băng đa hình vượt trội so với RAPD.
• Kỳ vọng: Xác định mức độ đa hình phân tử đạt trên 90%, xác lập khoảng biến thiên hệ số tương đồng di truyền di động từ 0.40 - 0.95, phân nhóm cấu trúc quần thể phục vụ trực tiếp cho công tác chọn giống kháng và kiểm dịch thực vật.
• Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát 32 chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc Biovar 3 phân lập từ các vùng canh tác cà chua và khoai tây trọng điểm tại tỉnh Lâm Đồng (Hiệp An, Ka Đôn, Ka Đô, Xuân Thọ).

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Phương pháp	Nguyên lý	Ưu điểm	Hạn chế	Mức độ phù hợp nghiên cứu
Hình thái & Sinh hóa	Quan sát khuẩn lạc trên KBA/TZC, khả năng oxy hóa mannitol, sorbitol, dulcitol, lactose, maltose, cellobiose.	Chi phí thấp, thiết bị đơn giản.	Tốn thời gian (3 - 5 ngày), độ phân giải thấp, không phát hiện biến dị vi mô.	Thấp (Chỉ dùng sàng lọc sơ bộ)
Chỉ thị RAPD	PCR ngẫu nhiên với primer 10-mer ngắn.	Không cần biết trước trình tự hệ gen, chi phí vừa phải.	Độ lặp lại (reproducibility) kém do mồi ngắn, nhạy cảm với điều kiện PCR.	Trung bình
Chỉ thị RFLP / AFLP	Cắt enzyme hạn chế và lai đoạn mẫu dò / PCR chọn lọc.	Độ tin cậy cao, bản chất đồng trội.	Quy trình kỹ thuật phức tạp, sử dụng hóa chất độc hại, chi phí đắt đỏ.	Thấp
16S-rDNA + ISSR (Đề xuất)	Giải trình tự gen ribosome 16S kết hợp PCR vùng vi vệ tinh lặp lại đơn giản (16-25 bp).	Định danh chính xác cấp loài, độ lặp lại cao (92 - 95%), tỷ lệ đa hình cao (>90%), chi phí tối ưu.	Đòi hỏi thiết bị điện di và đọc gel chính xác.	Rất cao (Lựa chọn tối ưu)

[Mô hình ưu tiên yêu cầu kỹ thuật - MoSCoW]

Thiết kế hệ thống thực nghiệm

Quy trình kỹ thuật được thiết kế theo cấu trúc module khép kín từ khâu sinh khối vi sinh đến phân tích tin sinh học:

Danh mục công nghệ, hóa chất và phần mềm sử dụng

• Hóa chất PCR: 2x MyTaq Mix (Bioline - Meridian Bioscience, UK), Thang chuẩn DNA HyperLadder™ 1kb (Bioline), Thuốc nhuộm GelRed 6X DNA Loading Buffer (Biotium, USA), Dung dịch đệm TAE 1X (40 mM Tris, 20 mM Acetic acid, 1 mM EDTA, pH 8.0), Agarose Molecular Grade (Bioline).
• Trang thiết bị: Máy luân nhiệt PCR Blue-Ray Biotech TurboCycler (Taiwan), Máy quang phổ NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA), Máy ly tâm lạnh HERMLE Z287A (Germany), Buồng điện di ngang Mupid-One, Hệ thống chụp ảnh gel UV Transilluminator.
• Bộ công cụ tin sinh học: BioEdit Sequence Alignment Editor v7.2, ClustalW Multiple Alignment Tool, NCBI BLASTn, MEGA 11 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 11), UVIDoc v99.02, NTSYSpc v2.1 (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System).

Cấu trúc phản ứng và chu trình nhiệt

Thành phần phản ứng PCR chuẩn (thể tích tổng $25,\mu\text{L}$):

• $2\times \text{MyTaq Mix}$: $12.5,\mu\text{L}$ (đối với 16S-rDNA) hoặc $10.0,\mu\text{L}$ (đối với ISSR)
• Mồi Forward / Reverse (hoặc mồi ISSR đơn $10,\mu\text{M}$): $2.0 - 3.0,\mu\text{L}$ ($0.2,\mu\text{M}$ nồng độ cuối)
• Khuôn mẫu DNA ($1,\text{ng}/\mu\text{L}$): $2.0,\mu\text{L}$
• Nước cất khử ion siêu sạch ($\text{ddH}_2\text{O}$): Bổ sung đủ $25.0,\mu\text{L}$

Chu trình nhiệt chuẩn hóa:

Phương pháp nghiên cứu và QA/QC

• Kiểm soát chất lượng (QA/QC): Tất cả các mẻ PCR đều bố trí mẫu đối chứng âm (Negative Control - không chứa khuôn DNA) để kiểm soát ngoại nhiễm. Nồng độ DNA đầu vào được chuẩn hóa ở mức tỷ lệ $A_{260}/A_{280} = 1.80 - 1.95$. Các phản ứng PCR-ISSR được thực hiện lặp lại tối thiểu 2 lần độc lập để xác nhận tính ổn định của các vạch băng.
• Tiêu chuẩn chấm điểm dữ liệu: Băng DNA rõ nét trên ảnh chụp huỳnh quang được chấm điểm 1 (hiện diện) và 0 (vắng mặt). Bỏ qua các vạch quá mờ để loại trừ sai số khuếch đại không đặc hiệu.

---

Implementation và kết quả

Quy trình tách chiết DNA và khuếch đại 16S-rDNA

Quy trình ly trích DNA tổng số áp dụng phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) cải tiến kết hợp biến tính protein bằng dung dịch Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) và tủa lạnh bằng Ethanol 96% ở nhiệt độ $-20^\circ\text{C}$.

# Mô phỏng thuật toán tính toán ma trận tương đồng Simple Matching (SM)
# Dùng trong phân tích đa dạng di truyền ISSR
import numpy as np

def calculate_sm_matrix(binary_matrix):
    """
    binary_matrix: numpy array shape (n_samples, n_loci)
    SM_ij = (a + d) / (a + b + c + d) = (n - b - c) / n
    với:
      a: số vị trí cả 2 mẫu đều có băng (1, 1)
      d: số vị trí cả 2 mẫu đều không có băng (0, 0)
      b: mẫu i có băng (1), mẫu j không có (0)
      c: mẫu i không có băng (0), mẫu j có (1)
      n: tổng số locus khảo sát
    """
    n_samples, n_loci = binary_matrix.shape
    sm_matrix = np.zeros((n_samples, n_samples))
    
    for i in range(n_samples):
        for j in range(n_samples):
            matches = np.sum(binary_matrix[i] == binary_matrix[j])
            sm_matrix[i, j] = matches / n_loci
            
    return sm_matrix

Phản ứng PCR 16S-rDNA với cặp mồi $27\text{F}$ (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và $1492\text{R}$ (5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3') trên 10 dòng đại diện (CHA1, CHA3, CXT1, CXT6, KQL4, KQL5, KKAD2, KKAD3, KKD3, KKD5) cho thấy một phân đoạn đơn dòng duy nhất có kích thước đồng nhất trong khoảng $1400 - 1500,\text{bp}$, vạch sắc nét, không xuất hiện hiện tượng kéo đuôi (primer dimer).

Thang DNA      0   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
(HyperLadder) (Ctl) CHA1 CHA3 CXT1 CXT6 KQL4 KQL5 KKAD2 KKAD3 KKD3 KKD5

Kết quả giải trình tự và phân tích phả hệ BLASTn

Kết quả giải trình tự Sanger 2 chiều đối chiếu trên ngân hàng gen NCBI ghi nhận 10 dòng vi khuẩn đều có mức độ tương đồng trình tự nucleotide từ 94.56% đến 98.64% với các chủng Ralstonia solanacearum chuẩn quốc tế:

Ký hiệu mẫu	Chủng tương đồng cao nhất (GenBank Accession)	Nguồn gốc ký chủ & Quốc gia	Độ tương đồng (%)
CXT6	Ralstonia solanacearum strain APK76 (MF973211.1)	Cây Lạc (Arachis hypogaea) - Ấn Độ	98.64%
CHA1	Ralstonia solanacearum strain APK76 (MF973211.1)	Cây Lạc (Arachis hypogaea) - Ấn Độ	98.20%
CHA3	Ralstonia solanacearum isolate Rs11 (HG425355.1)	Khoai tây (S. tuberosum) - Ai Cập	96.85%
KKAD2	Ralstonia solanacearum isolate Rs11 (HG425355.1)	Khoai tây (S. tuberosum) - Ai Cập	97.12%
KKAD3	Ralstonia solanacearum strain SL2064 (CP022798.1)	Khoai tây (S. tuberosum) - Hàn Quốc	96.40%
KKD3	Ralstonia solanacearum strain CMR15 (FP885896.1)	Cà chua (S. lycopersicum) - Cameroon	97.50%
KKD5	Ralstonia solanacearum isolate Rs11 (HG425355.1)	Khoai tây (S. tuberosum) - Ai Cập	96.15%
KQL4	Ralstonia solanacearum strain APK76 (MF973211.1)	Cây Lạc (Arachis hypogaea) - Ấn Độ	97.80%
KQL5	Ralstonia solanacearum strain APK76 (MF973211.1)	Cây Lạc (Arachis hypogaea) - Ấn Độ	95.30%
CXT1	Ralstonia solanacearum isolate Rs11 (HG425355.1)	Khoai tây (S. tuberosum) - Ai Cập	94.56%

Cây phát sinh loài MEGA 11: Căn chỉnh bằng thuật toán ClustalW và xây dựng theo mô hình Neighbor-Joining với 1000 lần lặp bootstrap. Chủng vi khuẩn ngoại nhóm Bacillus thuringiensis LBIT-107 (MN695920.1) tách biệt hoàn toàn ở nhánh ngoài. 10 dòng nghiên cứu gom cụm chặt chẽ cùng các chủng R. solanacearum với chỉ số tin cậy bootstrap dao động từ 61% đến 100%, khẳng định 100% các mẫu phân lập đều là Ralstonia solanacearum.

Kết quả phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị ISSR

Khảo sát 8 chỉ thị ISSR vi vệ tinh trên toàn bộ 32 dòng vi khuẩn thu thập tại 4 tiểu vùng nông nghiệp tỉnh Lâm Đồng cho kết quả khuếch đại cực kỳ rõ nét:

Tên Primer	Trình tự mồi ($5' \rightarrow 3'$)	$T_m$ bắt cặp ($^\circ\text{C}$)	Tổng số băng	Số băng đa hình	Tỷ lệ đa hình (%)	Kích thước phân đoạn (bp)
AF80820	$(\text{AG})_8\text{T}$	50.0	12	11	91.7%	200 - 2500
AF80821	$(\text{AG})_8\text{C}$	52.5	12	12	100.0%	100 - 2000
AF80822	$(\text{GA})_8\text{T}$	50.0	13	13	100.0%	300 - 2500
AF80825	$(\text{GA})_8\text{YC}$	53.8	13	11	84.6%	100 - 2500
UBC808	$(\text{AG})_8\text{C}$	52.4	11	11	100.0%	200 - 2000
UBC810	$(\text{AG})_8\text{T}$	50.0	11	10	90.9%	200 - 2500
UBC834	$(\text{AG})_8\text{TT}$	51.5	11	10	90.9%	300 - 2000
UBC841	$(\text{GA})_8\text{Y}$	57.3	14	12	85.7%	200 - 1750
Tổng cộng	-	-	97	90	-	100 - 2500
Trung bình	-	-	12.12	11.25	92.97%	-

(Ghi chú: $Y = C, T$)

[Phân bố băng đa hình của 8 mồi ISSR]
Tổng số băng: 97 băng

           Hệ số tương đồng di truyền (Simple Matching)
0.40          0.50          0.60          0.70          0.80          0.90       1.00

Phân tích cấu trúc phân nhóm di truyền (NTSYSpc)

• Khoảng biến thiên tương đồng: Hệ số tương đồng di truyền Simple Matching ($S_{SM}$) giữa 32 chủng biến thiên trong biên độ rộng từ 0.43 đến 0.92, với giá trị trung bình là 0.63.
• Phân nhánh UPGMA: Ở mức tương đồng di truyền 0.63, 32 chủng vi khuẩn được chia thành 6 nhóm chính (Cluster I đến VI):
  • Nhóm I & Nhóm II: Tập trung các chủng phân lập tại Hiệp An (CHA) và vùng chuyên canh Xuân Thọ (CXT), thể hiện mối liên hệ phát sinh gần gũi giữa các nông trại trồng cà chua lân cận.
  • Nhóm IV, V, VI: Các dòng từ Ka Đôn (KKAD) và Ka Đô (KKD) hình thành các phân nhánh độc lập với độ tương đồng nội nhóm cao (0.78 - 0.92) nhưng khác biệt đáng kể so với nhóm Hiệp An. Điều này minh chứng cho tính biệt lập địa lý và sự chọn lọc áp lực ký chủ tại từng tiểu vùng sinh thái.

---

Đổi mới và đóng góp

Đổi mới công nghệ

• Ứng dụng thành công hệ thống mồi ISSR 3'-anchored: Việc bổ sung 1 - 2 nucleotide chọn lọc ($Y, C, T$) ở đầu $3'$ hoặc $5'$ của chuỗi lặp microsatellite đã loại bỏ triệt để hiện tượng trượt mồi (primer slippage), tăng cường độ bám đặc hiệu lên khuôn DNA vi khuẩn.
• Tỷ lệ phát hiện đa hình vượt bậc (92.97%): Đạt hiệu suất phát hiện biến dị cao hơn đáng kể so với các nghiên cứu trước đây dùng chỉ thị RAPD tại Việt Nam (Trương Thị Hồng Hải, 2015 chỉ đạt tỷ lệ đa hình ~75 - 80%) hay kỹ thuật phân loại sinh hóa Biovar vốn không có khả năng phân biệt biến dị trong cùng Biovar 3.

[So sánh tỷ lệ phát hiện băng đa hình giữa các phương pháp]
ISSR (Nghiên cứu này) : 92.97% [███████████████████▍]
RAPD (Trương T. H. Hải): 78.40% [███████████████▋   ]
Sinh hóa (Biovar)      :  0.00% [                    ] (100% mẫu đều là Biovar 3)

Đóng góp cho ngành Bảo vệ Thực vật

1. Dữ liệu phân tử bản địa: Cung cấp bộ hồ sơ vân tay DNA (DNA fingerprinting) chuẩn hóa của 32 chủng vi khuẩn R. solanacearum tại Lâm Đồng, bổ sung nguồn gen tham chiếu có giá trị lên ngân hàng gen quốc gia.
2. Cơ sở khoa học cho công tác chọn giống: Phát hiện sự đa dạng di truyền cao ($S_{SM} = 0.43 - 0.92$) giải thích nguyên nhân các giống cà chua kháng héo xanh của AVRDC (như Hawaii 7996) bị suy giảm tính kháng sau vài vụ canh tác. Để duy trì tính kháng bền vững, các nhà tạo giống bắt buộc phải thử nghiệm đa nhiễm với đại diện của cả 6 nhóm di truyền đã xác định.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Khả năng ứng dụng thực địa

                    [HỆ THỐNG ỨNG DỤNG THỰC TIỄN]
[Kiểm dịch thực vật]     [Chọn tạo giống kháng]      [Quản lý dịch hại IPM]
- Phát hiện sớm mầm bệnh - Định hướng dòng vi khuẩn   - Luân canh cắt nguồn bệnh
  trong đất & hạt giống    chuẩn để thử tính kháng     phù hợp với nhóm di truyền
- Thời gian: <24 giờ     - Đảm bảo tính kháng bền    - Giảm chi phí thuốc BVTV
- Độ chính xác: >98%       vững trước 6 nhóm chủng     từ 35 - 50%

• Quy trình giám sát dịch tễ học: Cho phép các trạm Bảo vệ Thực vật kiểm tra mẫu đất và cây giống nghi nhiễm trong vòng 24 giờ với độ nhạy cao, thay vì phải chờ 5 - 7 ngày nuôi cấy truyền thống.
• Quy hoạch vùng trồng: Dựa vào bản đồ phân bố 6 nhóm di truyền để xây dựng quy trình luân canh cây trồng khác họ (như lúa nước, ngô) nhằm cắt đứt cầu nối lây lan của các dòng vi khuẩn độc lực cao.
• Hiệu quả kinh tế: Giúp người nông dân giảm thiểu thiệt hại mùa vụ từ 40% xuống dưới 10%, tiết kiệm 35 - 50% chi phí phun xịt các loại thuốc gốc đồng hoặc kháng sinh vô hiệu, nâng cao năng suất thực thu từ 15 - 25 tấn/ha đối với khoai tây và cà chua thương phẩm.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế tồn tại

• Kỹ thuật 16S-rDNA có tính bảo thủ cao, chỉ định danh chắc chắn đến cấp loài (species), chưa thể phân loại chi tiết đến cấp độ nòi sinh lý (Phylotype hoặc Sequevar).
• Quy mô mẫu dừng lại ở 32 dòng phân lập tại Lâm Đồng, chưa đại diện cho toàn bộ các vùng sinh thái nông nghiệp khác của Việt Nam (như Đồng bằng sông Cửu Long, Duyên hải Nam Trung Bộ).

Hướng nghiên cứu tiếp theo

1. Khai thác các vùng gen phân loại đa locus (MLSA) gồm egl (endoglucanase), hrpB (type III secretion regulator), và mutS (DNA mismatch repair gene) để xác định chính xác Phylotype và Sequevar theo chuẩn phân loại quốc tế của Fegan & Prior.
2. Mở rộng giải trình tự toàn bộ bộ gen (Whole Genome Sequencing) trên các chủng đột biến đại diện để giải mã cơ chế kháng thuốc và tương tác phân tử giữa hệ thống tiết Type III với hệ miễn dịch cây họ cà.

---

Đối tượng hưởng lợi

[BẢNG PHÂN TÍCH ĐỐI TƯỢNG HƯỞNG LỢI VÀ GIÁ TRỊ ĐEM LẠI]

---

Câu hỏi thường gặp

1. Điều kiện tối thiểu về trang thiết bị phòng lab để triển khai quy trình định danh này là gì?

Phòng thí nghiệm cần trang bị: Máy luân nhiệt PCR thông thường (Block 96 giếng), bộ nguồn và buồng điện di gel agarose, bàn soi gel tia UV hoặc hệ thống chụp gel GelDoc, máy đo quang phổ vi thể (NanoDrop hoặc tương đương), máy ly tâm tốc độ cao ($14,000,\text{rpm}$) và tủ bảo quản mẫu $-20^\circ\text{C}$.

2. Tại sao chỉ thị ISSR lại được ưu tiên hơn chỉ thị RAPD trong đánh giá đa dạng vi khuẩn?

Chỉ thị ISSR sử dụng các đoạn mồi có chiều dài từ 16 đến 25 nucleotide (thay vì 10 nucleotide như RAPD), cho phép thiết lập nhiệt độ bắt cặp cao hơn ($50^\circ\text{C} - 57.3^\circ\text{C}$ so với $34^\circ\text{C} - 37^\circ\text{C}$ của RAPD). Nhờ đó, phản ứng PCR-ISSR có tính đặc hiệu cao, loại bỏ hoàn toàn các vạch giả không đặc hiệu và đạt độ lặp lại lên tới 92 - 95%.

3. Phương pháp này có thể phát hiện vi khuẩn R. solanacearum trực tiếp từ đất hoặc hạt giống không?

Có thể triển khai. Tuy nhiên, đối với mẫu đất chứa nhiều chất ức chế PCR (axit humic, ion kim loại), quy trình ly trích DNA cần bổ sung bước tinh chế qua cột silica chuyên dụng hoặc xử lý với PVPP (Polyvinylpolypyrrolidone) trước khi tiến hành phản ứng PCR khuếch đại gen 16S-rDNA.

4. Hệ số tương đồng di truyền trung bình 0.63 có ý nghĩa như thế nào trong quản lý bệnh thực tế?

Hệ số tương đồng $0.63$ (biến thiên từ $0.43$ đến $0.92$) phản ánh mức độ phân hóa di truyền cực kỳ sâu sắc giữa các dòng vi khuẩn ngay trong cùng một tỉnh. Điều này chứng minh rằng quần thể vi khuẩn ngoài đồng ruộng không đồng nhất mà bao gồm nhiều biến chủng khác nhau, đòi hỏi chiến lược phòng trừ phải kết hợp đa dạng biện pháp canh tác và luân phiên các giống kháng khác nhau.

5. Chi phí ước tính cho một xét nghiệm định danh 16S-rDNA và vân tay ISSR là bao nhiêu?

Chi phí hóa chất tiêu hao trực tiếp cho 1 mẫu kiểm tra dao động từ 80.000 - 150.000 VNĐ (đối với phân tích PCR-ISSR nội bộ) và khoảng 200.000 - 300.000 VNĐ (nếu bao gồm cả chi phí giải trình tự Sanger 16S-rDNA thương mại), rẻ hơn từ 5 - 10 lần so với phương pháp giải trình tự thế hệ mới (NGS).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Xuân Mai đã giải quyết trọn vẹn và chuẩn xác bài toán định danh và đánh giá biến dị di truyền của phức hợp loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum hại cây họ cà tại tỉnh Lâm Đồng. Nghiên cứu đã chứng minh năng lực vượt trội của công nghệ sinh học phân tử hiện đại:

• Định danh thành công 100% các mẫu phân lập thuộc loài Ralstonia solanacearum qua giải trình tự vùng gen 16S-rDNA với độ tương đồng từ 94.56% đến 98.64%.
• Khai thác hiệu quả 8 chỉ thị ISSR vi vệ tinh, thu nhận 97 băng khuếch đại với tỷ lệ đa hình đạt kỷ lục 92.97%, xác lập hệ số tương đồng di truyền trung bình 0.63 và phân lập thành công 6 nhóm cấu trúc di truyền.

Kết quả nghiên cứu không chỉ mang hàm lượng học thuật cao mà còn đóng vai trò là kim chỉ nam kỹ thuật thực tiễn, cung cấp nền tảng khoa học vững chắc cho các chương trình lai tạo giống kháng bệnh héo xanh vi khuẩn và xây dựng quy trình quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) bền vững cho ngành rau quả Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tổng quan về cây họ cà Cây ho ca có tên danh pháp khoa học là Solanaceae, là một loại thực vật có hoa. Tên khoa học của họ này có nguồn gốc từ tiếng Latinh Solanum, nghĩa là “cây cà được”. Ở Việt Nam, họ cà gồm các cây thân thảo hoặc cây nhỏ, phân bố rộng khắp cả nước. Một số loài được trồng dùng làm thực phẩm (cà tím, cà pháo, cà chua, khoai tây), gia vi (ớt), cây công nghiệp (thuốc lá) hoặc cây dược liệu.1 Cây cà chua Cây cà chua có tên khoa học là Solanum lycopersicum L., thuộc họ ca (Solanaceae) là một loại rau ăn quả có nguồn gốc từ Nam Mỹ.

Theo Somraj và ctv (2017) cùng với Nalla va ctv (2016) thì cà chua là một loại cây rau quan trọng, phố biến và được trồng rộng rãi khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới. Theo tô chức nông lương thé giới (FAO, 2022), diện tích trồng cà chua trên thế giới vào khoảng 4.735 ha với sản lượng 186. Là cây rau có giá tri, có sản lượng chiếm 1/6 tong sản lượng rau hang năm trên thế giới và luôn đứng ở vị trí số 1 về sản lượng. Cà chua có tầm quan trọng chỉ sau khoai tây ở nhiều quốc gia và đứng thứ nhất về rau được bảo quản, chế bién và cả mục dich sử dụng tươi.2 Cây khoai tây Khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum L., thuộc ho cà (Solanacea) có nguồn gốc xuất xứ ở day Andes.

Khoai tây được trồng lâu đời ở Nam Mỹ và được đưa vào châu Âu từ thé ki 16. Sau đó, khoai tây được trồng ở nhiều nơi và dan trở thành cây lương thực chủ đạo. Ở nước ta, khoai tây được du nhập vào từ người Pháp từ dau thé ki 19. Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO, 2022), diện tích trồng khoai tây trên thế giới vào khoảng 17.408 ha với sản lượng 374.3 Cây ớt Cây ớt (Capsicum annuum L.) có nguồn gốc nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Mỹ.

Cây ớt có mặt ở nước ta được du nhập từ Trung Quốc, An Độ. Diện tích phân bố khá rộng rãi, tập trung ở miền Bắc và miền Trung, ở miền Nam diện tích trồng ớt còn phân tán. Theo tô chức nông lương thế giới (FAO, 2022) cây ớt được xem là một trong những cây trồng quan trọng của vùng nhiệt đới. Diện tích trồng ớt thế giới vào khoảng 2.816 ha cho mục đích lấy quả tươi với sản lượng 36.2 Vi khuẩn Ralstonia solanacearum 1.1 Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum Vi khuẩn Ralstonia solanacearum gay hai hon 200 loai thuc vat.

Day 1a loai vi khuẩn gây bệnh mach dan được nghiên cứu bởi Halted vào năm 1892. Đến năm 1896, tiếp tục được Erwin Frink Smith nghiên cứu, mô ta và định tên Ralstonia solanacearum. Thời gian sau đó, nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu vào nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra một cách toàn diện hon, phải kế đến như là Kelman (1954), Hayward (1964), Yabuuchi (1992) (Vũ Triệu Man và Lê Lương Té, 1998). Theo Caldwell và ctv (2017), Ralstonia solanacearum là tác nhân gây bệnh héo xanh đo vi khuẩn và lây nhiễm trên 200 loài thực vật thuộc 50 họ.

Vi khuẩn trong đất có thê gây chêt đôi với nhiêu loài sông đơn độc, bao gôm cả ca chua. Bệnh phát sinh từ cây non đến khi thu hoạch. Triệu chứng thường biểu hiện ngay sau khi vi khuân xâm nhập vào cây. Ở cây bị bệnh, ban ngày lá mat màu nhẫn bóng, tái xanh, héo cụp xuống.

Ở giai đoạn cây con thường biểu hiện trên toàn cây, còn ở giai đoạn trưởng thành triệu chứng thường biểu hiện ở lá ngọn trước. Ở 1 - 2 ngày đầu cây có thể phục hồi lại được vào lúc trời mát hoặc về đêm, nhưng sau 2 - 3 ngày lá héo không thể hồi phục lại được nữa và toàn cây bị héo rũ rồi chết. Vỏ thân gần gốc của cây bị bệnh san sùi, khi cắt ngang thấy bó mạch bị hóa nâu. Trong điều kiện 4m độ cao, thân cây bị bệnh dan dần thối mềm, ấn mạnh gần miệng cắt có thé thay dịch nhay vi khuẩn tiết ra màu trắng sữa.

Rễ có màu nâu đen và thối.2 Đặc diém cau tạo và điêu kiện phát triên của vi khuân Ralstonia solanacearum Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là vi khuẩn hình que, hai đầu hơi tròn, có lông roi ở một đầu, kích thước tế bào 0,5 - 1,5 um, nhuộm gram âm. Vi khuẩn tồn tại trong đất, nước, tàn dư thực vật, ký chủ phụ, hạt giống (đậu phộng). Vi khuẩn thích hợp ở nhiệt độ 25 — 35°C, nhiệt độ tôi đa là 41°C, nhiệt độ tối thấp 10°C, nhiệt độ gây chết là 55°C. Vi khuẩn phát triển trên phạm vi rộng pH = 6,8 - 7,2.

Thời gian vi khuẩn tồn lưu trong đất phụ thuộc vào nhiều yếu tố như âm độ, nhiệt độ, hóa lý dat. Vi khuẩn có thé tồn lưu trong đất từ 5 - 6 năm, trong cơ thé ký chủ thực vật hoặc trong hạt giống có thê song toi 7 thang, con nếu bám dính trên bề mặt hat chi tồn tại 2 - 7 ngày (Vũ Triệu Man và Lê Lương Té, 1998). Vi khuẩn lan truyền chủ yếu bằng nguồn nước, đất như bám dính vào giày dép, dụng cụ canh tác (Martin và French, 1985). Bệnh héo xanh vi khuân phát sinh phát triển phụ thuộc vào điều kiện đất đai như trên các chân đất cao bệnh thường nặng hơn các chân đất thấp, dat được luân canh với lúa nước làm giảm tỷ lệ bệnh đáng ké (Đỗ Tan Dũng, 2001).

Thời vụ trồng cũng là yếu tô quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển bệnh, thời vụ trồng có mưa nhiều, âm độ cao làm gia tăng sự phát sinh phát triển bệnh. Mật độ trồng cao tỷ lệ bệnh thường cao do chúng tạo một vùng khí hậu thuận lợi cho sự phát sinh phát triển bệnh.3 Hình thức xâm nhập vào cây ký chủ Vi khuẩn R. solanacearum lan truyền theo nước tưới, xâm nhập vào cây qua vết thương hoặc qua lỗ thở tự nhiên, vết nứt đầu rễ và di chuyên vào trong bó mạch, sau đó phá bó mạch làm tắc nghẽn sự vận chuyền nước và chất dinh dưỡng gây ra bệnh héo xanh trên các cây họ cà, mạnh nhất khi cây đang trong giai đoạn phát triển.4 Biện pháp phòng trừ Đây là loại bệnh rất khó phòng trị, sử dụng thuốc hoá học không có hiệu quả cao, do vậy áp dụng các biện pháp phòng tri tong hợp có hiệu qua cao hơn. Biện pháp canh tác: Luân canh cây trông; đây là biện pháp có hiệu quả cao, có thê luân canh với cây khác họ cà hoặc luân canh với lúa nước.

Không nên trông cà chua 2 vụ liên tiếp trên một chân đất. Xử lý hạt giống trong nước nóng 50°C trong 25 phút. Sử dụng cây giống ở vườn ươm không bị bệnh. Vệ sinh đồng ruộng dọn sạch cỏ dai.

Sử dụng phân hữu cơ hoai mục dé bón. Sử dụng biện pháp ghép dé tăng tính chống chịu cũng là một trong những biện pháp hiệu quả. Theo French va ctv (2018), tác nhân gây bệnh trong dat Ralstonia solanacearum là tac nhân gây bệnh héo xanh vi khuẩn va gây mat mùa đáng kể trong ho Solanaceae. Đầu tiên mầm bệnh lây nhiễm vào rễ, đây là nguồn kháng bệnh quan trọng ở ca chua 6 (Solanum lycopersicum L.

Rễ của cả cây kháng bệnh và cây man cảm đều bị mam bệnh xâm chiếm, tuy nhiên gốc ghép có thé cung cấp mức độ kháng bệnh đáng kẻ. Hiện tại, các cơ chế của “sự đề kháng qua trung gian gốc rễ” này phần lớn vẫn chưa được biết. Đề xác định cơ sở phân tử của tính kháng này, đã tiến hành phân tích phản ứng phiên mã trên toàn bộ bộ gen của rễ cây cà chua “Hawaii 7996” và cà chua “West Virginia 700” (WV) nhạy cảm ở nhiều thời điểm sau khi được cấy vi khuẩn R. Nhận thay rằng các con đường phòng thủ trong rễ của Hawaii 7996 kháng thuốc được kích hoạt sớm hơn và mạnh hơn so với rễ của WV nhạy cảm.

Hơn nữa, các con đường truyền tín hiệu và vận chuyên auxin bị ngăn chặn trong rễ của giống kháng. Phân tích chức năng của một đột biến vận chuyên auxin trong cà chua cho thấy vai trò của con đường auxin trong bệnh héo ở vi khuẩn. Kết quả của nghiên cứu cho thấy rằng rễ làm trung gian đề kháng với R. solanacearum thông qua các thay đôi phiên mã trên toàn bộ bộ gen dẫn đến kích hoạt mạnh các gen bảo vệ và thay đổi con đường auxin.

Theo nghiên cứu của Huỳnh Thị Tố Chi va ctv (2018), về “Ảnh hưởng của gốc ghép và biện pháp phủ liếp đến bệnh héo xanh vi khuẩn (Ralstonia solanacearum) và năng suất của ớt hiểm lai, tại Cù Lao Tây, huyện Thanh Bình, tỉnh Đồng Tháp”, kết quả 6 thu được về gốc ghép, ở Tân Hòa, cây ớt ghép trên gốc TN557 có tỉ lệ bệnh (18,8%) thấp hơn đối chứng không ghép (36,3%) ở giai đoạn kết thúc thu hoạch, năng suất trái 10,3 tan/ha, cao hơn 25,0% so với đối chứng không ghép và 32,1% so với đối chứng ghép lên chính nó. Ở Tân Hué, gốc TN557 cũng có tỉ lệ bệnh héo xanh (20,0%) thấp hơn đối chứng không ghép (38,8%) ở giai đoạn kết thúc thu hoạch, năng suất trái 5,44 tan/ha, cao hơn 18,0% so với đối chứng không ghép và 23,4% so với đối chứng ghép lên chính nó. Vật liệu phủ liếp không ảnh hưởng đến bệnh héo xanh vi khuẩn, năng suất ớt trồng có sử dụng màng phủ là 9,63 tắn/ha, tương đương 33,0% cao hơn phủ rơm ở xã Tân Hòa và 5,17 tan/ha, tương đương 30,5% cao hơn phủ rơm ở xã Tân Hué. Võ Thị Bích Thủy và ctv (2016), đã thực hiện nghiên cứu “Đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum và bước đầu khảo sát ảnh hưởng của các gốc ghép ớt đến khả năng chống chịu bệnh héo vi khuẩn trên ớt sừng 7 trong điều kiện nhà lưới”.

Kết quả phân lập được 6 chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân bố tại các tỉnh An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp và Kiên Giang. So sánh kha năng gây hại của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trong điều kiện nhà lưới bằng phương pháp tưới huyền phù vi khuẩn (4x10!° CFU/mL) vào đất giai đoạn cây có 4 - 5 lá thật (22 ngày sau khi gieo), 5 mL/cây. Kết quả cho thấy, 6 chủng vi khuẩn được sử dụng đều có khả năng gây bệnh héo xanh do vi khuẩn bat đầu từ 12 ngày sau khi lây bệnh nhân tạo.