Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong ngành chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản, bột cá (Fish meal - FM) là nguồn cung cấp protein và chất béo động vật truyền thống nhờ hàm lượng dinh dưỡng cao, cân đối axit amin, giàu axit béo không bão hòa đa chuỗi dài omega-3 (n-3 LC-PUFA) và có khả năng tiêu hóa tốt. Tuy nhiên, theo dự báo của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO, 2020), đến năm 2030 chi phí bột cá sẽ tăng khoảng 30% so với năm 2018 do nhu cầu toàn cầu tăng, trong khi sản lượng nuôi trồng thủy sản dự kiến tăng 42%. Sự gia tăng chi phí này tạo ra áp lực kinh tế lớn cho ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi.

Trước bối cảnh đó, protein từ côn trùng nổi lên như một nguồn nguyên liệu thay thế bền vững. Trong đó, ruồi lính đen (Black soldier fly - BSF, tên khoa học: Hermetia illucens) được đánh giá cao nhờ khả năng chuyển hóa phụ phẩm, chất thải hữu cơ thành sinh khối giàu đạm và dầu. Bột ấu trùng ruồi lính đen (BSFLM) chứa khoảng 42–60% protein thô và 10–35% lipid thô tính theo chất khô, có phổ axit amin thiết yếu tương đồng với bột cá. Việc ứng dụng công nghệ enzyme để thủy phân protein ấu trùng ruồi lính đen thành các chuỗi peptide ngắn và axit amin tự do giúp nâng cao khả năng hòa tan, cải thiện hệ số tiêu hóa và tăng tính dẫn dụ cho thức ăn thủy sản.

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Võ Tường Duy (ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Phúc Cẩm Tú) tập trung giải quyết bài toán tối ưu hóa quá trình sinh học này với các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

  • Mục tiêu đề tài: Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân và bảo quản dung dịch giàu dinh dưỡng từ ấu trùng ruồi lính đen (Hermetia illucens) bằng enzyme thương phẩm Alcalase.
  • Nhiệm vụ nghiên cứu:
    1. Nội dung 1: Nghiên cứu khảo sát và tối ưu hóa các điều kiện tạo dung dịch giàu dinh dưỡng từ ấu trùng ruồi lính đen bằng enzyme Alcalase.
    2. Nội dung 2: Nghiên cứu các điều kiện bảo quản phù hợp trong quá trình bảo quản dung dịch sau thủy phân.
  • Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
    • Đối tượng: Ấu trùng ruồi lính đen (Hermetia illucens) được thu nhận tại nhà nuôi ruồi thuộc Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường; enzyme Alcalase do hãng Novozymes (Đan Mạch) sản xuất.
    • Thời gian thực hiện: Từ tháng 3/2022 đến tháng 12/2022.
    • Địa điểm: Phòng thí nghiệm RIBE 106, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và căn cứ pháp lý

  • Đặc điểm sinh học và dinh dưỡng của ấu trùng ruồi lính đen: Vòng đời 40–45 ngày qua 4 giai đoạn (trứng, ấu trùng, nhộng, ruồi trưởng thành). Ấu trùng 14–15 ngày tuổi (tiền nhộng) có giá trị dinh dưỡng cao nhất, hàm lượng protein thô đạt từ 38% đến 63% và chất béo thô từ 7% đến 42% tùy thuộc vào cơ chất nuôi dưỡng.
  • Cơ chế thủy phân bằng enzyme protease: Sử dụng enzyme Alcalase – một endopeptidase thuộc nhóm serine protease (subtilisin) có nguồn gốc vi sinh vật, hoạt động tối ưu ở vùng kiềm nhẹ và nhiệt độ 50–70°C, có khả năng cắt đứt các liên kết peptide nội mạch tạo ra các peptide ngắn và axit amin hòa tan.
  • Cơ sở bảo quản dịch đạm thủy phân: Kiểm soát sự hư hỏng do vi sinh vật và enzyme tự do bằng cách kết hợp hạ pH bằng axit hữu cơ (Axit citric - $\text{C}_6\text{H}_8\text{O}_7$), trữ lạnh ($4^\circ\text{C}$) và bổ sung chất bảo quản hóa học Potassium sorbate ($\text{C}_6\text{H}_7\text{KO}_2$).
  • Căn cứ tiêu chuẩn và pháp lý: Căn cứ theo quy định tại Khoản 5 Mục II Phụ lục II Thông tư số 26/2018/TT-BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn về quản lý danh mục axit amin thiết yếu trong thức ăn thủy sản.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

[Ấu trùng ruồi lính đen sấy khô]
   [Nghiền mịn thành bột]
[Loại béo bằng N-hexane (tỷ lệ 1:5 w/v)]
   [Sấy khô thu Bột protein]
[Hydrat hóa với nước cất (2 giờ, tỷ lệ khảo sát)]
  [Chỉnh pH = 8 bằng NaOH 1N, gia nhiệt 60°C]
[Thủy phân bằng Alcalase (bổ sung 2 giai đoạn)]
   [Bất hoạt enzyme (90°C trong 10 phút)]
        [Dịch thủy phân]
[Đánh giá dinh dưỡng & Thử nghiệm bảo quản]
  1. Chuẩn bị nguyên liệu và tiền xử lý: Ấu trùng sấy khô được nghiền thành bột, loại béo bằng dung môi N-hexane theo tỷ lệ 1:5 (w/v) ngâm qua đêm ở nhiệt độ phòng. Dung môi được thu hồi bằng bơm hút chân không, phần bột sau loại béo đem sấy khô để làm cơ chất protein.
  2. Khảo sát đơn yếu tố (OFAT): Đánh giá ảnh hưởng của từng thông số độc lập đến hiệu suất thủy phân (HSTP), bao gồm:
    • Tỷ lệ cơ chất/nước: 1:5; 1:10; 1:15; 1:20 (w/v).
    • Tỷ lệ enzyme/cơ chất: 1%; 2%; 3%; 4% (w/w).
    • Nhiệt độ thủy phân: 50°C; 55°C; 60°C; 65°C.
    • pH ban đầu: 7,0; 7,5; 8,0; 8,5.
    • Thời gian thủy phân: 2; 4; 6; 8 giờ.
    • Kỹ thuật bổ sung enzyme: Chia làm 2 đợt (50% nồng độ bổ sung ban đầu, 50% còn lại bổ sung khi đạt 1/2 tổng thời gian thủy phân). Bất hoạt enzyme ở 90°C trong 10 phút.
  3. Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa (RSM): Sử dụng mô hình Box-Behnken trên phần mềm Design Expert 13 gồm 5 yếu tố biến thiên ($k=5$), 46 nghiệm thức thực nghiệm với 6 điểm lặp ở tâm ($n_0=6$), công thức tổng số thí nghiệm $N = 2k(k-1) + n_0$.
  4. Khảo sát điều kiện bảo quản: Dịch thủy phân sau tối ưu được điều chỉnh về pH 5,0 bằng axit citric, chia thành 7 nghiệm thức bảo quản theo dõi trong các mốc thời gian 7, 14, 21, 28, 35 ngày:
    • NT1: Nhiệt độ phòng (đối chứng không chất bảo quản).
    • NT2: Nhiệt độ lạnh ($4^\circ\text{C}$, không chất bảo quản).
    • NT3 – NT7: Nhiệt độ phòng, bổ sung Potassium sorbate với nồng độ lần lượt là 0,02%; 0,04%; 0,06%; 0,08%; 0,10%.
  5. Phương pháp phân tích hóa lý và xử lý số liệu:
    • Đạm tổng số: Phương pháp Kjeldahl.
    • Đạm formol: Phương pháp xác định hàm lượng nitơ amin – amoniac theo TCVN 3707:90.
    • Đạm amoniac: Phương pháp xác định hàm lượng nitơ amoniac theo TCVN 3706:90.
    • Đạm axit amin: Tính bằng hiệu số giữa đạm formol và đạm amoniac.
    • Thành phần 17 axit amin: Định lượng bằng sắc ký.
    • Thống kê: Xử lý phương sai (ANOVA 1 yếu tố) bằng phần mềm Minitab 16 và phân tích hồi quy bề mặt đáp ứng bằng Design Expert 13, tính toán độ tin cậy ở mức 95% ($p < 0,05$).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Đặt vấn đề

Tác giả nêu rõ tính cấp thiết của việc tìm kiếm nguồn đạm sinh học thay thế bột cá trong nuôi trồng thủy sản. Khẳng định tiềm năng sinh khối của ấu trùng ruồi lính đen và sự cần thiết của phương pháp thủy phân sinh học bằng enzyme Alcalase nhằm gia tăng giá trị sử dụng của nguồn nguyên liệu này. Xác lập 2 mục tiêu và phạm vi nghiên cứu cụ thể.

Chương 2. Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa các cơ sở lý luận và tổng quan nghiên cứu liên quan:

  • Sinh học và vòng đời của ruồi lính đen (Hermetia illucens), biến thiên thành phần dinh dưỡng theo cơ chất nuôi.
  • Cơ chế cắt liên kết peptide của nhóm enzyme protease, đặc điểm dòng serine protease (Alcalase).
  • Nguyên lý các phương pháp bảo quản dịch đạm (nhiệt độ cao, nhiệt độ thấp, chiếu xạ, hóa chất bảo quản như Natri benzoat, Potassium sorbate).
  • Tổng quan các công trình nghiên cứu thủy phân ruồi lính đen trong nước và quốc tế (các nghiên cứu của Batish và cộng sự năm 2020; Mochamad Firmansyah và cộng sự năm 2019).

Chương 3. Phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết địa điểm, thời gian, nguồn gốc nguyên liệu ấu trùng và hóa chất enzyme. Mô tả toàn bộ quy trình công nghệ khử béo, sơ đồ các bước thủy phân 2 giai đoạn, bố trí thí nghiệm đơn yếu tố, ma trận quy hoạch thực nghiệm Box-Behnken 5 yếu tố, bố trí 7 nghiệm thức bảo quản và quy trình phân tích các chỉ tiêu hóa nghiệm theo tiêu chuẩn TCVN.

Chương 4. Kết quả và thảo luận

Tập trung phân tích các dữ liệu thực nghiệm:

  • Đánh giá thành phần bột nguyên liệu sau khử béo.
  • Ảnh hưởng của từng yếu tố đơn lẻ đến hiệu suất thủy phân.
  • Kết quả mô hình hóa bề mặt đáp ứng RSM, phân tích phương sai ANOVA, thiết lập phương trình hồi quy bậc hai và kiểm định thực nghiệm tại điểm tối ưu.
  • Đánh giá thành phần 17 axit amin trong dịch thủy phân tối ưu.
  • Động thái biến đổi các chỉ tiêu đạm tổng, đạm formol, đạm amoniac của dịch thủy phân trong 35 ngày bảo quản.

Chương 5. Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các thông số công nghệ tối ưu đạt được cho quá trình thủy phân và điều kiện bảo quản; đưa ra các đề xuất nhằm hoàn thiện quy trình ở quy mô lớn hơn.

Kết quả và đóng góp

1. Thành phần nguyên liệu bột ấu trùng sau loại béo

Quá trình xử lý bằng N-hexane giúp thu hồi triệt để chất béo, tạo nguồn cơ chất protein đồng nhất:

Chỉ tiêu Hàm lượng
Nitơ tổng số 72,1 g/L
Protein thô 45,0%
Nitơ Formol 10,0 g/L
Nitơ Amoniac 3,6 g/L
Độ ẩm 4,1%

2. Kết quả khảo sát đơn yếu tố

Khảo sát đơn biến xác định được khoảng giá trị tối ưu của các thông số công nghệ:

  • Tỷ lệ cơ chất/nước: Tăng từ 1:5 lên 1:10 giúp HSTP tăng từ 13,33% lên 17,76%. Tiếp tục tăng lên 1:15 và 1:20 không làm tăng HSTP đáng kể (đạt 17,95% và 17,40%). Chọn tỷ lệ 1:10 cho các bước tiếp theo.
  • Tỷ lệ enzyme/cơ chất: Tỷ lệ 1% cho HSTP 16,96%; 2% cho HSTP 17,73%; 3% cho HSTP 18,55%; 4% giảm xuống 16,14%. Tỷ lệ 2% được chọn để tối ưu chi phí sản xuất.
  • Nhiệt độ: HSTP tăng dần từ 50°C (14,28%) đến 60°C (17,70%), nhưng giảm mạnh ở 65°C (13,61%) do enzyme bị biến tính nhiệt. Chọn 60°C.
  • pH môi trường: HSTP đạt cao nhất ở pH 8,0 (18,28%), thấp hơn ở pH 7,0 (16,60%), pH 7,5 (17,01%) và giảm mạnh ở pH 8,5 (14,90%). Chọn pH 8,0.
  • Thời gian: HSTP đạt cực đại tại 4 giờ (18,36%), duy trì ở 6 giờ (17,75%) và giảm khi kéo dài đến 8 giờ (15,99%) do tích lũy amoniac. Chọn 4 giờ.

3. Tối ưu hóa đa yếu tố theo mô hình Box-Behnken

Phân tích hồi quy bề mặt đáp ứng thiết lập được phương trình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa HSTP ($Y$) và 5 biến độc lập ($X_1$: Cơ chất/nước, $X_2$: Enzyme, $X_3$: Nhiệt độ, $X_4$: pH, $X_5$: Thời gian):

$$\begin{aligned} Y = &\ 17,36 + 2,73X_1 + 0,08X_2 + 1,22X_3 - 0,1410X_4 - 0,2118X_5 \ &+ 0,5955X_1X_2 - 0,6998X_1X_3 - 2,44X_1X_4 - 0,2784X_1X_5 \ &- 0,5407X_2X_3 - 0,934X_2X_4 - 0,8247X_2X_5 + 1,02X_3X_4 \ &- 0,2132X_3X_5 - 0,3921X_4X_5 - 1,79X_1^2 - 1,29X_2^2 \ &- 2,33X_3^2 - 0,7629X_4^2 - 1,56X_5^2 \end{aligned}$$

Mô hình đạt độ tương thích cao với $R^2 = 88%$, Adjusted $R^2 = 79,97%$, Predicted $R^2 = 55,87%$, chỉ số Adeq Precision = 15,23 (lớn hơn 4), kiểm định mô hình có ý nghĩa thống kê cao ($F = 9,98; p < 0,0001$).

Thông số Giá trị lý thuyết mô hình Giá trị thực nghiệm kiểm định
Tỷ lệ cơ chất / nước (w/v) 1:15 1:15
Tỷ lệ enzyme Alcalase (%) 2,769% 2,8%
Nhiệt độ (°C) 58,955°C 59°C
pH ban đầu 7,5 7,5
Thời gian thủy phân (giờ) 3,501 giờ 3,5 giờ
Hiệu suất thủy phân (%) 20,818% 18,79 ± 1,14%

4. Giá trị dinh dưỡng và hàm lượng axit amin của dịch thủy phân

Dịch thủy phân thu được ở điều kiện tối ưu có màu nâu đỏ đặc trưng, mùi thơm đạm, các chỉ tiêu hóa lý:

  • Nitơ tổng số: 2,82 g/L (tương đương hàm lượng protein 17,63 g/L).
  • Nitơ formol: 0,98 g/L; Nitơ amoniac: 0,40 g/L; Nitơ axit amin: 0,58 g/L.

Định lượng thành phần 17 axit amin trong dịch thủy phân:

STT Axit amin Hàm lượng (mg/L) STT Axit amin Hàm lượng (mg/L)
1 Aspartic acid 1223 10 Methionine 368
2 Threonine 505 11 Isoleucine 418
3 Serine 487 12 Leucine 773
4 Glutamic acid 1745 13 Tyrosine 677
5 Proline 610 14 Phenylalanine 497
6 Glycine 670 15 Histidine 1446
7 Alanine 761 16 Lysine 626
8 Cystine 55 17 Arginine 339
9 Valine 626 Tổng số 11.826

Thành phần dịch thủy phân đáp ứng đầy đủ các axit amin thiết yếu theo quy định tại Thông tư 26/2018/TT-BNNPTNT về thức ăn thủy sản, nổi bật là Glutamic acid (1745 mg/L, chiếm 14,7%), Histidine (1446 mg/L) và Aspartic acid (1223 mg/L).

5. Kết quả bảo quản dịch thủy phân

Khi hạ pH dịch đạm xuống 5,0 bằng axit citric:

  • Sản phẩm duy trì ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian 35 ngày (1 tháng).
  • Hàm lượng Nitơ tổng số dao động nhẹ qua các mốc thời gian (2,52–2,73 g/L).
  • Hàm lượng Nitơ formol duy trì ổn định từ ngày 7 đến ngày 21 (0,92–1,01 g/L) và có xu hướng tăng nhẹ vào ngày 35 (1,05–1,21 g/L).
  • Hàm lượng Nitơ amoniac không có sự gia tăng đột biến giữa các nghiệm thức có và không có Potassium sorbate trong 35 ngày đầu.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:
    • Trong giai đoạn bảo quản 35 ngày ở pH 5,0, lượng nitơ amoniac phát sinh trong mẫu đối chứng và các mẫu có chất bảo quản đều ở mức thấp và chưa có sự phân hóa rõ rệt, do đó chưa đánh giá hết được sự khác biệt về hiệu quả kéo dài hạn dùng giữa Potassium sorbate và phương pháp kiểm soát pH đơn thuần.
    • Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (thể tích bình phản ứng nhỏ).
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Kéo dài thời gian theo dõi bảo quản (trên 2–3 tháng) hoặc thử nghiệm trong điều kiện gia tốc nhiệt để xác định chính xác thời hạn sử dụng.
    • Thử nghiệm ứng dụng phối trộn dịch thủy phân vào khẩu phần thức ăn thực tế cho tôm, cá để đánh giá tốc độ tăng trưởng, hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) và tỷ lệ sống của vật nuôi thủy sản.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng sử dụng: Sinh viên, học viên cao học, giảng viên và nhà nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Dinh dưỡng Động vật và Nuôi trồng Thủy sản.
  • Nội dung giá trị:
    • Phương pháp luận và thông số chi tiết của quy trình khử béo ấu trùng côn trùng bằng dung môi N-hexane.
    • Kỹ thuật bổ sung enzyme Alcalase 2 giai đoạn kết hợp mô hình tối ưu hóa bề mặt đáp ứng Box-Behnken 5 yếu tố.
    • Bảng dữ liệu định lượng chi tiết 17 axit amin làm nguồn dẫn liệu đối sánh cho các nghiên cứu sản xuất dịch đạm thủy phân từ côn trùng.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần phải tiến hành loại béo ấu trùng bằng N-hexane trước khi thủy phân?
Ấu trùng ruồi lính đen chứa hàm lượng chất béo thô cao (10–35%). Việc ngâm chiết loại béo bằng N-hexane theo tỷ lệ 1:5 (w/v) giúp ngăn chặn hiện tượng ôi dầu do phản ứng oxy hóa lipid trong quá trình thủy phân và bảo quản, đồng thời làm tăng nồng độ protein thô trong cơ chất lên 45%, giúp enzyme tiếp xúc tốt hơn với các liên kết peptide.

2. Kỹ thuật bổ sung enzyme Alcalase trong nghiên cứu này có điểm gì đặc biệt?
Thay vì bổ sung toàn bộ lượng enzyme ngay từ đầu, tác giả chia làm 2 giai đoạn: bổ sung 50% lượng enzyme ở thời điểm bắt đầu và bổ sung 50% còn lại sau khi phản ứng đã diễn ra được 1/2 tổng thời gian thủy phân. Cách làm này giúp duy trì hoạt lực xúc tác của protease liên tục, hạn chế hiện tượng kìm hãm phản ứng bởi sản phẩm trung gian.

3. Bộ thông số công nghệ tối ưu cho quá trình thủy phân được xác định là bao nhiêu?
Điều kiện tối ưu thực nghiệm gồm: Tỷ lệ cơ chất/nước là 1:15 (w/v), nồng độ enzyme Alcalase là 2,8% so với nguyên liệu, nhiệt độ 59°C, pH ban đầu 7,5 và thời gian thủy phân là 3,5 giờ. Ở điều kiện này, hiệu suất thủy phân thực tế đạt $18,79 \pm 1,14%$.

4. Dịch thủy phân thu được có thành phần axit amin nào nổi trội nhất?
Dịch thủy phân chứa 17 loại axit amin với tổng hàm lượng 11.826 mg/L, trong đó cao nhất là Axit glutamic đạt 1745 mg/L (chiếm 14,7%), tiếp theo là Histidine đạt 1446 mg/L và Axit aspartic đạt 1223 mg/L.

5. Giải pháp bảo quản dịch thủy phân sau khi thu hồi được thực hiện như thế nào?
Dịch đạm sau thủy phân được điều chỉnh giảm pH về mức 5,0 bằng Axit citric ($\text{C}_6\text{H}_8\text{O}_7$). Thử nghiệm cho thấy ở pH 5,0, sản phẩm có thể lưu trữ ổn định ở nhiệt độ phòng trong vòng 35 ngày mà không bị biến tính hay phát sinh nhiều đạm amoniac.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Võ Tường Duy đã hoàn thiện quy trình công nghệ thủy phân protein từ ấu trùng ruồi lính đen (Hermetia illucens) bằng enzyme Alcalase qua mô hình tối ưu hóa bề mặt đáp ứng Box-Behnken 5 yếu tố. Dịch đạm thu được đạt hiệu suất thủy phân 18,79%, sở hữu hàm lượng protein hòa tan 17,63 g/L cùng phổ 17 axit amin phong phú, đáp ứng tiêu chuẩn thức ăn thủy sản theo Thông tư 26/2018/TT-BNNPTNT. Kết quả nghiên cứu đồng thời chứng minh giải pháp hạ pH xuống 5,0 bằng axit citric cho phép bảo quản dịch đạm ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 tháng, cung cấp cơ sở thực nghiệm vững chắc cho việc phát triển các sản phẩm dẫn dụ và bổ sung đạm sinh học trong chăn nuôi.