Nghiên cứu tính sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp, góp phần vào ứng dụng sinh học.

• Tác giả: Nguyễn Thị Kim Thu
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Tuyên
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Sơ lược về enzyme xylanase
• 1.2. Đặc điểm cơ chất, cơ chế xúc tác
• 1.3. Ứng dụng của enzyme xylanase
• 1.3.1. Các chế phẩm xylanase trên thị trường quốc tế
• 1.3.2. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc
• 1.3.3. Trong công nghiệp thực phẩm
• 1.3.4. Trong công nghiệp giấy và bột giấy
• 1.3.5. Các ứng dụng khác
• 1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất xylanase
• 1.4.1. Trên thế giới
• 1.4.2. Tại Việt Nam
• 2. CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
• 2.1.1. Môi trường
• 2.1.2. Thiết bị thí nghiệm
• 2.2. Phương pháp
• 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase
• 2.2.2. Xác định hoạt tính enzym xylanase
• 2.2.3. Xác định hàm lượng protein
• 2.2.4. Tinh sạch xylanase
• 2.2.5. Điện di SDS-PAGE
• 2.2.6. Xác định tính chất lý hóa của xylanase
• 2.2.7. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nuôi biểu hiện và tinh sạch enzyme xylanase từ chủng tái tổ hợp sinh tổng hợp xylanase
• 3.2. Đánh giá tính chất lý hóa của enzyme xylanase tái tổ hợp
• 3.2.1. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ
• 3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH
• 3.2.3. Dung môi hữu cơ
• 3.2.4. Chất tẩy rửa
• 3.2.5. Ion kim loại
• 3.2.6. Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp
• 3.2.7. Tinh sạch enzyme tự nhiên
• 3.3. Khả năng phân giải cơ chất của xylanase tự nhiên và tái tổ hợp
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu enzyme xylanase từ Aspergillus niger tái tổ hợp

Enzyme xylanase là một trong những enzyme quan trọng trong quá trình phân giải xylan, một polysaccharid chủ yếu trong thành tế bào thực vật. Nghiên cứu về enzyme này từ chủng nấm Aspergillus niger tái tổ hợp đã mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và sản xuất giấy. Việc tinh sạch và đánh giá tính chất của enzyme xylanase từ Aspergillus niger tái tổ hợp không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của enzyme mà còn tạo điều kiện cho việc phát triển các sản phẩm enzyme chất lượng cao.

1.1. Đặc điểm và cơ chế hoạt động của enzyme xylanase

Enzyme xylanase có khả năng thủy phân các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong xylan, tạo ra xylose và các oligosaccharide. Cơ chế xúc tác của enzyme này liên quan đến sự tương tác giữa các gốc axit và nước, giúp phá vỡ liên kết glycosidic. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng enzyme xylanase từ Aspergillus niger có cấu trúc bậc ba đặc trưng, ảnh hưởng đến hoạt tính và khả năng thủy phân của nó.

1.2. Tình hình nghiên cứu enzyme xylanase trên thế giới

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để phát triển và tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme xylanase từ các chủng vi sinh vật khác nhau. Các nghiên cứu này không chỉ tập trung vào việc tinh sạch enzyme mà còn đánh giá các tính chất lý hóa của enzyme, từ đó tìm ra ứng dụng thực tiễn trong các ngành công nghiệp khác nhau.

II. Thách thức trong việc sản xuất enzyme xylanase tái tổ hợp

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc sản xuất enzyme xylanase tái tổ hợp từ Aspergillus niger vẫn gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như hiệu suất sản xuất thấp, chi phí tinh sạch cao và độ ổn định của enzyme trong các điều kiện khác nhau cần được giải quyết. Những thách thức này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải tìm ra các phương pháp tối ưu hóa quy trình sản xuất và tinh sạch enzyme.

2.1. Vấn đề về hiệu suất sản xuất enzyme

Hiệu suất sản xuất enzyme xylanase từ Aspergillus niger tái tổ hợp thường không đạt yêu cầu mong muốn. Các yếu tố như điều kiện nuôi cấy, loại môi trường và thời gian nuôi cấy đều ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để tối ưu hóa các yếu tố này.

2.2. Chi phí và quy trình tinh sạch enzyme

Quy trình tinh sạch enzyme xylanase thường tốn kém và phức tạp. Việc sử dụng các phương pháp tinh sạch hiệu quả và tiết kiệm chi phí là rất cần thiết để nâng cao tính khả thi của việc sản xuất enzyme này trong quy mô công nghiệp.

III. Phương pháp nghiên cứu enzyme xylanase từ Aspergillus niger

Để nghiên cứu enzyme xylanase từ Aspergillus niger tái tổ hợp, các phương pháp nuôi cấy, tinh sạch và đánh giá hoạt tính enzyme đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy sinh tổng hợp, xác định hoạt tính enzym và điện di SDS-PAGE để phân tích độ tinh khiết của enzyme. Những phương pháp này giúp đảm bảo rằng enzyme thu được có hoạt tính cao và độ tinh khiết tốt.

3.1. Nuôi cấy và sinh tổng hợp enzyme xylanase

Quá trình nuôi cấy Aspergillus niger tái tổ hợp được thực hiện trong môi trường thích hợp để tối ưu hóa khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase. Các điều kiện như pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đều được điều chỉnh để đạt được hiệu suất cao nhất.

3.2. Phương pháp tinh sạch enzyme xylanase

Các phương pháp tinh sạch enzyme xylanase bao gồm sắc ký trao đổi ion và điện di SDS-PAGE. Những phương pháp này giúp loại bỏ các tạp chất và thu được enzyme có độ tinh khiết cao, từ đó đánh giá chính xác các tính chất lý hóa của enzyme.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng enzyme xylanase

Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme xylanase từ Aspergillus niger tái tổ hợp có hoạt tính cao và khả năng thủy phân arabinoxylan tốt. Enzyme này có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và sản xuất giấy. Việc ứng dụng enzyme xylanase không chỉ giúp cải thiện hiệu suất sản xuất mà còn giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

4.1. Đánh giá hoạt tính và tính chất lý hóa của enzyme

Hoạt tính của enzyme xylanase được đánh giá thông qua các thử nghiệm thủy phân arabinoxylan. Kết quả cho thấy enzyme có khả năng hoạt động tốt trong các điều kiện pH và nhiệt độ khác nhau, cho thấy tính linh hoạt và khả năng ứng dụng cao.

4.2. Ứng dụng enzyme xylanase trong công nghiệp

Enzyme xylanase từ Aspergillus niger tái tổ hợp có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sản xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp thực phẩm và sản xuất giấy. Việc sử dụng enzyme này giúp cải thiện chất lượng sản phẩm và giảm thiểu chi phí sản xuất.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu enzyme xylanase

Nghiên cứu về enzyme xylanase từ Aspergillus niger tái tổ hợp đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển các sản phẩm enzyme chất lượng cao. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều thách thức cần được giải quyết để tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng enzyme này. Tương lai của nghiên cứu enzyme xylanase hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho các ngành công nghiệp khác nhau.

5.1. Triển vọng nghiên cứu enzyme xylanase

Nghiên cứu về enzyme xylanase sẽ tiếp tục được mở rộng với mục tiêu phát triển các chủng vi sinh vật mới có khả năng sản xuất enzyme hiệu quả hơn. Các nghiên cứu này sẽ giúp nâng cao hiệu suất sản xuất và giảm thiểu chi phí.

5.2. Ứng dụng trong công nghiệp và môi trường

Việc ứng dụng enzyme xylanase trong công nghiệp không chỉ giúp cải thiện hiệu suất sản xuất mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Các nghiên cứu trong tương lai sẽ tập trung vào việc phát triển các quy trình sản xuất bền vững và thân thiện với môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Xylan một loại polysacharid chiếm phần lớn trong thành phần hemicellulose của thành tế bào thực vật. Để phân giải hoàn toàn xylan thành xylose cần có sự phối hợp của nhiều loại xylanase khác nhau với các chức năng khác nhau (endo-β-1,4-D- xylanase, EC 3.1; acetyl xylan esterase; EC 3. Endoxylanase có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Xylanase dùng cho công nghiệp bột giấy, hỗ trợ quy trình tẩy trắng, giúp giảm hóa chất độc (chlorine) thường dùng để tẩy lignin trong giấy [14], làm trong nước hoa quả, rượu vang, bia, tạo đường xylitol cho công nghiệp bánh kẹo [67].

Xylanase thủy phân hemicellulose tạo arabinoxylan (AX) và chuỗi oligosaccharid arabinoxylan ngắn hơn (arabinoxylanoligosaccharid-AXOS). Arabinoxylan (AX) là một thành phần chất xơ chính được tìm thấy trong một loạt các loại ngũ cốc, được dùng cho chế độ ăn kiêng có tác dụng tốt đối với sức khỏe con ngườ. Nên arabinoxylan được định hướng dùng làm phẩm chức năng [71, 61, 57]. Rất nhiều chủng vi sinh vật tự nhiên từ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi được công bố có khả năng sản xuất xylanase, trong đó nấm mốc là sinh vật tiềm năng có khả năng tổng hợp xylanase hoạt tính cao [38].

Vì những lý do ứng dụng khác nhau, rất nhiều loại xylanase được sản xuất từ chủng Bacillus [14] và chủng nấm Aspergillus như Aspergillus awamori, Aspergillus ficuum, Aspergillus giganteus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger và Aspergillus sydowii đã được tinh sạch và đánh giá một số tính chất lý hóa của xylanase [33, 34, 49, 57, 62, 85]. Các nghiên cứu trong nước cũng như trên thế giới đã tạo ra chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp xylanase như E. Chủng Aspergillus niger VTCC017/pANXlnG2 đã được tạo ra từ việc nhân đoạn gen xylanase từ chủng Aspergillus oryzae VTCC F187, gen mã hóa xylanase được chèn vào vector biểu hiện pAN7.1GluA với cặp mồi đặc hiệu, plasmid tái tổ hợp được đưa vào A. niger VTCC 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 017 với chất cảm ứng hygromycin sau 72 giờ nuôi cấy chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase cao.

Với mong muốn ứng dụng chủng vào thực tế sản xuất enzyme xylanase tái tổ hợp định hướng nghiên cứu khả năng thủy phân arabinoxylan và các chế phụ phẩm nông nghiệp chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp” với mục tiêu sau: 1. Tinh sạch được enzyme xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp 2. Đánh giá các tính chất lý hóa của xylanase tái tổ hợp 3. Thử nghiệm khả năng thủy phân của enzyme xylanase tái tổ hợp và enzyme xylanase tự nhiên.

2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lƣợc về enzyme xylanase 1. Định nghĩa Theo Hội hóa sinh và sinh học phân tử thế giới (the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) enzym có mã số EC 3.8 có [67]: Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4- xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4- xylanase; endo-1,4-β-D- xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β- xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-D- xylanase Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong xylan tạo thành các oligosacharid ngắn (oligoxylose) và xylose (Hình 1.1: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong quá trình thủy phân xylan [67] 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Phân loại Enzyme xylanase thường được tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật. Chúng được phân chia thành hai nhóm dựa vào sự tương đồng về đặc tính lý hóa như là khối lượng phân tử, điểm đẳng điện và các đặc tính xúc tác khác nhau của chúng: Enzyme endo-xylanase họ 10 gồm các enyzyme có nguồn gốc từ thực vật, nấm mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử cao với giá trị pI thấp (trước đây gọi là họ F). Enzyme endo-xylanse họ 11 gồm các enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được (trước đây gọi là họ G) [52, 73]. Sự khác biệt về đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase là endo-xylanase của họ 10 có khả năng thủy phân các liên kết glycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử còn endo-xylanase thuộc họ 11 không có khả năng đó [41].

Trong khi endo-xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh thì endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế. Ngoài việc phân loại enzyme xylanase làm 2 nhóm lớn, nhiều nhà khoa học cũng đã tiến hành nghiên cứu, phân chia enzyme xylanase thành những nhóm nhỏ hơn. Sapag và cộng sự (2002) chia xylanase họ 11 thành 6 nhóm chính. Nhóm I, II và III chứa chủ yếu các enzyme của nấm mốc.

Các enzyme nhóm I và II thường là các enzyme có khối lượng khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ Ascomyceta và Basidiomyceta. Các enzyme nhóm I có giá trị pI bazơ trong khi đó nhóm II có giá trị pI ở phía axit. Các enzyme của nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi các nấm yếm khí. Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và C.

Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương. Nhóm B và C thì chứa các enzyme chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương, những loài thường sống trong dạ cỏ [73]. Cấu trúc 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt các enzyme [81], từ cả vi khuẩn và nấm mốc. Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus circulans có nét đặc trưng của họ 11 [41].

Nếp gấp domain xúc tác là do hai nếp gấp β tạo thành (A và B) chủ yếu là bởi các mặt β đối song và một chuỗi xoắn α ngắn và tương tự như một phần bàn tay phải được đóng lại [73]. Sự khác nhau trong hoạt động xúc tác của các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba của chúng. Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu được sắp xếp từ các mảnh β. Cấu trúc toàn thể của domain xúc tác của xylanase họ 10 như là một cái thùng hình trụ được tạo thành từ 8 mảnh.2: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 10 từ Bacillus haloduran [39] Các thành viên của họ F11 có dạng domain xúc tác từ các mảnh nếp gấp β cái mà làm thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác.

Vũng lõm này được so sánh với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngón cái của tay phải. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.3: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 [Jeffries1996] Xylanase có thể liên kết với từ ba đến năm vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác. Meagher và cộng sự (1998) nhận thấy rằng Xyn 2 của Trichoderma reesei có thể liên kết với năm vòng xylopyranose, trong khi đó thì Xyn 1 chỉ có thể liên kết với 3 vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác [59]. Các vị trí cho các gốc xylopyranose liên kết được xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởi tryptophan [21, 80].

Đặc điểm cơ chất, cơ chế xúc tác 1. Đặc điểm cơ chất Xylanase chủ yếu thủy phân xylan và một phần nhỏ cellulose. Xylan là thành phần chính cấu tạo hemicellulose tập trung chủ yếu ở cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật, và là một trong số polysaccharid quan trọng trong tự nhiên [48]. Ở cây gỗ cứng, xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan (Hình 1.4), còn ở cây gỗ mềm là arabino-4-O-methylglucuronoxylan (Hình 1.

Ở các loài ngũ cốc, thành phần cấu tạo xylan là acid D-glucuronic, có hoặc không có liên kết ete 4-Omethylvà arabinose. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.4: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ cứng [48] Hình 1.5: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ mềm [48] 1. Phức hệ enzyme phân cắt xylan Có nhiều phương pháp có thể được sử dụng để thủy phân hoàn toàn xylan. Sử dụng kiềm mạnh hoặc axit mạnh là những biện pháp đang được sử dụng phổ biến hiện nay bởi hiệu quả thủy phân và giá trị kinh tế.

Nhưng vấn đề ô nhiễm môi trường đang ngày càng gia tăng, đòi hòi các nhà khoa học phải tìm tòi, nghiên cứu ra phương pháp thủy phân polysaccharide nói chung và xylan nói riêng bằng enzyme sinh học. Phân huỷ sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzyme [68], trong đó endo- β-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.8) thực hiện nhiệm vụ phân cắt mạch chính xylan bằng việc thủy phân ngẫu nhiên khung xylan tạo ra các oligosaccharide. Sau đó exo-β-1,4-D-xylosidase (β- 1,4-D-xylan xylohydrolase EC 3.37) thủy phân các oligosaccharide thành các monomer. Các nhóm bên có mặt trong xylan được giải phóng bởi α-L-arabinofuranosidase, α-D-glucuronidase, galactosidase và acetyl xylan esterase.

7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.6: Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ [68] Exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.37) xúc tác thủy phân β-1,4-D-xylo- oligosaccharide bằng cách loại bỏ xylose từ đầu không khử. Sự thủy phân liên kết α- 1,2 -glycosidic bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan. Tương tự như liên kết giữa cacbonhydrat và lignin, dạng liên kết 4-O-methyl-glucuronidase với xylose là hàng rào trong sự phá hủy gỗ. Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp α-glucuronidase [39].

Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase để loại bỏ liên kết của các axit acetic và axit phenolic với xylose. Esterase phá vỡ liên kết của xylose với axit acetic (acetyl xylan esterase (EC 3.6), các gốc chuỗi bên arabinose với axit ferulic (feruloyl esterase) và gốc chuỗi bên arabinose với axit p-coumaric (p- coumaroyl esterase). Phân cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thì thuận lợi cho sự loại bỏ lignin. Chúng có thể góp phần làm hòa tan lignin bởi sự phân cắt các liên kết este giữa lignin và hemicellulose.

Nếu sử dụng cùng với xylanase và các enzym 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] phân hủy xylan khác trong tẩy trắng bột giấy, các esterase có thể phá vỡ và làm lỏng lẻo một phần cấu trúc của thành tế bào [19]. Enzyme quan trọng nhất trong hệ thống enzyme thủy phân cơ chất xylan là enzyme xylanase [67]. Vì nó là enzyme khởi đầu cho hệ thống phản ứng phân cắt các liên kết của xylan. Cơ chế xúc tác Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế xúc tác của xylanase [23, 41, 50, 53].

Một cách tổng quát, cơ chế hoạt động xúc tác của xylanase được sơ đồ hóa qua Hình 1.