Luận án nghiên cứu vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở Nha Trang

Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii tại Nha Trang, ứng dụng trong y dược học.

• Tác giả: Nguyễn Đình Luyện
• Người hướng dẫn: GS. Lê Mai Hương
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii

Nghiên cứu vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii tại Nha Trang đang thu hút sự quan tâm lớn từ cộng đồng khoa học. Rong sụn Kappaphycus alvarezii không chỉ là nguồn thực phẩm mà còn là môi trường sống cho nhiều loại vi sinh vật. Việc tìm hiểu về các vi sinh vật này giúp hiểu rõ hơn về hệ sinh thái biển và tiềm năng ứng dụng trong y dược học.

1.1. Đặc điểm sinh học của rong sụn Kappaphycus alvarezii

Rong sụn Kappaphycus alvarezii là một loại rong biển có giá trị kinh tế cao. Nó có khả năng sinh trưởng nhanh và chịu được điều kiện môi trường khắc nghiệt. Đặc điểm này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các vi sinh vật liên kết.

1.2. Vai trò của vi sinh vật trong hệ sinh thái biển

Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng sinh thái biển. Chúng không chỉ tham gia vào quá trình phân hủy chất hữu cơ mà còn sản xuất các chất có hoạt tính sinh học, giúp bảo vệ rong khỏi các tác nhân gây hại.

II. Thách thức trong nghiên cứu vi sinh vật biển tại Nha Trang

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nghiên cứu vi sinh vật biển tại Nha Trang vẫn gặp phải nhiều thách thức. Các yếu tố như ô nhiễm môi trường, biến đổi khí hậu và sự khai thác quá mức tài nguyên biển đang ảnh hưởng đến sự đa dạng của vi sinh vật.

2.1. Ảnh hưởng của ô nhiễm môi trường đến vi sinh vật

Ô nhiễm từ các hoạt động công nghiệp và sinh hoạt đang làm giảm chất lượng nước biển, ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật. Nghiên cứu cho thấy rằng các vi sinh vật nhạy cảm với các chất ô nhiễm có thể bị giảm số lượng hoặc biến đổi gen.

2.2. Biến đổi khí hậu và tác động đến hệ sinh thái biển

Biến đổi khí hậu dẫn đến sự thay đổi nhiệt độ và độ pH của nước biển, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của rong sụn và các vi sinh vật liên kết. Điều này có thể làm giảm khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật.

III. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii

Để nghiên cứu vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii, các phương pháp hiện đại như metagenomics và nuôi cấy truyền thống đã được áp dụng. Những phương pháp này giúp phân lập và xác định các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao.

3.1. Phương pháp thu thập mẫu và phân lập vi sinh vật

Mẫu rong sụn được thu thập từ vùng biển Nha Trang và được xử lý để phân lập các chủng vi sinh vật. Các phương pháp nuôi cấy và phân lập giúp xác định các vi sinh vật có khả năng sản xuất chất kháng sinh.

3.2. Phân tích metagenomic trong nghiên cứu vi sinh vật

Phân tích metagenomic cho phép xác định sự đa dạng và cấu trúc của quần thể vi sinh vật mà không cần nuôi cấy. Phương pháp này giúp phát hiện các chủng vi sinh vật mới và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn từ vi sinh vật liên kết

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng cao của các chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii. Nhiều chủng vi sinh vật đã được xác định có hoạt tính sinh học mạnh, mở ra cơ hội ứng dụng trong y dược học.

4.1. Đặc điểm hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất các hợp chất kháng sinh và chất chống oxy hóa. Những hợp chất này có thể được ứng dụng trong điều trị bệnh và bảo vệ sức khỏe con người.

4.2. Tiềm năng ứng dụng trong y dược học

Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật liên kết với rong sụn có thể được phát triển thành các sản phẩm y dược. Điều này không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe mà còn tạo ra giá trị kinh tế cho ngành công nghiệp dược phẩm.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu vi sinh vật biển

Nghiên cứu vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii tại Nha Trang đã mở ra nhiều hướng đi mới cho nghiên cứu sinh học biển. Việc bảo tồn và phát triển hệ sinh thái biển là cần thiết để duy trì sự đa dạng sinh học và ứng dụng trong y dược học.

5.1. Tầm quan trọng của việc bảo tồn hệ sinh thái biển

Bảo tồn hệ sinh thái biển không chỉ giúp duy trì sự đa dạng sinh học mà còn bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên. Các biện pháp bảo tồn cần được thực hiện để đảm bảo sự phát triển bền vững.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp mới để khai thác tiềm năng của vi sinh vật biển. Việc kết hợp giữa công nghệ sinh học và nghiên cứu sinh thái sẽ mang lại nhiều lợi ích cho ngành y dược.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học (mã số 9.42.01.01 / 9.01) của nghiên cứu sinh Nguyễn Đình Luyện, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Lê Mai Hương và PGS. Phan Văn Kiệm tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Luận án giải quyết vấn đề khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật biển và các hợp chất có hoạt tính sinh học định hướng ứng dụng trong y dược học.

• Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu: Rong biển là giá thể cư trú của quần thể vi sinh vật đa dạng với mật độ vi khuẩn từ $10^2 - 10^7\text{ CFU/cm}^2$ và vi nấm khoảng $10^4\text{ CFU/cm}^2$. Môi trường bề mặt rong có tính cạnh tranh dinh dưỡng và không gian gay gắt, thúc đẩy vi sinh vật liên kết sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học cao (khoảng 30–50% vi khuẩn trên rong có khả năng sản xuất chất đối kháng vi sinh vật, cao hơn mức dưới 10% của vi sinh vật sống tự do trong nước biển hoặc bùn đáy). Tuy nhiên, hơn 99% vi sinh vật trong tự nhiên không thể nuôi cấy bằng kỹ thuật thông thường trong phòng thí nghiệm. Tại Việt Nam, các công bố về cấu trúc quần thể vi sinh vật trên cây rong sụn Kappaphycus alvarezii còn hạn chế, đặc biệt là việc kết hợp đồng thời kỹ thuật metagenomics không qua nuôi cấy với phương pháp nuôi cấy truyền thống nhằm sàng lọc, tối ưu hóa lên men và phân lập các hoạt chất tự nhiên phục vụ y dược học.
• Mục tiêu nghiên cứu:
  1. Đánh giá sự đa dạng của vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii theo phương pháp nuôi cấy truyền thống và phương pháp metagenomics không thông qua nuôi cấy (đối với cả vi khuẩn và vi nấm).
  2. Phân lập, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất có hoạt tính sinh học (kháng sinh, gây độc tế bào ung thư, chống oxy hóa) từ chủng vi sinh vật tuyển chọn có hoạt tính cao.
• Nội dung nghiên cứu:
  1. Phân lập, sàng lọc các chủng vi khuẩn và vi nấm có hoạt tính kháng sinh liên kết với rong Kappaphycus alvarezii tại vịnh Vân Phong, tỉnh Khánh Hòa.
  2. Nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn và vi nấm trên mẫu rong biển thu thập bằng phương pháp sinh học phân tử (trình tự gen 16S rRNA đối với vi khuẩn và vùng ITS/28S rDNA đối với vi nấm).
  3. Lên men, đánh giá hoạt tính sinh học các chủng vi khuẩn và vi nấm tiêu biểu.
  4. Nghiên cứu điều kiện lên men rắn thích hợp cho chủng vi nấm tiêu biểu nhằm sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học cao; tối ưu hóa quá trình lên men bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
  5. Phân lập, tinh sạch, xác định cấu trúc hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học chi tiết của các hợp chất phân lập được.
• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
  • Đối tượng nghiên cứu: Rong sụn Kappaphycus alvarezii, các chủng vi khuẩn và vi nấm sống liên kết (bề mặt và nội sinh), chủng nấm tuyển chọn Aspergillus micronesiensis, các dòng tế bào ung thư người và các chủng vi sinh vật kiểm định.
  • Phạm vi không gian: Mẫu rong sụn được thu thập tại 2 vị trí thuộc vịnh Vân Phong, huyện Vạn Ninh, tỉnh Khánh Hòa: điểm Cổ Cò (mẫu VP1 và VP2, tọa độ 12°38'01''N; 109°15'04''E) và điểm Vũng Ké (mẫu VP3, tọa độ 12°37'05''N; 109°14'45''E).
  • Phạm vi thời gian và thực nghiệm: Đề tài triển khai trong giai đoạn hoàn thành năm 2022 thuộc khuôn khổ đề tài NĐT11.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các nghiên cứu quốc tế và trong nước về hệ vi sinh vật liên kết với sinh vật biển và các chất chuyển hóa thứ cấp:

• Các nghiên cứu quốc tế:
  • Hoạt tính đối kháng từ sinh vật biển: Masuda (1997, 1998) xác định tảo đỏ Laurencia majuscula sản sinh 4 hợp chất kháng sinh nhóm halogenated sesquiterpene (elatol, iso-obtusol, 10,15-dibromo-9-hydroxy-chamigra-1,3(15),7(14)-triene và dẫn xuất đồng phân E) ức chế vi khuẩn gây bệnh trắng nhũn trên rong. Baker và cs. (2009) phân lập 19 kiểu gen nấm từ bọt biển Haliclona sp. có hoạt tính ức chế Escherichia coli, Bacillus sp., Staphylococcus aureus và Candida glabrata. Rateb và cộng sự (2011) thống kê các chất thứ cấp từ nấm biển có nguồn gốc từ rong/tảo biển chiếm tỷ lệ cao nhất (21%), vượt trội so với bọt biển (19%) và rừng ngập mặn (16%).
  • Chất chuyển hóa từ vi khuẩn và vi nấm liên kết: Tapiolas và cs. (1991) phân lập Octalactin A và B từ chủng Streptomyces sp. trên bề mặt san hô Pacifigorgia, thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư B-16-F10 và HCT-116 với giá trị $\text{IC}{50}$ lần lượt là 0,0072 và 0,5 µg/mL. Burgess và cs. (1999) ghi nhận 35% vi khuẩn bề mặt rong có hoạt tính kháng khuẩn. Cui và cs. (2009) phân lập 2-hydroxycircumdatin C từ Aspergillus ochraceus sống trên rong nâu Sargassum kjellmanianum có khả năng khử gốc tự do DPPH với $\text{IC}{50} = 9,9\text{ }\mu\text{M}$ (mạnh gấp 8,9 lần đối chứng dương BHT), cùng các dẫn xuất 7-norergosterolide gây độc dòng tế bào NCI-H460, SMMC-7721, SW1990 ($\text{IC}_{50}$ từ 5,0 đến 28,0 µg/mL). Zhu và cs. (2009) phân lập citrinal A từ Penicillium sp. trên rong lục Blidingia minima có độc tính trên dòng tế bào A549 và HL60. Gao và cs. (2011) phân lập các diterpene conidiogenone từ Penicillium chrysogenum QEN-24S cộng sinh trên tảo đỏ Laurencia sp. có hoạt tính kháng S. aureus, S. epidermidis và P. fluorescens ($\text{MIC} = 8\text{ }\mu\text{g/mL}$).
  • Ứng dụng sinh học phân tử và Metagenomics: Burke và cs. (2011b) phân tích gen 16S rRNA và metagenomics trên rong lục Ulva australis, chỉ ra rằng cấu trúc cộng đồng vi khuẩn được định hướng bởi các nhóm gen chức năng hơn là phân loại học thuần túy. Fernandes và cs. (2011, 2012) phân tích thư viện 16S rDNA trên rong đỏ Delisea pulchra, phát hiện sự thay đổi cấu trúc vi sinh vật giữa rong khỏe mạnh (133 OTU) và rong bệnh bạc màu (364 OTU) với sự xuất hiện của các chi tiết enzyme phân hủy thành tế bào như Thalassomonas, Cellulophaga, Pseudoruegeria.
• Các nghiên cứu tại Việt Nam:
  • Bùi Đình Lãm và cs. (2011) phân lập 119 chủng vi khuẩn từ rong sụn bị bệnh trắng nhũn (Ice-Ice disease), xác định hai loài chiếm ưu thế là Vibrio parahaemolyticus (21,7%) và Burkholderia cepacia (17,4%).
  • Đỗ Thị Huyền và cs. (2012, 2014) ứng dụng metagenomics khai thác hệ gen mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose từ ruột mối và các hệ sinh thái suối nước nóng Bình Châu, dạ cỏ dê chăn thả. Lê Mai Hương và cs. nghiên cứu metagenome vi sinh vật đất vùng rễ cây cà phê và nghệ.
  • Nguyễn Thị Kim Cúc (2014–2018) nghiên cứu metagenome vi sinh vật liên kết hải miên tại miền Trung, giải mã kích thước hệ gen từ 311 đến 418 Mb, phát hiện các OTU mới. Chu Hoàng Hà và cs. (2021) ứng dụng dữ liệu 16S rRNA và shotgun metagenome đánh giá biến động vi sinh vật trong đầm nuôi tôm.
  • Lê Hữu Cường và Lê Thị Hồng Nhung (2021) phân lập 125 chủng vi khuẩn và 169 chủng nấm từ 30 mẫu rong biển tại Khánh Hòa, Ninh Thuận, Phú Yên, sàng lọc các chủng sinh enzyme carrageenase, fucoidanase và ức chế $\alpha$-glucosidase, acetylcholinesterase.
• Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Chưa có công trình nào tại Việt Nam tiến hành khảo sát toàn diện hệ vi sinh vật (cả vi khuẩn và vi nấm) liên kết trên cây rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vịnh Vân Phong bằng cách tích hợp đồng thời phương pháp phân tích metagenomics thế hệ mới với phương pháp nuôi cấy truyền thống; đồng thời chưa có nghiên cứu đi sâu tối ưu hóa quy trình lên men rắn và tinh sạch, xác định cấu trúc các hợp chất hóa học mới có hoạt tính sinh học từ loài nấm biển Aspergillus micronesiensis.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án tiếp cận dựa trên lý thuyết tương tác sinh thái học giữa vi sinh vật và sinh vật chủ trong môi trường biển: rong biển cung cấp cơ chất hữu cơ, oxy và bề mặt cư trú; ngược lại, vi sinh vật cung cấp nguồn khoáng, $\text{CO}_2$, enzyme chuyển hóa và các chất trao đổi chất thứ cấp nhằm bảo vệ vật chủ chống lại sự bám sinh của sinh vật ngoại lai và tác nhân gây bệnh. Khung phân tích của luận án tích hợp:

1. Tiếp cận metagenomics (Metabarcoding): Khai thác toàn bộ DNA tổng số trong mẫu tự nhiên nhằm đánh giá độ phong phú loài (species richness) và độ đa dạng sinh học thông qua các chỉ số Alpha-diversity (Shannon_H', Simpson, Chao-1, ACE) và phân tích sai khác Beta-diversity (Principal Component Analysis - PCA) mà không phụ thuộc vào khả năng nuôi cấy.
2. Quy hoạch thực nghiệm (Response Surface Methodology - RSM): Xây dựng mô hình toán học và tối ưu hóa các thông số công nghệ lên men rắn dựa trên thiết kế ma trận thực nghiệm bằng phần mềm Design-Expert 7.
3. Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Tách chiết bằng dung môi hữu cơ, phân đoạn sắc ký đa cấp và giải mã cấu trúc lập thể bằng hệ thống phổ nghiệm hiện đại.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

• Phương pháp thu mẫu và nuôi cấy vi sinh vật:
  • Thu mẫu: Cắt các đoạn thân, nhánh rong sụn $1\text{ cm}$ dưới nước, rửa 3 lần bằng nước biển vô trùng, bảo quản lạnh $4–8^\circ\text{C}$ và chuyển về phòng thí nghiệm.
  • Môi trường nuôi cấy: Môi trường MT1 (phân lập vi khuẩn biển: glucose $1\text{ g/L}$, cao nấm men $1\text{ g/L}$, pepton $5\text{ g/L}$, $\text{MgSO}_4\cdot 7\text{H}_2\text{O}$, 50% nước biển, 50% nước cất, nystatin $50\text{ mg/L}$); Môi trường MT3 (phân lập vi nấm: Sabouraud dextrose agar pha trên nền nước biển tự nhiên có bổ sung penicillin $1,5\text{ g/L}$ và streptomycin $1,5\text{ g/L}$, $\text{pH } 6,0–7,0$). Giữ giống trên MT2 (vi khuẩn) và thạch nghiêng Sabouraud hoặc glycerol 40% ở $-80^\circ\text{C}$ (vi nấm).
  • Định danh phân tử: Tách chiết DNA bằng Exgene™ Cell SV mini-kit (GeneAll, Hàn Quốc). Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA vi khuẩn sử dụng các cặp mồi 27F, 1492R, 518F, 800R; khuếch đại vùng ITS/28S rDNA vi nấm. Giải trình tự Sanger tại Genotech (Daejeon, Hàn Quốc) và so sánh cây phát sinh chủng loại bằng thuật toán Neighbor-Joining.
• Phương pháp Metagenomics:
  • Tách chiết DNA tổng số trực tiếp từ mẫu rong biển, khuếch đại vùng gen đích, xây dựng thư viện DNA và giải trình tự gen thế hệ mới (NGS).
  • Xử lý dữ liệu tin sinh học bằng phần mềm QIIME / Mothur, phân nhóm các đơn vị phân loại (OTU) theo ngưỡng tương đồng: $\ge 97%$ cho cấp loài, $\ge 95%$ cho cấp chi và $\ge 90%$ cho cấp họ. Tính toán các chỉ số Shannon, Simpson, Chao-1 và phân tích PCA.
• Phương pháp lên men và tối ưu hóa:
  • Lên men rắn (RYE): Nền cơ chất gồm $50\text{ g}$ gạo, $0,05\text{ g}$ dịch chiết nấm men, $0,02\text{ g }\text{KH}_2\text{PO}_4$ và $50\text{ mL}$ nước biển đựng trong bình tam giác $1000\text{ mL}$.
  • Tối ưu hóa: Đánh giá ảnh hưởng đơn biến của thời gian lên men, nồng độ muối, pH môi trường. Tiến hành quy hoạch thực nghiệm yếu tố toàn phần kết hợp phương pháp bề mặt đáp ứng trên phần mềm Design-Expert 7 để xác định giá trị tối ưu của các thông số công nghệ.
• Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học:
  • Chiết xuất và phân tách: Chiết kiệt sinh khối lên men bằng dung môi ethyl acetate (EtOAc), cô quay thu hồi cặn chiết thô. Phân tách cặn chiết bằng sắc ký cột thường (CC) với chất nhồi silica gel ($150\text{ }\mu\text{m}$, Fuji Silysia Chemical Ltd.), sắc ký pha đảo RP-18 ($F_{254\text{S}}$, Merck), nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Corp) và kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
  • Phổ nghiệm xác định cấu trúc: Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS đo trên thiết bị Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY) đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR ($500\text{ MHz}$ cho $^1\text{H}$ và $125\text{ MHz}$ cho $^{13}\text{C}$); phổ lưỡng sắc tròn (CD/ECD) đo trên máy Chirascan CD spectrometer (Applied Photophysics) kết hợp mô phỏng tính toán cơ học lượng tử TD-DFT; năng suất quay cực đo trên phân cực kế JASCO P-2000.

Nhóm đối tượng thử nghiệm	Danh mục chi tiết các chủng / dòng tế bào
Vi khuẩn Gram dương [Gr(+)]	Bacillus subtilis ATCC 27212, Staphylococcus aureus ATCC 12222
Vi khuẩn Gram âm [Gr(-)]	Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923
Nấm men & Nấm mốc	Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754, Candida albicans SH 20, Aspergillus niger 439, Fusarium oxysporum M42
Dòng tế bào khảo sát độc tính	Hep-G2 (ung thư biểu mô gan người), LU-1 (ung thư biểu mô phổi người), Vero (tế bào biểu mô thận khỉ)

• Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học:
  • Kháng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ): Thử nghiệm trên phiến vi lượng 96 giếng nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, $\mu\text{g/mL}$).
  • Gây độc tế bào ung thư: Phương pháp MTT hoặc Sulforhodamine B nhằm xác định tỷ lệ tế bào sống sót ($\text{CS}%$) và nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ($\text{IC}_{50}$, $\mu\text{g/mL}$).
  • Chống oxy hóa: Phương pháp dập tắt gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) và ABTS, xác định giá trị $\text{SC}_{50}$.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết vị trí sinh học, tiềm năng kinh tế và thành phần hóa thực vật của rong sụn Kappaphycus alvarezii (thuộc ngành rong Đỏ - Rhodophyta), loài rong nhiệt đới phân bố tại Nam Trung Bộ Việt Nam (Khánh Hòa, Ninh Thuận, Phú Yên) chứa hàm lượng carrageenan tự nhiên cao.

Thành phần hóa học của rong sụn Kappaphycus alvarezii	Tỷ trọng khối lượng (% tính theo chất khô)
Gluxit (Carbohydrate)	40 – 45%
Chất khoáng (Tro)	20%
Protein	2 – 22%
Các thành phần hóa học khác (Lipid, sắc tố, enzyme...)	5 – 13%

Chương 1 đi sâu tổng kết mối quan hệ cộng sinh phức tạp giữa vi sinh vật và rong biển; cơ chế truyền tín hiệu Quorum Sensing (QS); khả năng sản sinh enzyme đặc thù thủy phân thành tế bào rong (agarase, carrageenase, fucoidanase, alginate lyase); và tổng quan toàn diện các nhóm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học phân lập từ nấm và vi khuẩn biển (như macrolactin, diketopiperazine, phenylahistin, pseudodeflectusin, conidiogenone, 2-hydroxycircumdatin C). Chương cũng luận giải nguyên lý của phương pháp metagenomics, so sánh ưu thế của giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) so với phương pháp nuôi cấy trong việc khai phá 99% nguồn vi sinh vật chưa nuôi cấy được trong tự nhiên.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm từ khâu thực địa tại vịnh Vân Phong (tọa độ các điểm lấy mẫu VP1, VP2, VP3) đến thiết kế các hệ thống môi trường phân lập MT1, MT2, MT3, MT4, RYE và các môi trường giữ giống chuẩn. Thiết lập chi tiết quy trình tách chiết DNA, phản ứng PCR với các cặp mồi chuẩn cho gen 16S rRNA và vùng chuyển tiếp ITS/28S rDNA.

Mô tả phương pháp xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm tối ưu hóa quá trình lên men rắn cho chủng nấm mốc tuyển chọn bằng phần mềm Design-Expert 7; quy trình phân tách sắc ký đa cấp (CC, RP-18, Diaion HP-20, TLC); phương pháp đo và giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D NMR, phổ khối lượng siêu phân giải HR-ESI-MS, phổ lưỡng sắc tròn điện tử ECD; và các quy trình thử nghiệm vi sinh học, độc tính tế bào (Hep-G2, LU-1, Vero), chống oxy hóa (DPPH) theo tiêu chuẩn quốc tế.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được theo các nhánh nội dung:

1. Phân lập và phân loại vi sinh vật nuôi cấy được:
   • Phân lập thành công tập hợp các chủng vi khuẩn và vi nấm từ các mẫu rong VP1, VP2, VP3. Sàng lọc sơ bộ hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ), tuyển chọn các chủng có hoạt tính đối kháng phổ rộng.
   • Định danh phân tử dựa trên trình tự gen 16S rRNA xác định các chủng vi khuẩn hoạt tính cao thuộc các chi Bacillus (chủng VP02.11), Brevibacillus (chủng VP03.12) và Pseudomonas (chủng VP03.6). Phân tích trình tự vùng ITS định danh chủng vi nấm hoạt tính nổi trội VPN1 (VPN1.5) là Aspergillus micronesiensis.
2. Đánh giá cấu trúc quần thể vi sinh vật qua phân tích Metagenomics:
   • Quần thể vi khuẩn: Phân tích metabarcoding chỉ ra sự chiếm ưu thế của các ngành Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria. Ở cấp độ chi, các nhóm Cobetia, Pseudoalteromonas, Alteromonas, Flavobacterium, Vibrio, Bacillus, Pseudomonas xuất hiện với tỷ lệ sai khác giữa các mẫu rong khỏe mạnh và vị trí thu mẫu.
   • Quần thể vi nấm: Phân tích metagenomics ghi nhận sự hiện diện ưu thế của ngành Ascomycota và Basidiomycota, trong đó các chi nấm Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Fusarium, Acremonium chiếm tỷ lệ cao trong cấu trúc hệ vi nấm liên kết.
   • Chỉ số đa dạng sinh học: Tính toán số lượng OTU quan sát được, các chỉ số Shannon_H', Simpson, Chao-1 và biểu đồ phân tích thành phần chính PCA phản ánh độ phong phú loài và sự tương đồng/khác biệt cấu trúc vi sinh vật giữa các điểm lấy mẫu Cổ Cò và Vũng Ké.
3. Hoạt tính sinh học của cặn chiết thô:
   • Cặn chiết ethyl acetate từ dịch lên men chủng nấm Aspergillus micronesiensis VPN1 thể hiện hoạt tính ức chế mạnh trên nhiều chủng vi sinh vật kiểm định (kháng cả vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm kiểm định), đồng thời biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa dập tắt gốc tự do DPPH và hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng ung thư người Hep-G2 (ung thư gan) và LU-1 (ung thư phổi).
4. Tối ưu hóa điều kiện lên men rắn chủng Aspergillus micronesiensis:
   • Khảo sát đơn biến các yếu tố công nghệ: thời gian lên men, nồng độ muối biển trong môi trường RYE và pH ban đầu.
   • Quy hoạch thực nghiệm trên phần mềm Design-Expert 7: Thiết lập ma trận thí nghiệm, phân tích phương sai (ANOVA), xây dựng phương trình hồi quy đa thức biểu diễn tương quan giữa các yếu tố công nghệ với hàm mục tiêu $Y$ (hàm lượng cặn chiết ethyl acetate / hoạt tính kháng sinh). Xác định giá trị tối ưu của các thông số lên men, kiểm chứng mô hình bằng thực nghiệm với độ tương thích cao giữa giá trị dự đoán và thực tế.
5. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ Aspergillus micronesiensis:
   • Từ dịch lên men quy mô lớn ở điều kiện tối ưu, phân lập và tinh sạch được 10 hợp chất hữu cơ sạch.
   • Kết hợp phân tích phổ HR-ESI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY) và phổ ECD, cấu trúc hóa học của 10 hợp chất đã được làm sáng tỏ:

Ký hiệu mẫu	Tên hợp chất	Phân loại / Tính chất cấu trúc
AM8A1	Aspersiensis A	Hợp chất mới
AM8B1	Aspersiensis B	Hợp chất mới
AM8B2	Aspersiensis C	Hợp chất mới
AM3A1	4-hydroxybenzaldehyde	Hợp chất phenolic đơn giản
AM3D	(22E,24R)-5$\alpha$,8$\alpha$-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22-dien-3$\beta$-ol	Dẫn xuất ergosterol peroxide
AM4F1	2-O-methylbutyrolactone II	Dẫn xuất butyrolactone
AM6E1	1,3-dihydro-4,5,6-trihydroxy-7-methylisobenzofuran	Hợp chất dẫn xuất isobenzofuran
AM6E2	Epicoccone B (5,6,7-trihydroxy-4-methyl-1(3H)-isobenzofuranone)	Dẫn xuất phthalide / isobenzofuranone
AM7H	Epicoccolide B	Hợp chất polyketide phức tạp
AM8D	Epicoccolide A	Hợp chất polyketide phức tạp

6. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất tinh sạch:
   • Kháng VSVKĐ: Đa số các hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng đối với các chủng vi khuẩn kiểm định (B. subtilis, S. aureus, E. coli, P. aeruginosa) và vi nấm (C. albicans, A. niger, F. oxysporum) ở các mức nồng độ MIC khác nhau.
   • Chống oxy hóa: Các hợp chất phenolic và isobenzofuran (như AM3A1, AM6E1, AM6E2) thể hiện khả năng khử gốc tự do DPPH.
   • Độc tính tế bào ung thư: Các hợp chất mới Aspersiensis A, B, C cùng các hợp chất steroid AM3D và epicoccolide thể hiện độc tính tế bào chọn lọc trên các dòng ung thư biểu mô gan người Hep-G2 và ung thư phổi LU-1 với giá trị $\text{IC}_{50}$ cụ thể, ít ảnh hưởng độc hại trên dòng tế bào biểu mô thận khỉ bình thường (Vero).

---

Kết quả và những đóng góp mới

1. Đóng góp về mặt phương pháp luận và sinh thái học:
   • Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam kết hợp đồng thời kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại metagenomics (không qua nuôi cấy) với phương pháp nuôi cấy vi sinh vật truyền thống để phân tích, so sánh và đánh giá toàn diện sự đa dạng, cấu trúc quần thể cũng như tiềm năng sinh học của vi khuẩn và vi nấm sống liên kết trên loài rong sụn Kappaphycus alvarezii.
   • Cung cấp bộ cơ sở dữ liệu về thành phần loài, số lượng OTU và các chỉ số đa dạng sinh học ($\text{Shannon_H'}$, Simpson, Chao-1) của khu hệ vi sinh vật liên kết với rong sụn tại khu vực vịnh Vân Phong, tỉnh Khánh Hòa.
2. Đóng góp về mặt hóa học hợp chất thiên nhiên và y dược học:
   • Đã tối ưu hóa thành công quy trình lên men rắn trên môi trường RYE bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm (Design-Expert 7) cho chủng nấm biển Aspergillus micronesiensis VPN1.
   • Đã phân lập, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của 10 hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ chủng nấm Aspergillus micronesiensis.
   • Trong 10 hợp chất trên, có 03 hợp chất có cấu trúc mới hoàn toàn được công bố lần đầu tiên trên thế giới: Aspersiensis A (AM8A1), Aspersiensis B (AM8B1) và Aspersiensis C (AM8B2).
   • Đồng thời, 07 hợp chất đã biết bao gồm: AM3A1 (4-hydroxybenzaldehyde), AM3D ((22E,24R)-5$\alpha$,8$\alpha$-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22-dien-3$\beta$-ol), AM4F1 (2-O-methylbutyrolactone II), AM6E1 (1,3-dihydro-4,5,6-trihydroxy-7-methylisobenzofuran), AM6E2 (Epicoccone B hay 5,6,7-trihydroxy-4-methyl-1(3H)-isobenzofuranone), AM7H (epicoccolides B) và AM8D (epicoccolide A) là lần đầu tiên được phát hiện và phân lập từ chủng nấm Aspergillus micronesiensis sống liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii.
   • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa và gây độc tế bào ung thư (Hep-G2, LU-1) của các hợp chất phân lập được.
3. Kiến nghị và giải pháp đề xuất:
   • Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động dược lý ở mức độ phân tử của 03 hợp chất mới Aspersiensis A, B, C đối với các dòng tế bào ung thư và vi sinh vật kháng thuốc.
   • Nghiên cứu nâng quy mô lên men (scale-up) chủng nấm Aspergillus micronesiensis trên hệ thống bioreactor lên men rắn nhằm thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học với lượng lớn, phục vụ thử nghiệm tiền lâm sàng định hướng phát triển dược phẩm mới.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Địa bàn thu thập mẫu rong sụn thực nghiệm tập trung chủ yếu tại 2 vị trí (Cổ Cò và Vũng Ké) thuộc vịnh Vân Phong, huyện Vạn Ninh, tỉnh Khánh Hòa trong một giai đoạn thời gian nhất định, chưa mở rộng so sánh biến động hệ vi sinh vật theo các mùa sinh trưởng khác nhau trong năm hoặc đối chiếu với các vùng nuôi trồng rong sụn trọng điểm khác ở Nam Trung Bộ (như Ninh Thuận, Phú Yên).
  • Nghiên cứu hóa học chuyên sâu mới tập trung vào chủng vi nấm Aspergillus micronesiensis, các chủng vi khuẩn hoạt tính cao thuộc chi Bacillus, Brevibacillus, Pseudomonas mới dừng lại ở mức độ đánh giá hoạt tính của cặn chiết thô mà chưa phân lập triệt để từng đơn chất.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Mở rộng ứng dụng công nghệ Shotgun Metagenomics và Functional Metagenomics nhằm giải mã toàn bộ các cụm gen sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp (BGCs - Biosynthetic Gene Clusters) chưa nuôi cấy được trên rong biển.
  • Khảo sát độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và cơ chế ức chế chọn lọc tế bào ung thư in vivo đối với 3 hợp chất mới Aspersiensis A, B, C.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên ngành có giá trị thực tiễn và học thuật cho nhiều đối tượng:

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Hóa sinh học, Vi sinh vật học: Tham khảo quy trình tích hợp giữa kỹ thuật sinh học phân tử (16S rRNA, ITS, Metagenomics) với phương pháp phân lập vi sinh vật biển truyền thống; phương pháp xử lý dữ liệu tin sinh học OTU, phân tích đa dạng sinh thái học vi sinh vật.
• Nhà nghiên cứu ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Hóa dược: Tham khảo chi tiết phương pháp quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa lên men rắn (Design-Expert 7), quy trình sắc ký phân lập đa cấp và kỹ thuật giải mã cấu trúc phân tử phức tạp bằng phổ 1D/2D NMR kết hợp khối phổ HR-ESI-MS và tính toán phổ lưỡng sắc tròn ECD/TD-DFT.
• Cơ sở đào tạo và viện nghiên cứu biển: Cung cấp nguồn tư liệu thực nghiệm về hệ sinh thái vi sinh vật biển vùng Nam Trung Bộ Việt Nam, phục vụ công tác bảo tồn, khai thác bền vững tài nguyên sinh vật biển và định hướng tìm kiếm các hoạt chất kháng sinh, kháng ung thư thế hệ mới.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu sinh phải kết hợp đồng thời phương pháp Metagenomics và phương pháp nuôi cấy truyền thống?

Hơn 99% vi sinh vật trong tự nhiên không thể nuôi cấy bằng các môi trường nhân tạo trong phòng thí nghiệm. Phương pháp metagenomics (metabarcoding) phân tích trực tiếp DNA tổng số giúp giải mã toàn diện cấu trúc quần thể, sự phong phú loài và các nhóm vi sinh vật chiếm ưu thế mà nuôi cấy bị bỏ sót. Ngược lại, phương pháp nuôi cấy truyền thống là điều kiện bắt buộc để thu nhận sinh khối sống, từ đó tiến hành lên men, tinh sạch và phân lập các hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học cụ thể.

2. Ba hợp chất mới được phát hiện trong luận án có tên là gì và được phân lập từ đối tượng nào?

Ba hợp chất mới hoàn toàn được phát hiện và công bố lần đầu tiên trong luận án là: Aspersiensis A (ký hiệu mẫu AM8A1), Aspersiensis B (AM8B1) và Aspersiensis C (AM8B2). Cả ba hợp chất này được phân lập và tinh sạch từ dịch lên men rắn của chủng vi nấm Aspergillus micronesiensis VPN1 sống liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii thu thập tại vịnh Vân Phong, Khánh Hòa.

3. Phương pháp nào được sử dụng để tối ưu hóa điều kiện lên men cho chủng nấm Aspergillus micronesiensis?

Tác giả sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm kết hợp phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) thông qua phần mềm chuyên dụng Design-Expert 7. Ba yếu tố công nghệ được khảo sát và tối ưu hóa bao gồm: thời gian lên men (ngày), nồng độ muối biển (%) và pH ban đầu của môi trường lên men rắn RYE.

4. Những kỹ thuật phổ nghiệm nào đã được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học và cấu hình tuyệt đối của các hợp chất phân lập?

Tác giả đã phối hợp đồng bộ các kỹ thuật phân tích cấu trúc hiện đại:

• Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS (Agilent 6530 Q-TOF) để xác định khối lượng phân tử chính xác và công thức phân tử.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR (Bruker AM500 FT-NMR), bao gồm phổ proton ($^1\text{H}$), carbon ($^{13}\text{C}$), DEPT, $^1\text{H}-^1\text{H}\text{ COSY}$, HSQC, HMBC và NOESY để xác định khung cấu trúc phẳng và tương tác không gian.
• Phổ lưỡng sắc tròn điện tử (CD/ECD) trên máy Chirascan kết hợp mô phỏng hóa học tính toán lượng tử TD-DFT và phân cực kế JASCO P-2000 (đo độ quay cực) để xác định cấu hình lập thể tuyệt đối của các chất mới.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Đình Luyện là một công trình nghiên cứu hoàn chỉnh, phản ánh quy trình nghiên cứu logic từ sinh thái học phân tử vi sinh vật đến hóa học các hợp chất thiên nhiên biển. Bằng việc kết hợp kỹ thuật metagenomics tiên tiến với nuôi cấy truyền thống, luận án đã làm sáng tỏ cấu trúc quần thể vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii tại vịnh Vân Phong, Khánh Hòa. Công trình đã tối ưu hóa thành công quy trình lên men rắn chủng nấm Aspergillus micronesiensis, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 10 hợp chất tự nhiên, trong đó có 03 hợp chất cấu trúc mới (Aspersiensis A, B, C) sở hữu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và gây độc tế bào ung thư người chọn lọc. Kết quả của luận án đóng góp cơ sở khoa học quan trọng cho việc khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật biển Việt Nam phục vụ nghiên cứu và phát triển dược phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Rong biển là nơi cư trú của nhiều loài sinh vật như vi khuẩn, vi nấm, vi tảo, ấu trùng giáp xác, virus, trong đó vi khuẩn chiếm chủ yếu, với mật độ 102-107 CFU/cm2 mẫu, với vi nấm khoảng 104 CFU/cm2. Vi sinh vật có thể sống trên bề mặt rong (vsv bám), hoặc sống trong các mô rong (VSV nội sinh). Các vi sinh vật đó có vai trò khác nhau và có liên quan đến sức khỏe cây rong. Chúng có thể hỗ sinh, hoại sinh, gây bệnh hoặc ôn hòa.

Bề mặt rong là nơi có tính cạnh tranh cao (không gian, thức ăn), khắc nghiệt (do vsv tiết chất kháng lại vi sinh hoặc do cây chủ tự sản xuất chất tiêu diệt vsv có hại) nên các vi sinh trên rong có tính đặc thù nhất định và có cơ chế đặc biệt mới tồn tại được. Sự đa dạng vsv trên một loài rong nhất định phụ thuộc vào nhiều yếu tố (mùa trong năm, nhiệt độ, môi trường biển. Như vậy có thể thấy rong là nguồn để phân lập nhiều vi sinh vật mới. Mối quan hệ giữa vi sinh vật và cây rong chủ đã được xác định.

Một loạt các đặc điểm vật lý, hóa học, sinh học trên bề mặt rong được cho là có vai trò quan trọng đến số lượng cũng như thành phần vi sinh vật trên rong. Các tác nhân như dịch tiết của rong, oxi từ rong, CO2, dịch tiết vi sinh vật, có tính chất quyết định đến số lượng quần thể sống trên rong. Rong cung cấp oxi và các chất hữu cơ, cho vi sinh vật sinh sống. Trong khi đó, vi sinh vật cung cấp trở lại CO2, chất khoáng và các chất trao đổi thứ cấp có khả năng bảo vệ rong khỏi các sinh vật gây thối, gây bệnh cho rong, các chất kích thích sinh trưởng (auxin.

Như một số vi sinh vật cố định đạm (Agrobacterium và Rhizobium) cung cấp nguồn nitơ cho rong chủ. Vi sinh vật sản xuất chất xua đuổi các động vật ăn rong và các enzyme (peroxidase, catalase) làm trung hòa các gốc tự do (ROS) do rong tạo ra, làm giảm thiệt hại cho rong. Các chất hữu cơ, chất trao đổi thứ cấp ở rong cũng có tác dụng lựa chọn các loài vsv nhất định sống trên chúng, đảm bảo lợi ích cho rong. Một số vi khuẩn oxi hóa amonium được phát hiện trên rong với số lượng tương đối nhiều, có vai trò giải độc nitrat cho rong.

Như vậy có thể thấy mối quan hệ hỗ sinh giữa rong và vi sinh vật thể hiện ở chỗ rong cung cấp các chất dinh dưỡng hữu cơ cho vi khuẩn có lợi, mặt khác, vi khuẩn sản xuất chất kháng sinh tiêu diệt hoặc làm giảm sự cố định của các vi khuẩn có hại, gây bệnh cho rong chủ. Theo nhiều công bố, có từ 30-50% vi khuẩn trên rong có khả năng sản xuất chất đối kháng vi sinh vật, tỷ lệ này cao hơn rất nhiều so với tỉ lệ vi sinh vật sống tự do trong nước biển hoặc bùn đáy (<10%). 2 Ngoài vi khuẩn sống trên rong, nấm men và nấm mốc cũng thường được phân lập và nghiên cứu. Tuy mật độ nấm được cho là thấp hơn so với vi khuẩn, nhưng chúng cũng thể hiện sự đa dạng cao về loài.

Việt Nam là nước nhiệt đới, có nguồn tài nguyên sinh vật, đặc biệt vi sinh vật rất phong phú và đa dạng. Để sinh tồn, vi sinh vật có nhiều cơ chế sinh lý, sinh hóa khác nhau nhằm thích nghi với môi trường sống đặc biệt và khắc nghiệt. Sự cạnh tranh bằng việc sản xuất các chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt hợp chất đối kháng lại hoặc xua đuổi các vi sinh vật khác được coi là phổ biến và hiệu quả. Ở nước ta, chưa có nhiều các báo cáo, công bố nghiên cứu về hệ sinh thái vi sinh vật vùng trồng rong, trên cây rong.

Việc nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá các chủng vi sinh vật sống bám trên rong, từ đó đưa ra các biện pháp cần thiết và hữu ích nhằm bảo tồn phát triển hệ sinh thái rong biển bền vững, hiệu quả… Xuất phát từ thực tiễn trên, nhằm khảo sát đặc điểm, sự đa dạng các vi sinh vật và hoạt tính sinh học từ các vi sinh vật sống bám trên rong, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha trang, Khánh hòa, định hướng sử dụng trong y dược học”. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài: Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá sự đa dạng của vi sinh vật liên kết với rong Kappaphycus alvarezii theo phương pháp nuôi cấy được và không thông qua nuôi cấy metagennomic (nấm và vi khuẩn), phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất có hoạt tính sinh học (kháng sinh, gây độc tế bào, chống oxy hóa) từ chủng có hoạt tính sinh học cao. Nội dung nghiên cứu. Phân lập, sàng lọc một số chủng vi khuẩn và vi nấm có hoạt tính kháng sinh liên kết với rong Kappaphycus alvarezii ở vịnh Vân Phong Khánh Hòa.

Nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn và vi nấm trên rong biển bằng phương pháp sinh học phân tử (16S với vi khuẩn 18S với vi nấm) trên các mẫu thu thập. Lên men, đánh giá hoạt tính sinh học các chủng vi khuẩn và vi nấm sống liên kết với rong có hoạt tính sinh học tiêu biểu ở vịnh Vân Phong, Khánh Hòa. Nghiên cứu điều kiện lên men rắn thích hợp cho chủng vi nấm tiêu biểu tạo ra các chất có hoạt tính sinh học cao, tối ưu hóa quá trình lên men. Phân lập, tinh sạch, xác định cấu trúc hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học 3 của các hợp chất phân lập.

Những đóng góp mới của luận án: 1. Đây là công trình đầu tiên kết hợp sinh học phân tử hiện đại metagenomic với phương pháp nuôi cấy truyền thống để phân tích, so sánh và đánh giá sự đa dạng cũng như chức năng của VSV lên cây rong chủ (Kappaphycus alvarezii) ở Việt Nam. Đã đánh giá được sự đa dạng của quần thể vi khuẩn và vi nấm trên loài rong Kappaphycus alvarezii dựa vào phương pháp giải trình tự gen và phân tích metagenomics. Đã tách chiết và xác định được công thức hóa học của 10 hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus micronesiensis, có hoạt tính kháng sinh, hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa.

Trong 10 hợp chất phân lập được có 3 hợp chất mới là; Aspersiensis A (AM8A1): Aspersiensis B (AM8B1): Aspersiensis C (AM8B2) và 07 hợp chất AM3A1 (4-hydroxybenzaldehyde), AM3D: (22E,24R)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22- dien-3β-ol), AM4F1: 2-O-methylbutyrolactone II, AM6E1: 1,3-dihydro-4,5,6- trihydroxy-7-methylisobenzofuran, AM6E2: Epicoccone B (5,6,7-trihydroxy-4-methyl- 1(3H)-isobenzofuranone), AM7H: epicoccolides B, AM8D: epicoccolide A. Các hợp chất này là lần đầu tiên được phân lập từ chủng nấm Aspergillus micronesiensis liên kết với rong Kapapphycus alvarezii. Tổng quan về rong biển trên thế giới. Rong biển là đối tượng nuôi trồng thủy sản quan trọng được trồng rộng rãi trên thế giới.

Theo tài liệu của FAO (2014), rong biển được trồng ở 33 quốc gia và lục địa trên thế giới. Các quốc gia trồng rong biển trọng điểm của thế giới chủ yếu tập trung ở châu Á bao gồm Trung Quốc, Indonesia, Philippine, Malaysia, Hàn Quốc, Nhật Bản, Tanzania và Solomon. Đặc biệt làTrung Quốc và Indonesia là hai quốc gia trồng rong biển nhiều nhất, chiếm 81,4% tổng sản lượng rong biển thế giới [2]. Sản lượng rong biển nuôi trồng thế giới trên liên tục tăng, đặc biệt là những thập kỷ gần đây.

Năm 1990, sản lượng rong biển nuôi trồng cả thế giới khoảng 3,76 triệu tấn tươi. Đến năm 2000, sản lượng này là 9,3 triệu tấn tươi và tăng lên 19 triệu tấn vào năm 2010. Như vậy, chỉ trong vòng 2 thập kỷ (1990-2010), sản lượng rong biển nuôi trồng trên thế giới đã tăng khoảng 5 lần. Gần đây, năm 2012, sản lượng rong biển trồng trên thế giới là 23,8 triệu tấn tươi.

Rong biển khai thác tự nhiên có sản lượng là 1,1 triệu tấn tươi tương đương 4,6% sản lượng rong trồng thương phẩm (FAO, 2014). Trong những năm tới, sản lượng rong biển nuôi trồng dự báo sẽ tiếp tục tăng lên để đáp ứng nhu cầu nguyên liệu cho phát triển công nghiệp sản xuất hàng hóa và cả thiện chất lượng môi trường [3, 4]. Bên cạnh các nước có nghề trồng rong phát triển như Trung Quốc, Nhật Bản, Philippin, Hàn quốc, Triều Tiên, Chile, Malaysia, Tanzania, Indonesia, Kiribati, hiện nay nghề trồng rong đã phát triển tại hơn 20 nước khác. Sản lượng rong hàng năm trên thế giới là hơn 140.

Mặc dù rong biển thế giới rất đa dạng (có tới 10.000 loài đã được phân loại (www.org), nhưng số rong biển có thể nuôi trồng khá khiêm tốn. Theo Titlyanov và Titlyanova (2010), có 17 chi rong biển đang được nuôi trồng trên thế giới bao gồm: Agardhiella, Eucheuma, Gelidium, Gigartina, Gracilaria, Hydropuntia, Hypnea, Kappaphycus, Meristotheca, Porphyra (ngành rong đỏ- Rhodophyta); Saccharina, Laminaria, Undaria, Cladosiphon (ngành rong nâu- Phaeophyta), Monostroma, Ulva, và Caulerpa (ngành rong lục- Chlorophyta). Trong đó, các chi Agardhiella, Gelidium, Gigartina, Porphyra, Saccharina, Laminaria, Undaria, Monostroma, và Ulva được trồng chủ yếu ở vùng ôn đới, Eucheuma, Gracilaria, 5 Hydropuntia, Hypnea, Kappaphycus, Cladosiphon, và Caulerpa được trồng chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Theo thống kê của FAO (2014), năm nhóm rong biển trồng phổ biến nhất hiện nay là rong sụn Kappaphycus alvarezii và Eucheuma spp., rong bẹ Nhật Bản (Laminaria japonica), rong câu (Gracillaria spp.), rong bẹ Udaria pinatifida và rong mứt (Porphyra spp.

Trong các nhóm này, nhóm rong sụn có sản lượng trồng nhiều nhất (khoảng 8,2 triệu tấn tươi chiếm 34,5% tổng sản lượng rong biển toàn cầu) sau đó là rong bẹ Nhật Bản và rong câu với sản lượng lần lượt là 5,8 và 2,85 triệu tấn tương đương 24,4% và 12% tổng sản lượng rong biển toàn cầu 1. Tình hình rong biển ở Việt nam Với chiều dài hơn 3.260 km, diện tích hơn một triệu km2, vùng biển nước ta được đánh giá là một trong 16 trung tâm đa dạng sinh học cao của thế giới. Vì vậy, công tác điều tra, nghiên cứu môi trường và tài nguyên sinh vật biển là vấn đề cần được quan tâm nhiều. Việt Nam có lợi thế và tiềm năng to lớn (gần 100 loài rong kinh tế phân bố và diện tích trồng rong tiềm năng khoảng 900.000 ha) để phát triển rong biển thành ngành sản xuất chủ lực trong tương lai.

Hiện nay, 07 loài rong kinh tế (Rong nho - Caulerpa lentillifera, Rong câu chỉ vàng - Gracilaria tenuistipitata, Rong câu thắt - Gracilaria firma, Rong câu cước - Gracilariopsis bailinae, Rong sụn - Kappaphycus alvarezii, Rong bắp sú - Kappaphycus striatus, Rong sụn gai - Eucheuma denticulatum) đang được trồng phổ biến ở Việt Nam. Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản năm 2022, hiện diện tích tiềm năng trồng rong sụn cả nước khoảng 900 nghìn ha (tương đương 600 - 700 nghìn tấn rong khô/năm).