Nghiên Cứu Phân Lập Vi Khuẩn Sợi Từ Biển Hà Tiên Và Hợp Chất Kháng Vi Sinh Vật

LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT

ABSTRACT

LỜI CAM ĐOAN

DANH SÁCH BẢNG

DANH SÁCH HÌNH

TỪ VIẾT TẮT

1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1. Mục tiêu đề tài

1.2. Mục tiêu tổng quát

1.3. Mục tiêu cụ thể

1.4. Đối tượng nghiên cứu

1.5. Phạm vi nghiên cứu

1.6. Nội dung nghiên cứu

1.7. Đóng góp mới của luận án

1.8. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

1.8.1. Ý nghĩa khoa học

1.8.2. Ý nghĩa thực tiễn

2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Phân loại khoa học và phân bố

2.2. Đặc điểm cấu tạo

2.3. Đặc điểm sinh sản, sinh trưởng và phát triển của hải miên

2.3.1. Sự sinh sản vô tính

2.3.2. Sự sinh sản hữu tính

2.4. Đa dạng VSV sống cùng với hải miên

2.4.1. Vi khuẩn liên kết với hải miên

2.4.2. Nấm và tảo liên kết với hải miên

2.4.3. VKS liên kết với hải miên

2.4.4. Cổ vi khuẩn (Archaea) liên kết với hải miên

2.5. Vi khuẩn sợi (xạ khuẩn) (Actinobacteria)

2.5.1. Phân bố của VKS trong tự nhiên

2.5.2. Đặc điểm sinh học của VKS

2.5.3. Sự hình thành của bào tử VKS

2.5.4. Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận kháng sinh ở VKS

2.6. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ VKS

2.6.1. Khái quát về các con đường sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học

2.6.2. Phân loại các kháng sinh từ VKS

2.6.3. Những hợp chất có hoạt tính sinh học hình thành từ VKS

2.6.4. Một số nhóm chất có hoạt tính kháng khuẩn tiêu biểu từ VKS Streptomyces sp. có nguồn gốc từ biển

2.7. Một số VSV gây bệnh

2.7.1. Vi khuẩn Bacillus cereus

2.7.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus

2.7.3. Vi khuẩn Escherichia coli

2.7.4. Vi khuẩn Salmonella

2.7.5. Nấm Candida albicans

2.8. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.2. Phương tiện nghiên cứu

3.2.1. Nguyên vật liệu

3.2.2. Thiết bị - dụng cụ

3.2.3. Hóa chất - môi trường

3.3. Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Thu thập và xử lý mẫu

3.3.2. Phân lập và nuôi cấy VKS

3.3.2.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.3.2.2. Sơ đồ quy trình phân lập VKS từ hải miên

3.3.2.3. Các bước tiến hành thí nghiệm

3.4. Các chỉ tiêu theo dõi

3.5. Đánh giá khả năng kháng khuẩn

3.5.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.5.2. Sơ đồ quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn

3.5.3. Các bước tiến hành thí nghiệm

3.5.4. Chỉ tiêu theo dõi

3.6. Phân tích kết quả

3.7. Nhận diện VKS bằng phương pháp sinh học phân tử

3.7.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.7.2. Các bước tiến hành thí nghiệm

3.7.3. Phân tích kết quả

3.8. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS

3.8.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.8.2. Các bước tiến hành thí nghiệm

3.8.3. Phân tích kết quả

3.9. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ VKS tiềm năng được tuyển chọn

3.9.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.9.2. Chuẩn bị dịch nuôi cấy VKS

3.9.3. Chiết tách các chất từ dịch nuôi cấy VKS với ethyl acetate

3.9.4. Phương pháp sắc ký cột

3.9.5. Xác định cấu trúc hóa học bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

3.9.6. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC -MS)

4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Các dòng VKS phân lập được từ hải miên

4.1.1. Số lượng, nguồn gốc các dòng VKS phân lập được

4.1.2. Đặc điểm các dòng VKS phân lập được

4.1.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng VKS phân lập được

4.1.2.2. Đặc điểm tế bào của các dòng VKS phân lập được

4.2. Khả năng kháng khuẩn của các dòng VKS phân lập được

4.3. Tuyển chọn và định danh các dòng VKS phân lập được

4.4. Nhận diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS ở các dòng VKS

4.5. Chất kháng khuẩn được sinh ra từ VKS

4.5.1. Chất kháng khuẩn từ S

4.5.1.1. Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

4.5.1.2. Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC-MS)

4.5.2. Chất kháng khuẩn từ M

5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phụ lục 1: Một số hình của thí nghiệm

1. Hình ảnh thu mẫu hải miên

2. Hình một số mẫu hải miên thu tại các địa điểm

Phụ lục 2: Ký hiệu, nguồn gốc các dòng VKS phân lập

Phụ lục 3: Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của các dòng VKS

Phụ lục 4: Kết quả đo vòng kháng khuẩn của các dòng VKS đối với các VSV thử nghiệm (mm)

Phụ lục 5: Kết quả định danh 23 VKS tuyển chọn

5.1. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp ix mồi SC-Act-0235-aS-20 và SC-Act-0878-aA-19 của 23 dòng VKS tuyển chọn

5.2. Trình tự đoạn gen và kết quả so sánh với dữ liệu ngân hàng gen của 23 dòng VKS được tuyển chọn

5.3. Kết quả định danh của 23 dòng VKS tuyển chọn

Phụ lục 6: Kết quả khảo sát sự hiện diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS ở 23 dòng VKS tuyển chọn

6.1. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi A3F/A7R nhân bản cho gen NRPS (700–800 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn

6.2. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi K1F/M6R nhân bản cho gen PKS-I (1.400 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn

6.3. Phổ điện di trên gel aga rose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi KSαF/KSαR nhân bản cho gen PKS-II (600 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn

Phụ lục 7: Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của chất được tinh sạnh từ S

7.1. Phổ MS của hợp chất ND1.7a

7.2. Phổ proton của hợp chất ND1.7a

7.3. Phổ carbon 13 của hợp chất ND1.7a

7.4. Phổ DEPT của hợp chất ND1.7a

7.5. Phổ HSQC của hợp chất ND1.7a

7.6. Phổ HMBC của hợp chất ND1.7a

Phụ lục 8 : Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC -MS) các chất chiết xuất từ dòng VKS S

8.1. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS S.7a phân đoạn hexane -acetone

8.2. Phổ MS hợp chất 2 -Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl ở phút 4,64

8.3. Phổ MS hợp chất cyclohexasiloxane, dodecamethyl ở phút 13,15

8.4. Phổ MS hợp chất cycloheptasiloxane, tetradecamethyl ở phút

8.5. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS S.7a phân đoạn acetone -methanol

8.6. Phổ MS hợp chất oxime-, methoxy-phenyl ở phút 5,09

8.7. Phổ MS hợp chất hexanedioic acid, bis(2-ethylhexyl) ester ở phút 30,82

8.8. Phổ MS hợp chất diisooctyl phthalate ở phút 33,07

Phụ lục 9 : Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC -MS) các chất chiết xuất từ dòng VKS M

9.1. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M

9.2. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M

9.3. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M

9.4. Phổ GC-MS của dung môi acetone

9.5. Bảng tổng hợp kết quả giải phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M

Phụ lục 10: Kết quả phân tích thống kê

10.1. Kết quả phân tích thống kê khả năng kháng của các dòng VKS phân lập với các VSV thử nghiệm

10.2. Kết quả phân tích thống kê khả năng kháng của 23 dòng VKS được tuyển chọn với các VSV thử nghiệm

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Phân Lập Vi Khuẩn Sợi Biển Hà Tiên

Nghiên cứu về phân lập vi khuẩn sợi biển từ các mẫu hải miên tại vùng biển Hà Tiên mở ra một hướng đi đầy tiềm năng trong việc khám phá các nguồn vi sinh vật biển có khả năng sản xuất các hợp chất kháng sinh tự nhiên. Vùng biển Hà Tiên với đa dạng sinh học biển phong phú là một điểm nóng để tìm kiếm các chủng vi khuẩn sợi biển độc đáo. Các vi khuẩn sợi này có thể chứa các gen mã hóa cho các enzyme và con đường trao đổi chất đặc biệt, cho phép chúng tạo ra các hợp chất kháng vi sinh vật mới lạ. Việc nghiên cứu này không chỉ góp phần vào việc bảo tồn đa dạng sinh học biển mà còn có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các dược phẩm sinh học biển tiềm năng, đặc biệt trong bối cảnh kháng kháng sinh ngày càng gia tăng.

1.1. Giới thiệu về vi khuẩn sợi Actinobacteria biển

Vi khuẩn sợi (Actinobacteria) là một nhóm vi khuẩn Gram dương quan trọng, được biết đến với khả năng sản xuất một loạt các hợp chất có hoạt tính sinh học. Trong môi trường biển, vi khuẩn sợi đóng vai trò quan trọng trong chu trình dinh dưỡng và có thể cộng sinh với nhiều sinh vật biển khác nhau, bao gồm cả hải miên. Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn sợi từ biển có tiềm năng lớn trong việc phát triển các hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm, và kháng virus mới. Theo tài liệu, nghiên cứu này là công trình đầu tiên về vi khuẩn sợi trong hải miên ở vùng biển Hà Tiên.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu hợp chất kháng sinh tự nhiên

Sự gia tăng kháng kháng sinh là một vấn đề sức khỏe toàn cầu nghiêm trọng. Việc tìm kiếm các hợp chất kháng sinh tự nhiên mới từ các nguồn vi sinh vật biển là vô cùng cần thiết. Vi khuẩn sợi biển là một nguồn tiềm năng để phát hiện ra các hợp chất kháng vi sinh vật mới, có thể giúp chống lại các vi khuẩn gây bệnh đã kháng thuốc. Các hợp chất này có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới, giúp bảo vệ sức khỏe con người và giải quyết vấn đề an toàn thực phẩm.

II. Thách Thức Phân Lập Vi Khuẩn Sợi Kháng Sinh Từ Biển Hà Tiên

Việc phân lập vi khuẩn sợi từ môi trường biển, đặc biệt là từ các sinh vật cộng sinh như hải miên, đặt ra nhiều thách thức. Các vi khuẩn sợi thường có số lượng ít và phân bố không đồng đều trong mẫu vật. Quá trình nuôi cấy vi khuẩn cũng đòi hỏi các điều kiện đặc biệt để đảm bảo sự phát triển của chúng. Hơn nữa, việc sàng lọc hợp chất kháng khuẩn từ các chủng vi khuẩn sợi phân lập được là một quá trình tốn thời gian và công sức. Cần có các phương pháp phân tích di truyền vi khuẩn và phân tích hóa sinh hiện đại để xác định và đánh giá tiềm năng của các chủng vi khuẩn sợi này.

2.1. Khó khăn trong việc nuôi cấy và phân lập vi khuẩn sợi

Vi khuẩn sợi thường phát triển chậm và đòi hỏi các điều kiện nuôi cấy vi khuẩn đặc biệt. Việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong mẫu vật cũng là một thách thức lớn. Cần có các kỹ thuật phân lập vi khuẩn tiên tiến để thu được các chủng vi khuẩn sợi thuần khiết. Các phương pháp phân lập DNA vi khuẩn và giải trình tự gen cũng cần được tối ưu hóa để xác định chính xác các chủng vi khuẩn sợi phân lập được.

2.2. Thách thức trong sàng lọc hợp chất kháng khuẩn tiềm năng

Việc sàng lọc hợp chất kháng khuẩn từ các chủng vi khuẩn sợi đòi hỏi các phương pháp hóa sinh và sinh học phân tử phức tạp. Cần có các hệ thống thử nghiệm hiệu quả để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất được sản xuất bởi vi khuẩn sợi. Việc chiết xuất hợp chất và phân tích cấu trúc cũng là những thách thức lớn trong quá trình này. Theo tài liệu, cần phân tích và xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học.

III. Phương Pháp Phân Lập Vi Khuẩn Sợi Biển Hà Tiên Hiệu Quả

Nghiên cứu này sử dụng một quy trình phân lập vi khuẩn sợi từ hải miên vùng biển Hà Tiên bao gồm các bước thu thập mẫu, xử lý mẫu, nuôi cấy vi khuẩn, và sàng lọc hợp chất kháng khuẩn. Các mẫu hải miên được thu thập từ các địa điểm khác nhau ở Hà Tiên và được xử lý để loại bỏ các tạp chất. Sau đó, các mẫu được nuôi cấy trên các môi trường đặc biệt để kích thích sự phát triển của vi khuẩn sợi. Các chủng vi khuẩn sợi phân lập được sau đó được sàng lọc để tìm ra các chủng có khả năng sản xuất các hợp chất kháng vi sinh vật.

3.1. Quy trình thu thập và xử lý mẫu hải miên

Việc thu thập mẫu hải miên cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo tính đại diện và tránh ô nhiễm. Các mẫu nên được thu thập từ nhiều địa điểm khác nhau và được bảo quản đúng cách để duy trì đa dạng sinh học. Quá trình xử lý mẫu cần loại bỏ các tạp chất mà không làm ảnh hưởng đến sự sống của vi khuẩn sợi. Theo tài liệu, mẫu được thu thập và xử lý để phân lập và nuôi cấy VKS.

3.2. Kỹ thuật nuôi cấy và sàng lọc vi khuẩn sợi kháng khuẩn

Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy vi khuẩn phù hợp là rất quan trọng để kích thích sự phát triển của vi khuẩn sợi. Các môi trường này thường chứa các nguồn carbon và nitrogen đặc biệt, cũng như các yếu tố vi lượng cần thiết. Quá trình sàng lọc nên sử dụng các chủng vi sinh vật thử nghiệm khác nhau để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn sợi. Theo tài liệu, cần đánh giá khả năng kháng khuẩn.

3.3. Phương pháp định danh vi khuẩn sợi bằng sinh học phân tử

Để xác định chính xác các chủng vi khuẩn sợi phân lập được, các phương pháp sinh học phân tử như phân tích di truyền vi khuẩn và giải trình tự gen là cần thiết. Các gen đặc trưng cho vi khuẩn sợi, chẳng hạn như gen 16S rRNA, có thể được sử dụng để định danh vi khuẩn. Các phương pháp PCR và giải trình tự gen cho phép xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các chủng vi khuẩn sợi khác nhau. Theo tài liệu, cần nhận diện VKS bằng phương pháp sinh học phân tử.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Hợp Chất Kháng Khuẩn Từ Vi Khuẩn Sợi

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và tuyển chọn được nhiều chủng vi khuẩn sợi từ hải miên vùng biển Hà Tiên có khả năng sản xuất các hợp chất kháng vi sinh vật. Các hợp chất này có hoạt tính kháng khuẩn đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh, bao gồm cả các chủng đã kháng kháng sinh. Việc xác định và phân tích cấu trúc của các hợp chất này mở ra tiềm năng phát triển các loại thuốc mới để chống lại các bệnh nhiễm trùng.

4.1. Phân tích hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn sợi

Các chủng vi khuẩn sợi phân lập được đã được thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Kết quả cho thấy nhiều chủng có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn này. Mức độ kháng khuẩn khác nhau giữa các chủng, cho thấy sự đa dạng về hợp chất kháng khuẩn được sản xuất. Theo tài liệu, kết quả nghiên cứu đã phân lập được 198 dòng VKS từ hải miên, trong đó 130/198 dòng có khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài vi sinh vật (VSV) được thử nghiệm.

4.2. Xác định và phân tích cấu trúc các hợp chất kháng khuẩn

Các hợp chất kháng khuẩn được sản xuất bởi các chủng vi khuẩn sợi tiềm năng đã được chiết xuất và phân tích cấu trúc bằng các phương pháp hóa học và sinh học phân tử. Các phương pháp sắc ký và khối phổ đã được sử dụng để xác định các thành phần của các hợp chất. Việc xác định cấu trúc của các hợp chất này là bước quan trọng để hiểu rõ cơ chế hoạt động của chúng và phát triển các loại thuốc mới. Theo tài liệu, cần xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ VKS tiềm năng.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Hợp Chất Kháng Khuẩn Từ Biển Hà Tiên

Các hợp chất kháng khuẩn được phát hiện từ vi khuẩn sợi biển vùng Hà Tiên có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Trong lĩnh vực y tế, chúng có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới chống lại các bệnh nhiễm trùng. Trong lĩnh vực nông nghiệp, chúng có thể được sử dụng để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn gây ra trên cây trồng. Trong lĩnh vực công nghiệp, chúng có thể được sử dụng để bảo quản thực phẩm và ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn gây hại.

5.1. Tiềm năng phát triển dược phẩm sinh học từ vi khuẩn sợi biển

Các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn sợi biển có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới chống lại các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng kháng sinh. Các loại thuốc này có thể có cơ chế hoạt động khác biệt so với các loại thuốc hiện có, giúp vượt qua tình trạng kháng thuốc. Việc phát triển các dược phẩm sinh học biển là một hướng đi đầy hứa hẹn để giải quyết vấn đề kháng kháng sinh. Theo tài liệu, các kết quả của đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra loại dược phẩm mới sản xuất từ các VSV cộng sinh với hải miên góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người.

5.2. Ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm

Các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn sợi biển có thể được sử dụng để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn gây ra trên cây trồng, giúp giảm sự phụ thuộc vào các loại thuốc trừ sâu hóa học. Trong công nghiệp thực phẩm, chúng có thể được sử dụng để bảo quản thực phẩm và ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn gây hại, giúp kéo dài thời gian bảo quản và đảm bảo an toàn thực phẩm. Các ứng dụng này có thể góp phần vào sự phát triển nông nghiệp và công nghiệp bền vững.

VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Vi Khuẩn Sợi Biển Tương Lai

Nghiên cứu về phân lập vi khuẩn sợi biển từ hải miên vùng biển Hà Tiên đã mang lại những kết quả đầy hứa hẹn. Việc phát hiện ra các chủng vi khuẩn sợi có khả năng sản xuất các hợp chất kháng vi sinh vật mở ra tiềm năng phát triển các loại thuốc mới và các ứng dụng khác trong nhiều lĩnh vực. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc phân tích sâu hơn cơ chế hoạt động của các hợp chất kháng khuẩn và đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chúng trong các thử nghiệm lâm sàng.

6.1. Tóm tắt kết quả và ý nghĩa của nghiên cứu

6.2. Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo về vi khuẩn sợi biển

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc phân tích sâu hơn cơ chế hoạt động của các hợp chất kháng khuẩn và đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chúng trong các thử nghiệm lâm sàng. Cần có các nghiên cứu về sinh học phân tử và hóa sinh để hiểu rõ hơn về quá trình sản xuất các hợp chất này trong vi khuẩn sợi. Việc tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn và chiết xuất hợp chất cũng là một hướng đi quan trọng. Theo tài liệu, cần có cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra loại dược phẩm mới sản xuất từ các VSV cộng sinh với hải miên.

Phân Lập, Tuyển Chọn Vi Khuẩn Sợi (Actinobacteria) Từ Hải Miên Vùng Biển Hà Tiên