Phân Lập, Tuyển Chọn Vi Khuẩn Sợi (Actinobacteria) Từ Hải Miên Vùng Biển Hà Tiên

Luận án tiến sĩ kỹ thuật phân tích chuyên ngành công nghệ sinh học đề tài phân lập tuyển chọn vi khuẩn sợi actinobacteria từ hải miên, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực

• Tác giả: Trần Vũ Phương
• Người hướng dẫn: GS. Cao Ngọc Điệp
• Trường học: Trường Đại Học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Lập Vi Khuẩn Sợi Từ Biển Hà Tiên Và Hợp Chất Kháng Vi Sinh Vật
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Tiên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Mục tiêu đề tài
• 1.2. Mục tiêu tổng quát
• 1.3. Mục tiêu cụ thể
• 1.4. Đối tượng nghiên cứu
• 1.5. Phạm vi nghiên cứu
• 1.6. Nội dung nghiên cứu
• 1.7. Đóng góp mới của luận án
• 1.8. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
• 1.8.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.8.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Phân loại khoa học và phân bố
• 2.2. Đặc điểm cấu tạo
• 2.3. Đặc điểm sinh sản, sinh trưởng và phát triển của hải miên
• 2.3.1. Sự sinh sản vô tính
• 2.3.2. Sự sinh sản hữu tính
• 2.4. Đa dạng VSV sống cùng với hải miên
• 2.4.1. Vi khuẩn liên kết với hải miên
• 2.4.2. Nấm và tảo liên kết với hải miên
• 2.4.3. VKS liên kết với hải miên
• 2.4.4. Cổ vi khuẩn (Archaea) liên kết với hải miên
• 2.5. Vi khuẩn sợi (xạ khuẩn) (Actinobacteria)
• 2.5.1. Phân bố của VKS trong tự nhiên
• 2.5.2. Đặc điểm sinh học của VKS
• 2.5.3. Sự hình thành của bào tử VKS
• 2.5.4. Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận kháng sinh ở VKS
• 2.6. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ VKS
• 2.6.1. Khái quát về các con đường sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học
• 2.6.2. Phân loại các kháng sinh từ VKS
• 2.6.3. Những hợp chất có hoạt tính sinh học hình thành từ VKS
• 2.6.4. Một số nhóm chất có hoạt tính kháng khuẩn tiêu biểu từ VKS Streptomyces sp. có nguồn gốc từ biển
• 2.7. Một số VSV gây bệnh
• 2.7.1. Vi khuẩn Bacillus cereus
• 2.7.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
• 2.7.3. Vi khuẩn Escherichia coli
• 2.7.4. Vi khuẩn Salmonella
• 2.7.5. Nấm Candida albicans
• 2.8. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Phương tiện nghiên cứu
• 3.2.1. Nguyên vật liệu
• 3.2.2. Thiết bị - dụng cụ
• 3.2.3. Hóa chất - môi trường
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Thu thập và xử lý mẫu
• 3.3.2. Phân lập và nuôi cấy VKS
• 3.3.2.1. Mục tiêu thí nghiệm
• 3.3.2.2. Sơ đồ quy trình phân lập VKS từ hải miên
• 3.3.2.3. Các bước tiến hành thí nghiệm
• 3.4. Các chỉ tiêu theo dõi
• 3.5. Đánh giá khả năng kháng khuẩn
• 3.5.1. Mục tiêu thí nghiệm
• 3.5.2. Sơ đồ quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn
• 3.5.3. Các bước tiến hành thí nghiệm
• 3.5.4. Chỉ tiêu theo dõi
• 3.6. Phân tích kết quả
• 3.7. Nhận diện VKS bằng phương pháp sinh học phân tử
• 3.7.1. Mục tiêu thí nghiệm
• 3.7.2. Các bước tiến hành thí nghiệm
• 3.7.3. Phân tích kết quả
• 3.8. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS
• 3.8.1. Mục tiêu thí nghiệm
• 3.8.2. Các bước tiến hành thí nghiệm
• 3.8.3. Phân tích kết quả
• 3.9. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ VKS tiềm năng được tuyển chọn
• 3.9.1. Mục tiêu thí nghiệm
• 3.9.2. Chuẩn bị dịch nuôi cấy VKS
• 3.9.3. Chiết tách các chất từ dịch nuôi cấy VKS với ethyl acetate
• 3.9.4. Phương pháp sắc ký cột
• 3.9.5. Xác định cấu trúc hóa học bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
• 3.9.6. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC -MS)
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Các dòng VKS phân lập được từ hải miên
• 4.1.1. Số lượng, nguồn gốc các dòng VKS phân lập được
• 4.1.2. Đặc điểm các dòng VKS phân lập được
• 4.1.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng VKS phân lập được
• 4.1.2.2. Đặc điểm tế bào của các dòng VKS phân lập được
• 4.2. Khả năng kháng khuẩn của các dòng VKS phân lập được
• 4.3. Tuyển chọn và định danh các dòng VKS phân lập được
• 4.4. Nhận diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS ở các dòng VKS
• 4.5. Chất kháng khuẩn được sinh ra từ VKS
• 4.5.1. Chất kháng khuẩn từ S
• 4.5.1.1. Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
• 4.5.1.2. Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC-MS)
• 4.5.2. Chất kháng khuẩn từ M
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Phụ lục 1: Một số hình của thí nghiệm
• 1. Hình ảnh thu mẫu hải miên
• 2. Hình một số mẫu hải miên thu tại các địa điểm
• Phụ lục 2: Ký hiệu, nguồn gốc các dòng VKS phân lập
• Phụ lục 3: Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của các dòng VKS
• Phụ lục 4: Kết quả đo vòng kháng khuẩn của các dòng VKS đối với các VSV thử nghiệm (mm)
• Phụ lục 5: Kết quả định danh 23 VKS tuyển chọn
• 5.1. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp ix mồi SC-Act-0235-aS-20 và SC-Act-0878-aA-19 của 23 dòng VKS tuyển chọn
• 5.2. Trình tự đoạn gen và kết quả so sánh với dữ liệu ngân hàng gen của 23 dòng VKS được tuyển chọn
• 5.3. Kết quả định danh của 23 dòng VKS tuyển chọn
• Phụ lục 6: Kết quả khảo sát sự hiện diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS ở 23 dòng VKS tuyển chọn
• 6.1. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi A3F/A7R nhân bản cho gen NRPS (700–800 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn
• 6.2. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi K1F/M6R nhân bản cho gen PKS-I (1.400 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn
• 6.3. Phổ điện di trên gel aga rose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi KSαF/KSαR nhân bản cho gen PKS-II (600 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn
• Phụ lục 7: Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của chất được tinh sạnh từ S
• 7.1. Phổ MS của hợp chất ND1.7a
• 7.2. Phổ proton của hợp chất ND1.7a
• 7.3. Phổ carbon 13 của hợp chất ND1.7a
• 7.4. Phổ DEPT của hợp chất ND1.7a
• 7.5. Phổ HSQC của hợp chất ND1.7a
• 7.6. Phổ HMBC của hợp chất ND1.7a
• Phụ lục 8 : Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC -MS) các chất chiết xuất từ dòng VKS S
• 8.1. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS S.7a phân đoạn hexane -acetone
• 8.2. Phổ MS hợp chất 2 -Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl ở phút 4,64
• 8.3. Phổ MS hợp chất cyclohexasiloxane, dodecamethyl ở phút 13,15
• 8.4. Phổ MS hợp chất cycloheptasiloxane, tetradecamethyl ở phút
• 8.5. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS S.7a phân đoạn acetone -methanol
• 8.6. Phổ MS hợp chất oxime-, methoxy-phenyl ở phút 5,09
• 8.7. Phổ MS hợp chất hexanedioic acid, bis(2-ethylhexyl) ester ở phút 30,82
• 8.8. Phổ MS hợp chất diisooctyl phthalate ở phút 33,07
• Phụ lục 9 : Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC -MS) các chất chiết xuất từ dòng VKS M
• 9.1. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M
• 9.2. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M
• 9.3. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M
• 9.4. Phổ GC-MS của dung môi acetone
• 9.5. Bảng tổng hợp kết quả giải phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M
• Phụ lục 10: Kết quả phân tích thống kê
• 10.1. Kết quả phân tích thống kê khả năng kháng của các dòng VKS phân lập với các VSV thử nghiệm
• 10.2. Kết quả phân tích thống kê khả năng kháng của 23 dòng VKS được tuyển chọn với các VSV thử nghiệm

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Phân Lập Vi Khuẩn Sợi Biển Hà Tiên

Nghiên cứu về phân lập vi khuẩn sợi biển từ các mẫu hải miên tại vùng biển Hà Tiên mở ra một hướng đi đầy tiềm năng trong việc khám phá các nguồn vi sinh vật biển có khả năng sản xuất các hợp chất kháng sinh tự nhiên. Vùng biển Hà Tiên với đa dạng sinh học biển phong phú là một điểm nóng để tìm kiếm các chủng vi khuẩn sợi biển độc đáo. Các vi khuẩn sợi này có thể chứa các gen mã hóa cho các enzyme và con đường trao đổi chất đặc biệt, cho phép chúng tạo ra các hợp chất kháng vi sinh vật mới lạ. Việc nghiên cứu này không chỉ góp phần vào việc bảo tồn đa dạng sinh học biển mà còn có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các dược phẩm sinh học biển tiềm năng, đặc biệt trong bối cảnh kháng kháng sinh ngày càng gia tăng.

1.1. Giới thiệu về vi khuẩn sợi Actinobacteria biển

Vi khuẩn sợi (Actinobacteria) là một nhóm vi khuẩn Gram dương quan trọng, được biết đến với khả năng sản xuất một loạt các hợp chất có hoạt tính sinh học. Trong môi trường biển, vi khuẩn sợi đóng vai trò quan trọng trong chu trình dinh dưỡng và có thể cộng sinh với nhiều sinh vật biển khác nhau, bao gồm cả hải miên. Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn sợi từ biển có tiềm năng lớn trong việc phát triển các hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm, và kháng virus mới. Theo tài liệu, nghiên cứu này là công trình đầu tiên về vi khuẩn sợi trong hải miên ở vùng biển Hà Tiên.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu hợp chất kháng sinh tự nhiên

Sự gia tăng kháng kháng sinh là một vấn đề sức khỏe toàn cầu nghiêm trọng. Việc tìm kiếm các hợp chất kháng sinh tự nhiên mới từ các nguồn vi sinh vật biển là vô cùng cần thiết. Vi khuẩn sợi biển là một nguồn tiềm năng để phát hiện ra các hợp chất kháng vi sinh vật mới, có thể giúp chống lại các vi khuẩn gây bệnh đã kháng thuốc. Các hợp chất này có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới, giúp bảo vệ sức khỏe con người và giải quyết vấn đề an toàn thực phẩm.

II. Thách Thức Phân Lập Vi Khuẩn Sợi Kháng Sinh Từ Biển Hà Tiên

Việc phân lập vi khuẩn sợi từ môi trường biển, đặc biệt là từ các sinh vật cộng sinh như hải miên, đặt ra nhiều thách thức. Các vi khuẩn sợi thường có số lượng ít và phân bố không đồng đều trong mẫu vật. Quá trình nuôi cấy vi khuẩn cũng đòi hỏi các điều kiện đặc biệt để đảm bảo sự phát triển của chúng. Hơn nữa, việc sàng lọc hợp chất kháng khuẩn từ các chủng vi khuẩn sợi phân lập được là một quá trình tốn thời gian và công sức. Cần có các phương pháp phân tích di truyền vi khuẩn và phân tích hóa sinh hiện đại để xác định và đánh giá tiềm năng của các chủng vi khuẩn sợi này.

2.1. Khó khăn trong việc nuôi cấy và phân lập vi khuẩn sợi

Vi khuẩn sợi thường phát triển chậm và đòi hỏi các điều kiện nuôi cấy vi khuẩn đặc biệt. Việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong mẫu vật cũng là một thách thức lớn. Cần có các kỹ thuật phân lập vi khuẩn tiên tiến để thu được các chủng vi khuẩn sợi thuần khiết. Các phương pháp phân lập DNA vi khuẩn và giải trình tự gen cũng cần được tối ưu hóa để xác định chính xác các chủng vi khuẩn sợi phân lập được.

2.2. Thách thức trong sàng lọc hợp chất kháng khuẩn tiềm năng

Việc sàng lọc hợp chất kháng khuẩn từ các chủng vi khuẩn sợi đòi hỏi các phương pháp hóa sinh và sinh học phân tử phức tạp. Cần có các hệ thống thử nghiệm hiệu quả để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất được sản xuất bởi vi khuẩn sợi. Việc chiết xuất hợp chất và phân tích cấu trúc cũng là những thách thức lớn trong quá trình này. Theo tài liệu, cần phân tích và xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học.

III. Phương Pháp Phân Lập Vi Khuẩn Sợi Biển Hà Tiên Hiệu Quả

Nghiên cứu này sử dụng một quy trình phân lập vi khuẩn sợi từ hải miên vùng biển Hà Tiên bao gồm các bước thu thập mẫu, xử lý mẫu, nuôi cấy vi khuẩn, và sàng lọc hợp chất kháng khuẩn. Các mẫu hải miên được thu thập từ các địa điểm khác nhau ở Hà Tiên và được xử lý để loại bỏ các tạp chất. Sau đó, các mẫu được nuôi cấy trên các môi trường đặc biệt để kích thích sự phát triển của vi khuẩn sợi. Các chủng vi khuẩn sợi phân lập được sau đó được sàng lọc để tìm ra các chủng có khả năng sản xuất các hợp chất kháng vi sinh vật.

3.1. Quy trình thu thập và xử lý mẫu hải miên

Việc thu thập mẫu hải miên cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo tính đại diện và tránh ô nhiễm. Các mẫu nên được thu thập từ nhiều địa điểm khác nhau và được bảo quản đúng cách để duy trì đa dạng sinh học. Quá trình xử lý mẫu cần loại bỏ các tạp chất mà không làm ảnh hưởng đến sự sống của vi khuẩn sợi. Theo tài liệu, mẫu được thu thập và xử lý để phân lập và nuôi cấy VKS.

3.2. Kỹ thuật nuôi cấy và sàng lọc vi khuẩn sợi kháng khuẩn

Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy vi khuẩn phù hợp là rất quan trọng để kích thích sự phát triển của vi khuẩn sợi. Các môi trường này thường chứa các nguồn carbon và nitrogen đặc biệt, cũng như các yếu tố vi lượng cần thiết. Quá trình sàng lọc nên sử dụng các chủng vi sinh vật thử nghiệm khác nhau để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn sợi. Theo tài liệu, cần đánh giá khả năng kháng khuẩn.

3.3. Phương pháp định danh vi khuẩn sợi bằng sinh học phân tử

Để xác định chính xác các chủng vi khuẩn sợi phân lập được, các phương pháp sinh học phân tử như phân tích di truyền vi khuẩn và giải trình tự gen là cần thiết. Các gen đặc trưng cho vi khuẩn sợi, chẳng hạn như gen 16S rRNA, có thể được sử dụng để định danh vi khuẩn. Các phương pháp PCR và giải trình tự gen cho phép xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các chủng vi khuẩn sợi khác nhau. Theo tài liệu, cần nhận diện VKS bằng phương pháp sinh học phân tử.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Hợp Chất Kháng Khuẩn Từ Vi Khuẩn Sợi

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và tuyển chọn được nhiều chủng vi khuẩn sợi từ hải miên vùng biển Hà Tiên có khả năng sản xuất các hợp chất kháng vi sinh vật. Các hợp chất này có hoạt tính kháng khuẩn đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh, bao gồm cả các chủng đã kháng kháng sinh. Việc xác định và phân tích cấu trúc của các hợp chất này mở ra tiềm năng phát triển các loại thuốc mới để chống lại các bệnh nhiễm trùng.

4.1. Phân tích hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn sợi

Các chủng vi khuẩn sợi phân lập được đã được thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Kết quả cho thấy nhiều chủng có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn này. Mức độ kháng khuẩn khác nhau giữa các chủng, cho thấy sự đa dạng về hợp chất kháng khuẩn được sản xuất. Theo tài liệu, kết quả nghiên cứu đã phân lập được 198 dòng VKS từ hải miên, trong đó 130/198 dòng có khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài vi sinh vật (VSV) được thử nghiệm.

4.2. Xác định và phân tích cấu trúc các hợp chất kháng khuẩn

Các hợp chất kháng khuẩn được sản xuất bởi các chủng vi khuẩn sợi tiềm năng đã được chiết xuất và phân tích cấu trúc bằng các phương pháp hóa học và sinh học phân tử. Các phương pháp sắc ký và khối phổ đã được sử dụng để xác định các thành phần của các hợp chất. Việc xác định cấu trúc của các hợp chất này là bước quan trọng để hiểu rõ cơ chế hoạt động của chúng và phát triển các loại thuốc mới. Theo tài liệu, cần xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ VKS tiềm năng.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Hợp Chất Kháng Khuẩn Từ Biển Hà Tiên

Các hợp chất kháng khuẩn được phát hiện từ vi khuẩn sợi biển vùng Hà Tiên có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Trong lĩnh vực y tế, chúng có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới chống lại các bệnh nhiễm trùng. Trong lĩnh vực nông nghiệp, chúng có thể được sử dụng để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn gây ra trên cây trồng. Trong lĩnh vực công nghiệp, chúng có thể được sử dụng để bảo quản thực phẩm và ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn gây hại.

5.1. Tiềm năng phát triển dược phẩm sinh học từ vi khuẩn sợi biển

Các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn sợi biển có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới chống lại các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng kháng sinh. Các loại thuốc này có thể có cơ chế hoạt động khác biệt so với các loại thuốc hiện có, giúp vượt qua tình trạng kháng thuốc. Việc phát triển các dược phẩm sinh học biển là một hướng đi đầy hứa hẹn để giải quyết vấn đề kháng kháng sinh. Theo tài liệu, các kết quả của đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra loại dược phẩm mới sản xuất từ các VSV cộng sinh với hải miên góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người.

5.2. Ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm

Các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn sợi biển có thể được sử dụng để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn gây ra trên cây trồng, giúp giảm sự phụ thuộc vào các loại thuốc trừ sâu hóa học. Trong công nghiệp thực phẩm, chúng có thể được sử dụng để bảo quản thực phẩm và ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn gây hại, giúp kéo dài thời gian bảo quản và đảm bảo an toàn thực phẩm. Các ứng dụng này có thể góp phần vào sự phát triển nông nghiệp và công nghiệp bền vững.

VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Vi Khuẩn Sợi Biển Tương Lai

Nghiên cứu về phân lập vi khuẩn sợi biển từ hải miên vùng biển Hà Tiên đã mang lại những kết quả đầy hứa hẹn. Việc phát hiện ra các chủng vi khuẩn sợi có khả năng sản xuất các hợp chất kháng vi sinh vật mở ra tiềm năng phát triển các loại thuốc mới và các ứng dụng khác trong nhiều lĩnh vực. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc phân tích sâu hơn cơ chế hoạt động của các hợp chất kháng khuẩn và đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chúng trong các thử nghiệm lâm sàng.

6.1. Tóm tắt kết quả và ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và tuyển chọn được nhiều chủng vi khuẩn sợi từ hải miên vùng biển Hà Tiên có khả năng sản xuất các hợp chất kháng vi sinh vật. Các hợp chất này có hoạt tính kháng khuẩn đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh, bao gồm cả các chủng đã kháng kháng sinh. Việc xác định và phân tích cấu trúc của các hợp chất này mở ra tiềm năng phát triển các loại thuốc mới để chống lại các bệnh nhiễm trùng.

6.2. Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo về vi khuẩn sợi biển

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc phân tích sâu hơn cơ chế hoạt động của các hợp chất kháng khuẩn và đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chúng trong các thử nghiệm lâm sàng. Cần có các nghiên cứu về sinh học phân tử và hóa sinh để hiểu rõ hơn về quá trình sản xuất các hợp chất này trong vi khuẩn sợi. Việc tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn và chiết xuất hợp chất cũng là một hướng đi quan trọng. Theo tài liệu, cần có cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra loại dược phẩm mới sản xuất từ các VSV cộng sinh với hải miên.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tình trạng xuất hiện và lan rộng của các chủng vi sinh vật kháng thuốc đang trở thành thách thức nghiêm trọng đối với y học, thú y và bảo vệ thực vật. Việc lạm dụng kháng sinh đã dẫn đến sự gia tăng các ca nhiễm khuẩn khó điều trị như thương hàn, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng huyết và nhiễm trùng vết mổ. Trong khi khoảng 80% các loại kháng sinh hiện nay có nguồn gốc từ vi khuẩn sợi (Actinobacteria), phần lớn thuộc chi Streptomyces phân lập từ đất, thì khả năng tái phát hiện các hợp chất mới từ nguồn đất ngày càng bão hòa. Do đó, việc tìm kiếm các chủng vi khuẩn sợi từ các sinh cảnh đặc thù ở biển, đặc biệt là nhóm cộng sinh trong các sinh vật biển như hải miên (bọt biển), đang là hướng nghiên cứu được chú trọng. Hải miên là động vật thân lỗ không có hệ thống miễn dịch chuyên biệt, phải dựa vào các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do chính chúng hoặc vi sinh vật cộng sinh tạo ra để tự bảo vệ trước các tác nhân gây hại.

Tại Việt Nam, nguồn tài nguyên vi khuẩn sợi cộng sinh trong hải miên vẫn còn ít được công bố; nghiên cứu trước đó của Phạm Việt Cường và cộng sự (2014) chỉ mới khảo sát 11 chủng xạ khuẩn tại vùng biển Hải Vân – Sơn Chà. Vùng biển Hà Tiên với đặc điểm nước trong, nông, ấm, tiếp cận vịnh Thái Lan, sở hữu hệ sinh thái biển và quần thể hải miên phong phú nhưng chưa từng có công trình nào khảo sát hệ vi khuẩn sợi cộng sinh. Nhằm giải quyết khoảng trống này, luận án "Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh" của nghiên cứu sinh Trần Vũ Phương (chuyên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, năm 2022) đã được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định như sau:

1. Mục tiêu tổng quát: Phân lập và tuyển chọn được những dòng vi khuẩn sợi có khả năng sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao, đồng thời xác định được các hợp chất có hoạt tính sinh học, tạo nguồn vật liệu phục vụ cho nghiên cứu sản xuất các hợp chất ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm.
2. Mục tiêu cụ thể:
   • Phân lập được các dòng vi khuẩn sợi từ hải miên tại vùng biển Hà Tiên, đồng thời đánh giá khả năng kháng của các dòng vi khuẩn sợi này đối với các vi sinh vật thử nghiệm.
   • Tuyển chọn và định danh được các dòng vi khuẩn sợi có khả năng sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao, đồng thời đánh giá mối liên hệ di truyền và khảo sát sự hiện diện của các gen PKS-I, PKS-II và NRPS chỉ thị cho sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học của các dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn.
   • Tuyển chọn từ một đến hai dòng vi khuẩn sợi có tiềm năng nhất, có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính kháng được nhiều loại vi sinh vật với mức độ kháng cao, đồng thời xác định được các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ vi khuẩn sợi tuyển chọn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các dòng vi khuẩn sợi phân lập từ các mẫu hải miên thu thập tại các địa điểm thuộc vùng biển Hà Tiên.
• Phạm vi nghiên cứu:
  • Khảo sát khả năng đối kháng với 5 loài vi sinh vật chỉ thị gây bệnh gồm: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli và nấm men Candida albicans.
  • Định danh sinh học phân tử bằng giải trình tự gen 16S rDNA và phân tích mối quan hệ phát sinh loài.
  • Khảo sát sự hiện diện của 3 nhóm gen chỉ thị sinh tổng hợp chất có hoạt tính sinh học (PKS-I, PKS-II, NRPS).
  • Chiết tách và phân tích cấu trúc, thành phần hóa học của các hợp chất sinh học từ các dòng tiềm năng cao nhất bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến hải miên, hệ vi sinh vật cộng sinh trong hải miên, đặc điểm sinh học của vi khuẩn sợi và các con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học:

• Đặc điểm phân loại và sinh học của hải miên: Tác giả điểm lại các phân loại của Hooper & van Soest (2002), Gopi et al. (2012), Kriska (2013) về số lượng loài (khoảng 8.000 đến 15.000 loài), chia thành các lớp Hexactinellida, Calcarea, Demospongiae và Homoscleromorpha. Hải miên xuất hiện cách đây hơn 580 triệu năm (Li et al., 1998), hoạt động lọc nước với lưu lượng lớn (24 $m^3$/kg/ngày) (Kennedy et al., 2001). Cấu trúc của chúng chứa hệ thống kênh rỗng (aquiferous system) trong lớp mesohyl, tạo môi trường cho các nhóm vi khuẩn "bacterosponges" sinh sống với mật độ $10^8 - 10^{10}$ tế bào/gam trọng lượng tươi (Vacelet & Donadey, 1977; Hentschel et al., 2006; Usher et al., 2004).
• Đa dạng vi sinh vật cộng sinh với hải miên: Vi sinh vật có thể chiếm đến 40-50% sinh khối của hải miên (Taylor et al., 2007; Wilkinson et al., 1999). Hơn 25 ngành vi khuẩn đã được ghi nhận trong hải miên (Schmitt et al., 2012), gồm Proteobacteria, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria, vi nấm (Ascomycota, Basidiomycota) (Baker et al., 2009; Holler et al., 2000), và cổ vi khuẩn Archaea thuộc nhóm Euryarchaeota và Crenarchaeota (Holmes & Blanch, 2007; Karner et al., 2001). Riêng về vi khuẩn sợi, Zhang et al. (2006) chỉ ra 27,5% chủng phân lập từ hải miên có hoạt tính kháng khuẩn và 91% mang gen PKS hoặc NRPS. Các tác giả như Li et al. (2006), Zheng et al. (2000), Liu et al. (2019) đã phân lập các chi Streptomyces, Microbacterium, Pseudonocardia, Nocardia, Kocuria, Aeromicrobium, Rhodococcus từ nhiều loài hải miên biển.
• Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn sợi biển: Luận án tổng hợp bảng các hợp chất mới từ vi khuẩn sợi biển theo Subramani & Aalbersberg (2012) và Manivasagan et al. (2014), bao gồm: Salinosporamide A (Feling et al., 2003), Salinipyrones A-B (Oh et al., 2008), Lodopyridone (Maloney et al., 2009), Arenimycin (Asolkar et al., 2010), Abyssomicin C (Riedlinger et al., 2004), Bonactin (Schumacher et al., 2003), Chlorinated dihydroquinones (Soria-Mercado et al., 2005), Diazepinomicin (Charan et al., 2004), Frigocyclinone (Bruntner et al., 2005), Essramycin (El-Gendy et al., 2008), Lynamicins (McArthur et al., 2008), Marinopyrroles (Hughes et al., 2008), Caboxamycin (Hohmann et al., 2009), Daryamides (Asolkar et al., 2006), Proximicins (Fiedler et al., 2008; Schneider et al., 2008), và Trioxacarcins.
• Tình hình nghiên cứu trong nước: Nghiên cứu về vi khuẩn sợi cộng sinh với hải miên tại Việt Nam còn rất hạn chế, mới có nghiên cứu của Phạm Việt Cường và cộng sự (2014) khảo sát tại vùng biển Hải Vân – Sơn Chà.

Vị trí của luận án: Luận án là công trình đầu tiên khảo sát một cách có hệ thống về quần thể vi khuẩn sợi cộng sinh trong hải miên tại vùng biển Hà Tiên, xác định phổ kháng khuẩn đối với các vi sinh vật gây bệnh tiêu biểu, đánh giá tần suất hiện diện của các gen chỉ thị sinh tổng hợp (PKS-I, PKS-II, NRPS), đồng thời chiết tách và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ các dòng tiềm năng nhất.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

• Cơ chế sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp: Theo Harir et al. (2018), vi khuẩn sợi sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp thông qua 6 con đường chính: cơ chế tổng hợp peptide, hệ enzyme polyketide synthase (PKS), hệ enzyme nonribosomal peptide synthetase (NRPS), cơ chế lai PKS-NRPS, con đường shikimate, con đường sinh tổng hợp $\beta$-lactam và con đường carbohydrate. Hệ gen mã hóa PKS (gồm PKS-I và PKS-II) và NRPS đóng vai trò chỉ thị phân tử cho khả năng tổng hợp các phân tử kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học.
• Phân loại kháng sinh từ vi khuẩn sợi: Luận án dựa trên khung phân loại của Sezaki & Miyadoh (2002), chia kháng sinh từ vi khuẩn sợi thành 12 nhóm: $\beta$-lactam, aminoglycoside, macrolide, polyene macrolide, macrocyclic lactone khác, amino acid và peptide, glycopeptide, tetracycline, quinone và anthracycline, ansamycin, nucleoside, và polyether.
• Đặc điểm vách tế bào vi khuẩn sợi: Dựa trên phân loại của Dũng và cộng sự (2010), vách tế bào vi khuẩn sợi được chia thành 4 nhóm dựa trên thành phần acid diaminopimelic (DAP) và các loại đường đặc trưng (nhóm I: L-DAP và glycine; nhóm II: meso-DAP và glycine; nhóm III: meso-DAP; nhóm IV: meso-DAP, arabinose và galactose).

Phương pháp nghiên cứu

• Thu thập và xử lý mẫu hải miên: Mẫu hải miên được thu thập tại các điểm đảo và ven bờ thuộc vùng biển Hà Tiên, bảo quản lạnh vô trùng và vận chuyển về phòng thí nghiệm; mẫu được rửa sạch bằng nước biển vô trùng, đồng hóa mô để phục vụ phân lập.
• Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn sợi: Môi trường Starch Casein Agar (SCA) bổ sung các chất ức chế chọn lọc được sử dụng để phân lập và giữ giống; nuôi cấy ở nhiệt độ phòng thí nghiệm ($28 - 30^\circ\text{C}$).
• Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Phương pháp khuếch tán giếng thạch trên môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA) và Luria Bertani (LB) để đo đường kính vòng kháng khuẩn (mm) đối với 5 chủng vi sinh vật kiểm định: B. cereus, S. aureus, S. typhimurium, E. coli, C. albicans. Mức độ kháng được đánh giá theo thang quy ước của Galindo (2004): không kháng ($< 10\text{ mm}$), kháng yếu ($10 - 15\text{ mm}$), kháng trung bình ($16 - 20\text{ mm}$) và kháng mạnh ($> 20\text{ mm}$).
• Nhận diện bằng sinh học phân tử (16S rDNA): Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB/lysozyme; phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA bằng cặp mồi chuyên biệt cho vi khuẩn sợi gồm SC-Act-0235-aS-20 và SC-Act-0878-aA-19. Sản phẩm PCR được giải trình tự và so sánh mức độ tương đồng trên ngân hàng gen NCBI bằng công cụ BLASTN; xây dựng cây phả hệ phát sinh loài.
• Khảo sát các gen chức năng PKS-I, PKS-II và NRPS:
  • Gen PKS-I (khoảng $1.400\text{ bp}$): khuếch đại bằng cặp mồi K1F / M6R.
  • Gen PKS-II (khoảng $600\text{ bp}$): khuếch đại bằng cặp mồi KSαF / KSαR.
  • Gen NRPS (khoảng $700 - 800\text{ bp}$): khuếch đại bằng cặp mồi A3F / A7R.
  • Sản phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose.
• Chiết tách và xác định cấu trúc các hợp chất sinh học:
  • Nuôi cấy vi khuẩn sợi trong môi trường lỏng có lắc khí, thu hồi dịch nuôi cấy và chiết lỏng - lỏng bằng dung môi ethyl acetate để thu cao chiết thô.
  • Phân đoạn cao chiết thô bằng phương pháp sắc ký cột (silica gel) với các hệ dung môi hexane-acetone và acetone-methanol.
  • Xác định cấu trúc hóa học hợp chất tinh sạch bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đa chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, HSQC, HMBC).
  • Phân tích thành phần các chất bay hơi và bán bay hơi trong các phân đoạn bằng hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) dựa trên thư viện phổ chuẩn NIST.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương này trình bày lý do chọn đề tài, tính cấp thiết của việc tìm kiếm các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển trước thực trạng vi khuẩn kháng thuốc. Đặt ra 1 mục tiêu tổng quát, 3 mục tiêu cụ thể, xác định đối tượng (vi khuẩn sợi từ hải miên Hà Tiên), phạm vi nghiên cứu (kháng 5 loài vi sinh vật chỉ thị; xác định gen PKS/NRPS; định danh hợp chất) và 5 nội dung nghiên cứu chính. Đồng thời tóm tắt 7 điểm đóng góp mới cùng ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương tổng quan gồm 5 phần lớn:

1. Hải miên: Cung cấp chi tiết phân loại học (4 lớp: Calcarea, Hexactinellida, Demospongiae, Homoscleromorpha), đặc điểm giải phẫu (cấu trúc mesohyl, các loại tế bào cổ áo, cổ bào, hệ thống bơm nước), hình thức sinh sản vô tính (nảy chồi, sinh mầm trong) và hữu tính (hình thành ấu trùng amphiblastula).
2. Đa dạng vi sinh vật sống cùng hải miên: Mô tả vi khuẩn (hơn 25 ngành), nấm (Ascomycota, Basidiomycota), vi tảo (Zoochlorellae), cổ vi khuẩn (Crenarchaeota, Euryarchaeota) và vi khuẩn sợi liên kết với hải miên.
3. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn sợi: Cấu trúc khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh, 4 nhóm hóa học của vách tế bào, sự hình thành và cấu trúc bào tử, điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp kháng sinh ($28 - 30^\circ\text{C}$, pH trung tính, hiếu khí).
4. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn sợi: 6 con đường chuyển hóa thứ cấp (peptide, PKS, NRPS, hybrid, shikimate, carbohydrate); 12 nhóm kháng sinh theo Sezaki & Miyadoh; tổng quan các dẫn xuất tự nhiên phân lập từ vi khuẩn sợi biển (Salinosporamide, Arenimycin, Abyssomicin, Bonactin, Lynamicins, Marinopyrroles, Caboxamycin, Daryamides, Proximicins...).
5. Đặc điểm của 5 loài vi sinh vật gây bệnh thử nghiệm: B. cereus, S. aureus, E. coli, S. typhimurium, C. albicans và tình hình nghiên cứu trong, ngoài nước.

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu

Chương 3 trình bày chi tiết các quy trình kỹ thuật:

• Thu mẫu hải miên tại vùng biển Hà Tiên, xử lý bề mặt và nghiền mẫu.
• Công thức môi trường: SCA (Starch Casein Agar), LB (Luria Bertani), MHA (Mueller-Hinton Agar).
• Phương pháp khuếch tán giếng thạch đánh giá hoạt tính kháng khuẩn theo tiêu chuẩn Galindo (2004).
• Phương pháp tách chiết DNA bằng CTAB, thông số chu nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA vi khuẩn sợi (cặp mồi SC-Act-0235-aS-20 / SC-Act-0878-aA-19).
• Chu nhiệt và thành phần hóa chất PCR cho 3 cặp mồi chức năng: K1F/M6R (PKS-I), KSαF/KSαR (PKS-II), A3F/A7R (NRPS).
• Quy trình lên men lỏng, chiết xuất dịch nuôi cấy bằng ethyl acetate, sắc ký cột qua silica gel, đo phổ NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, HSQC, HMBC) và chương trình nhiệt độ chạy GC-MS.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 phân tích toàn bộ kết quả thực nghiệm thu được:

• Phân lập và đặc điểm hình thái: Phân lập được 198 dòng vi khuẩn sợi từ các mẫu hải miên thu tại Hà Tiên. Đa số các dòng thể hiện đặc điểm khuẩn lạc thô ráp, xù xì, dạng vôi hoặc nhung tơ với màu sắc phong phú (trắng, vàng, xám, cam...); tế bào bắt màu Gram dương, dạng hình que hoặc sợi phân nhánh, không di động.

Chỉ tiêu khảo sát	Số liệu thực nghiệm	Ghi chú
Tổng số dòng vi khuẩn sợi phân lập	198 dòng	Từ hải miên vùng biển Hà Tiên
Số dòng có hoạt tính kháng $\ge 1$ vi sinh vật	130 dòng (65,65%)	Thử nghiệm trên 5 loài chỉ thị
Dòng kháng Bacillus cereus	82 dòng	Tỷ lệ cao nhất
Dòng kháng Salmonella typhimurium	73 dòng
Dòng kháng Candida albicans	42 dòng	Kháng nấm men
Dòng kháng Escherichia coli	39 dòng	Vi khuẩn Gram âm
Dòng kháng Staphylococcus aureus	22 dòng	Vi khuẩn Gram dương

• Tuyển chọn và định danh phân tử 23 dòng vi khuẩn sợi ưu tú: Tuyển chọn 23 dòng có khả năng kháng từ 2 loài vi sinh vật chỉ thị trở lên với mức độ kháng từ trung bình đến mạnh. Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA và phân tích phát sinh loài xác định 23 dòng này thuộc 4 họ:

  • Họ Actinomycetaceae: Chi Streptomyces (15 loài).
  • Họ Microbacteriaceae: Chi Microbacterium (2 loài thuộc Microbacterium tumbae).
  • Họ Nocardiaceae: Chi Rhodococcus (5 loài).
  • Họ Gordoniaceae: Chi Gordonia (1 loài thuộc Gordonia bronchialis).

• Khảo sát sự hiện diện các gen chức năng sinh tổng hợp:

  • Gen PKS-I: xuất hiện ở 16/23 dòng tuyển chọn (chiếm 69,6%).
  • Gen PKS-II: xuất hiện ở 14/23 dòng tuyển chọn (chiếm 60,9%).
  • Gen NRPS: xuất hiện ở 11/23 dòng tuyển chọn (chiếm 47,8%).

• Xác định hợp chất có hoạt tính sinh học từ hai dòng tiềm năng nhất:

  • Hai dòng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất được chọn là Streptomyces tateyamensis ND1.7a và Microbacterium tumbae ND2.7c.
  • Cao chiết thô từ S. tateyamensis ND1.7a được sắc ký cột phân đoạn. Bằng phương pháp NMR ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, HSQC, HMBC) kết hợp MS, đã xác định được cấu trúc của hợp chất tinh sạch thymine. Qua phân tích GC-MS các phân đoạn hexane-acetone và acetone-methanol, xác định thêm 6 hợp chất gồm: 2-pentanone-4-hydroxy-4-methyl, cyclohexasiloxane dodecamethyl, cycloheptasiloxane tetradecamethyl, oxime-methoxy-phenyl, hexanedioic acid bis(2-ethylhexyl) ester và diisooctyl phthalate.
  • Cao chiết thô từ M. tumbae ND2.7c qua phân tích GC-MS đã xác định được 11 hợp chất: cyclopentasiloxane decamethyl-, tetrasiloxane 3,5-diethoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy), 1-dodecene, 3-isopropoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5,5-tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane, 3,5-di-t-butylphenol, phthalic acid, 3,4-dihydroxymandelic acid 4TMS, 1,6-dioxacyclododecane-7,12-dione, 2-propyl-1-pentanol, 2-(2',4',4',6',6',8',8'-heptamethyltetrasiloxan-2'-yloxy)-2,4,4,6,6,8,8,10,10-nonamethylcyclopentasiloxane và phthalic acid monoethyl ester.

Chương 5: Kết luận và đề xuất

• Kết luận: Khẳng định việc hoàn thành các mục tiêu nghiên cứu; thiết lập được bộ sưu tập 198 dòng vi khuẩn sợi từ hải miên Hà Tiên; tuyển chọn và định danh được 23 dòng thuộc 4 họ; ghi nhận tỷ lệ mang gen PKS-I, PKS-II, NRPS; xác định được 7 hợp chất sinh học từ dòng S. tateyamensis ND1.7a và 11 hợp chất sinh học từ dòng M. tumbae ND2.7c.
• Đề xuất: Mở rộng nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật gây bệnh khác; khảo sát độc tính tế bào ung thư; tối ưu hóa các điều kiện lên men để thu nhận sinh khối và các hợp chất chuyển hóa thứ cấp ở quy mô lớn hơn.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Dữ liệu phân lập và hoạt tính sinh học: Đã phân lập được 198 dòng vi khuẩn sợi từ nguồn mẫu hải miên tại vùng biển Hà Tiên, trong đó xác định 130/198 dòng (65,65%) có hoạt tính ức chế ít nhất một trong năm loài vi sinh vật thử nghiệm.
2. Đa dạng phân loại của các chủng ưu tú: Tuyển chọn và định danh bằng phân tích trình tự đoạn gen 16S rDNA 23 dòng vi khuẩn sợi có khả năng đối kháng từ 2 chủng vi sinh vật thử nghiệm trở lên với mức độ kháng từ trung bình đến mạnh. Kết quả ghi nhận 4 họ gồm: Actinomycetaceae (chi Streptomyces với 15 loài), Microbacteriaceae (chi Microbacterium với 2 loài M. tumbae), Nocardiaceae (chi Rhodococcus với 5 loài) và Gordoniaceae (chi Gordonia với 1 loài G. bronchialis).
3. Đặc trưng di truyền về cụm gen tổng hợp: Xác định tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sinh tổng hợp chất có hoạt tính sinh học ở 23 dòng tuyển chọn: gen PKS-I đạt 69,6% (16/23 dòng), gen PKS-II đạt 60,9% (14/23 dòng) và gen NRPS đạt 47,8% (11/23 dòng).
4. Xác định thành phần hợp chất sinh học từ 2 chủng tiềm năng nhất:

Dòng vi khuẩn sợi	Số hợp chất	Danh mục các hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định	Phương pháp xác định
Streptomyces tateyamensis ND1.7a	7	Thymine; 2-Pentanone-4-hydroxy-4-methyl; Cyclohexasiloxane dodecamethyl; Cycloheptasiloxane tetradecamethyl; Oxime-methoxy-phenyl; Hexanedioic acid bis(2-ethylhexyl) ester; Diisooctyl phthalate	NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, HSQC, HMBC) và GC-MS
Microbacterium tumbae ND2.7c	11	Cyclopentasiloxane decamethyl-; Tetrasiloxane 3,5-diethoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy); 1-Dodecene; 3-Isopropoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5,5-tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; 3,5-Di-t-butylphenol; Phthalic acid; 3,4-Dihydroxymandelic acid 4TMS; 1,6-Dioxacyclododecane-7,12-dione; 2-Propyl-1-pentanol; 2-(2',4',4',6',6',8',8'-heptamethyltetrasiloxan-2'-yloxy)-2,4,4,6,6,8,8,10,10-nonamethylcyclopentasiloxane; Phthalic acid monoethyl ester	GC-MS

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: Công trình là nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn sợi cộng sinh trong hải miên tại vùng biển Hà Tiên, bổ sung dữ liệu vi sinh vật học biển và cung cấp nguồn chủng giống cùng dẫn xuất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm phục vụ định hướng phát triển dược phẩm.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Cần tiếp tục nghiên cứu tinh sạch triệt để các hợp chất được phát hiện qua GC-MS từ các phân đoạn chiết xuất để kiểm tra hoạt tính sinh học độc lập.
• Thử nghiệm mở rộng hoạt tính của các cao chiết và hợp chất tinh sạch trên các dòng tế bào ung thư người và các vi khuẩn đa kháng thuốc lâm sàng.
• Tối ưu hóa thành phần môi trường và thông số công nghệ lên men (nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy đảo, lưu lượng thổi khí) nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp các hợp chất đích.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

• Phạm vi thử nghiệm hoạt tính sinh học mới tập trung trên 5 chủng vi sinh vật kiểm định trong điều kiện in vitro (B. cereus, S. aureus, S. typhimurium, E. coli, C. albicans), chưa thực hiện trên các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc thu nhận từ bệnh viện hoặc mô hình in vivo.
• Việc phân tích cấu trúc hóa học bằng phương pháp NMR đa chiều mới thực hiện hoàn chỉnh trên 1 hợp chất (thymine) từ dòng S. tateyamensis ND1.7a; các hợp chất còn lại của dòng này và toàn bộ 11 hợp chất của dòng M. tumbae ND2.7c được xác định thông qua so sánh phổ khối GC-MS với thư viện dữ liệu chuẩn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Khảo sát bổ sung các hoạt tính sinh học khác của cao chiết và các hợp chất tinh sạch như hoạt tính kháng viêm, chống oxy hóa và độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư.
• Nghiên cứu quy trình nhân dòng và biểu hiện các cụm gen sinh tổng hợp PKS-I, PKS-II, NRPS nhằm khai thác tiềm năng trao đổi chất thứ cấp của các chủng vi khuẩn sợi biển chưa thể nuôi cấy hoặc sinh tổng hợp yếu trong điều kiện thông thường.
• Nghiên cứu công nghệ lên men tăng sinh khối và kỹ thuật tách chiết quy mô pilot để đánh giá tiềm năng ứng dụng thực tế trong công nghiệp dược và bảo vệ thực vật.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Hóa sinh học và Dược học: Có thể tham khảo phương pháp luận phân lập vi sinh vật biển đặc thù, kỹ thuật PCR khuếch đại gen 16S rDNA bằng cặp mồi chuyên biệt (SC-Act-0235-aS-20 / SC-Act-0878-aA-19), quy trình tầm soát gen sinh tổng hợp kháng sinh (PKS-I, PKS-II, NRPS), cũng như quy trình kết hợp sắc ký cột, NMR và GC-MS để định danh hợp chất thiên nhiên.
• Giảng viên và các cơ sở đào tạo: Bổ sung tư liệu giảng dạy thực tế về chuyên đề vi sinh vật học biển, công nghệ sinh học biển, các hợp chất chuyển hóa thứ cấp và sinh thái học cộng sinh giữa vi sinh vật với động vật thân lỗ.
• Các nhà nghiên cứu và đơn vị phát triển dược phẩm sinh học: Sử dụng dữ liệu về hai chủng Streptomyces tateyamensis ND1.7a và Microbacterium tumbae ND2.7c làm nguồn vật liệu sinh học ban đầu để nghiên cứu quy trình chiết xuất các hợp chất kháng nấm và kháng khuẩn tự nhiên.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phân lập được bao nhiêu dòng vi khuẩn sợi từ hải miên Hà Tiên và tỷ lệ có hoạt tính đối kháng vi sinh vật là bao nhiêu?

Luận án đã phân lập được tổng cộng 198 dòng vi khuẩn sợi từ các mẫu hải miên thu thập tại vùng biển Hà Tiên. Trong đó, có 130 dòng (chiếm tỷ lệ 65,65%) thể hiện khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài vi sinh vật thử nghiệm. Thứ tự số dòng có khả năng ức chế các loài kiểm định từ cao xuống thấp là: Bacillus cereus (82 dòng), Salmonella typhimurium (73 dòng), Candida albicans (42 dòng), Escherichia coli (39 dòng) và Staphylococcus aureus (22 dòng).

2. Kết quả định danh 23 dòng vi khuẩn sợi ưu tú phân loại chúng vào những nhóm phân loại nào?

Hai mươi ba dòng vi khuẩn sợi có hoạt tính kháng từ 2 loài vi sinh vật kiểm định trở lên (với mức độ từ trung bình đến kháng mạnh) sau khi giải trình tự đoạn gen 16S rDNA được xác định thuộc về 4 họ:

• Họ Actinomycetaceae: Chi Streptomyces gồm 15 loài.
• Họ Microbacteriaceae: Chi Microbacterium gồm 2 loài (Microbacterium tumbae).
• Họ Nocardiaceae: Chi Rhodococcus gồm 5 loài.
• Họ Gordoniaceae: Chi Gordonia gồm 1 loài (Gordonia bronchialis).

3. Tỷ lệ xuất hiện của các cụm gen chức năng PKS-I, PKS-II và NRPS ở các dòng tuyển chọn được ghi nhận như thế nào?

Khảo sát sự hiện diện của 3 nhóm gen chỉ thị sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp trên 23 dòng vi khuẩn sợi ưu tú cho thấy:

• Gen PKS-I (khuếch đại bằng cặp mồi K1F/M6R, kích thước ~1.400 bp) hiện diện ở 16/23 dòng (tỷ lệ 69,6%).
• Gen PKS-II (khuếch đại bằng cặp mồi KSαF/KSαR, kích thước ~600 bp) hiện diện ở 14/23 dòng (tỷ lệ 60,9%).
• Gen NRPS (khuếch đại bằng cặp mồi A3F/A7R, kích thước ~700–800 bp) hiện diện ở 11/23 dòng (tỷ lệ 47,8%).

4. Hai dòng vi khuẩn sợi tiềm năng nhất được lựa chọn là những dòng nào và các hợp chất chính được xác định từ chúng là gì?

Hai dòng có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất được chọn để phân tích hóa học là Streptomyces tateyamensis ND1.7a và Microbacterium tumbae ND2.7c:

• Từ S. tateyamensis ND1.7a: Xác định được 7 hợp chất gồm thymine (xác định cấu trúc qua phổ NMR và MS), 2-pentanone-4-hydroxy-4-methyl, cyclohexasiloxane dodecamethyl, cycloheptasiloxane tetradecamethyl, oxime-methoxy-phenyl, hexanedioic acid bis(2-ethylhexyl) ester và diisooctyl phthalate.
• Từ M. tumbae ND2.7c: Xác định được 11 hợp chất qua GC-MS gồm cyclopentasiloxane decamethyl-, tetrasiloxane 3,5-diethoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy), 1-dodecene, 3-isopropoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5,5-tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane, 3,5-di-t-butylphenol, phthalic acid, 3,4-dihydroxymandelic acid 4TMS, 1,6-dioxacyclododecane-7,12-dione, 2-propyl-1-pentanol, 2-(2',4',4',6',6',8',8'-heptamethyltetrasiloxan-2'-yloxy)-2,4,4,6,6,8,8,10,10-nonamethylcyclopentasiloxane và phthalic acid monoethyl ester.

5. Luận án đã sử dụng những cặp mồi PCR nào cho công tác định danh và sàng lọc gen chức năng?

Luận án sử dụng 4 cặp mồi chuyên biệt gồm:

• Cặp mồi định danh vi khuẩn sợi qua gen 16S rDNA: SC-Act-0235-aS-20 và SC-Act-0878-aA-19.
• Cặp mồi nhân bản gen PKS-I: K1F và M6R.
• Cặp mồi nhân bản gen PKS-II: KSαF và KSαR.
• Cặp mồi nhân bản gen NRPS: A3F và A7R.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Trần Vũ Phương đã hoàn thành việc phân lập 198 dòng vi khuẩn sợi từ hải miên tại vùng biển Hà Tiên, trong đó có 130 dòng thể hiện hoạt tính kháng các vi sinh vật kiểm định. Đề tài đã tuyển chọn và định danh bằng sinh học phân tử 23 dòng ưu tú thuộc 4 họ (Actinomycetaceae, Microbacteriaceae, Nocardiaceae, Gordoniaceae), đồng thời xác định tỷ lệ hiện diện của các gen sinh tổng hợp PKS-I (69,6%), PKS-II (60,9%) và NRPS (47,8%). Hai dòng tiềm năng cao nhất là Streptomyces tateyamensis ND1.7a và Microbacterium tumbae ND2.7c đã được chiết tách và xác định thành phần cấu trúc của 18 hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích bằng phương pháp NMR và GC-MS. Đây là công trình nghiên cứu toàn diện đầu tiên về vi khuẩn sợi cộng sinh trong hải miên tại vùng biển Hà Tiên, tạo nền tảng tư liệu và nguồn chủng giống phục vụ nghiên cứu phát triển các hợp chất sinh học ứng dụng trong y dược học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Vi sinh vật (VSV) là nguyên nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm cho người và động vật. Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện kháng sinh penicillin giúp chữa được nhiều bệnh gây ra do VSV, mở ra con đường mới cho y học. Kháng sinh là nhóm thuốc thiết yếu trong y học hiện đại, tác dụng trực tiếp lên vi khuẩn để tiêu diệt hoặc làm chậm sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, giúp cho hệ miễn dịch của con người chống lại quá trình nhiễm khuẩn (Kohanski et al. Ngoài ra, kháng sinh còn đóng vai trò rất quan trọng trong một số lĩnh vực khác như chăn nuôi, bảo quản thực phẩm, bảo vệ thực vật… (Ceylan et al.

Tuy nhiên, có một vấn đề ngày càng phổ biến, đó là sự xuất hiện của các VSV kháng kháng sinh. Chúng là nguyên nhân trực tiếp và gián tiếp của hàng loạt các bệnh nhiễm khuẩn: thương hàn, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết mổ. Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt cá c kháng sinh mới làm cho con người đang phải đối mặt với thời kỳ “hậu kháng sinh”. Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh là: cải tiến các kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, đồng thời thúc đẩy nghiên cứu để tìm r a các kháng sinh mới (Alanis, 2005).

Trong số các VSV có khả năng sinh kháng sinh thì VKS (actinobacteria) hay còn gọi là xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng hàng đầu, khoảng 80% các kháng sinh được phát hiện có nguồn gốc từ VKS, đặt biệt là các loài thuộc chi Streptomyces (Aslan, 1999). Tuy nhiên, việc tìm ra kháng sinh mới từ Streptomyces phân lập từ đất ngày càng trở nên hiếm và khó khăn, do vậy, việc phân lập các loài VKS từ các nguồn đặc biệt khác để tìm kiếm kháng sinh mới là rất cần thiết (Sirisha et al. Trong xu hướng này, các loài VKS hiếm phân lập từ biển được quan tâm nhiều hơn do khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp (secondary metabolites) có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như kháng sinh, hợp chất kháng ung thư, kháng khối u, thuốc bảo vệ thực vật …Trong đó, nhóm VKS cộng sinh với hải miên được nhiều nhà khoa học quan tâm (Asha Devi et al. Trong các nhóm vi khuẩn sống cùng với hải miên, nhóm vi khuẩn Lam (cyanobacteria) làm nhiệm vụ quang tổng hợp để cung cấp năng lượng cho hải miên còn có những nhóm vi khuẩn khác phân hủy chất thải (Beer & Ilan, 1998), ổn định bộ khung của hải miên và sản xuất sản phẩm thứ cấp.

Chính các sản phẩm thứ cấp chính là những chất kháng vi khuẩn (antibacterial), kháng nấm (antifungal) và những hoạt động khác để giúp cho hải miên tự bảo vệ mình , vì hải miên có cấu trúc tương tự động vật bậc cao và chỉ thiếu hệ thống miễn dịch. Vi khuẩn cộng sinh với hải miên tạo ra nhiều sản phẩm thứ cấp hay còn gọi là sản phẩm thiên nhiên giữ vai trò quan trọng 1 trong việc phát triển dược phẩm góp phần để trị bệnh cho con người (Schmit t et al. Ở Việt Nam, có rất ít công trình nghiên cứu về VKS cộng sinh với hải miên được công bố chỉ có công trình của Phạm Việt Cường et al., (2014) đã tuyển chọn được 11 chủng xạ khuẩn từ hải miên ở vùng biển Hải Vân – Sơn Chà, có hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh. Vùng biển Hà Tiên là vùng biển bao gồm nhiều đảo lớn nhỏ, tiếp cận vịnh Thái Lan, nơi có nguồn nước biển sạch, trong, nông và ấm nên có nhiều loài sinh vật sống rất phong phú trong đó có nhiều loài hải miên.

Nhóm sinh vật này sẽ là nguồn lợi không những về tài nguyên biển mà còn là nguồn sinh vật biển chứa nhiều VSV cộng sinh sản xuất chất có hoạt tính sinh học, trong đó có nhóm VKS, góp phần mang lại lợi ích về những kháng sinh mới phục vụ cho y học, nuôi trồng thuỷ sản, chăn nuôi gia súc, gia cầm, tuy nhiên công trình nghiên cứu về nhóm VKS này hiện còn khá hạn chế. Từ những lý do trên, đề tài nghiên cứu: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh” được tiến hành nhằm góp phần làm phong phú các sản phẩm có giá trị cao khai thác từ nguồn tài nguyên biển phục vụ cho cuộc sống và có thể ứng dụng trong y học.2 Mục tiêu đề tà i 1.1 Mục tiêu tổng quát Phân lập và tuyển chọn được những dòng VKS có khả năng sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao, đồng thời xác định được các hợp chất có hoạt tính sinh học, tạo nguồn vật liệu phục vụ cho nghiên cứu sản xuất các hợp chất ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm.2 Mục tiêu cụ thể Phân lập được các dòng VKS từ hải miên tại vùng biển Hà Tiên, đồng thời đánh giá khả năng kháng của các dòng VKS này đối với các VSV thử nghiệm. Tuyển chọn và định danh được các dòng VKS có khả năng sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao, đồng thời đánh giá mối liên hệ di truyền và khảo sát sự hiện diện của các gen PKS-I, PKS-II và NRPS chỉ thị cho sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học của các dòng VKS tuyển chọn. Tuyển chọn từ một đến hai dòng VKS có tiềm năng nhất, có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính kháng được nhiều loại VSV với mức độ kháng cao, đồng thời xác định được các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ VKS tuyển chọn.3 Đối tượng nghiên cứu Các dòng VKS phân lập được từ hải miên thu thập tại các địa điểm thuộc vùng biển Hà Tiên.4 Phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu về khả năng kháng một số VSV gây bệnh thử nghiệm gồm Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli và Candida albicans của các dòng VKS phân lập từ hải miên.

Tuyển chọn và định danh các VKS có khả năng sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao, đồng thời đánh giá mối liên hệ di truyền và khảo sát sự hiện diện của các gen PKS-I, PKS-II và NRPS chỉ thị cho sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học của các dòng VKS tuyển chọn. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất bởi dòng VKS tiềm năng nhất.5 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập VKS từ hải miên ở vùng biể n Hà Tiên. Nội dung 2: Đánh giá và tuyển chọn các dòng VKS có khả năng kháng với VSV gây bệnh thử nghiệm gồm B. albicans, và có khả năng sản xuất hợp chất sinh học có hoạt tính kháng khuẩn cao.

Nội dung 3: Nhận diện và khảo sát mối liên hệ di truyền các dòng VKS tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Nội dung 4: Khảo sát sự hiện diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS chỉ thị cho sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học của các dòng VKS tuyển chọn. Nội d ung 5: Xác định hợp chất có hoạt tính sinh học của dòng VKS tiềm năng nhất.6 Đóng góp mới của luận án Đã phân lập được 198 dòng VKS từ hải miên ở vùng biển Hà Tiên, trong đó 130/198 dòng có khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài VSV được thử nghiệm gồm B. Đã tuyển chọn và định danh được 23 dòng VKS có khả năng kháng ít nhất hai dòng VSV chỉ thị trở lên với mức độ kháng từ trung bình đến kh áng mạnh.

Các dòng VKS tuyển chọn thuộc bốn họ bao gồm họ Actinomycetaceae (với chi Streptomyces có 15 loài), họ Microbacteriaceae (với hai loài Microbacterium tumbae), họ Nocardiaceae (với chi Rhodococcus có năm loài) và họ Gordoniaceae (với một loài là Gordonia bronchialis). Tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chất có hoạt tính sinh học được ghi nhận có sự khác nhau, bao gồm PKS-I là 69,6%, PKS-II là 60,9% và NRPS là 47,8%. 3 Đã nhận diện được hai dòng VKS tiềm năng nhất có khả năng kháng khuẩn cao là S. Bảy hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ S.7a được xác định, gồm có: thymine; 2- Pentanone-4-hydroxy-4-methyl; cyclohexasiloxane dodecamethyl; cycloheptasiloxane tetradecamethyl; oxime- methoxy-phenyl; hexanedioic acid bis (2-ethylhexyl) ester và diisooctyl phthalate.7c, 11 hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định bao gồm: cyclopentasiloxane decamethyl-, tetrasiloxane 3.5-diethoxy- 1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy), 1-dodecene, 3-isopropoxy- 1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5,5-tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane, 3,5-di-t-butylphenol, phthalic acid, 3,4-dihydroxymandelic acid 4TMS, 1.6-dioxacyclododecane-7-12- dione, 2-propyl-1-pentanol, 2-(2’,4’,4’,6’,6’,8’,8’-heptamethyltetrasiloxan-2’yloxy)- 2,4,4,6,6,8,8,10.10-nonamethylcyclopentasiloxane và phthalic acid monoethyl ester.

Kết quả của đề tài về các hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích, đặc biệt là khả năng kháng nấm và kháng khuẩn, là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra loại dược phẩm mới sản xuất từ các VSV cộng sinh với hải miên góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người. Đây cũng là công trình nghiên cứu đầu tiên về VKS trong hải miên ở vùng biển Hà Tiên.7 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án 1.1 Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp thông tin khoa học về các nhóm VKS sống cộng sinh với hải miên có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích, đặc biệt là khả năng kháng nấm và kháng khuẩn. Các kết quả của luận án có thể được sử dụng như là nguồn tài liệu tham khảo trong giảng dạy cũng như cho sinh viên bậc đại học và sau đại họ c tại cơ sở đào tạo khi nghiên cứu về lĩnh vực này.2 Ý nghĩa thực tiễn Các dòng VKS có hoạt tính kháng khuẩn cao được phân lập từ hải miên là nguồn vật liệu có thể sử dụng phục vụ cho nghiên cứu tinh sạch, sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học cao góp phần ứng dụng trong việc điều trị bệnh và bảo vệ sức khỏe cho con người. 4 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Phân loại khoa học và phân bố Hải miên (bọt biển, sponges) có khoảng 8.000 loài, chiếm cứ hầu hết các vùng nước trên trái đất, từ những hồ nước ngọt tới các vùng biển nhiệt đới, không trừ cả những vùng lạnh giá ở bắc cực, chia thành bốn lớp Hexactinellida, Calcarea, Demospongiae và Homoscleromorpha.

Một vài loài hải miên thường gặp như Petromica citrina, Amphimedon viridis, Desmapsamma anchorata, Polymastia janeirensis, Aplysina fulva, Mycale angulosa, Hymeniacidon heliophila, Dysidea etheria, Tethya rubra và Tethya maza, Aplysina fulva, Chondrosia collectrix, Petromica citrina, Polymastia janeirensis, Tedania ignis, Hyrtioserecta, Amphimedonchloros,… Cơ thể hải miên có kích thước biến động rất lớn từ 3 - 10 mm đến 1,5 – 2 m (Ereskovsky, 2010). Nhưng Hooper & van Soest (2002) cho rằng hải miên chỉ là ngành sinh vật biển gồm khoảng hơn 15.000 loài chia thành ba lớp là Hexactinellida, Calcarea và Demospongiae.