CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Sơ lược về phương pháp sắc ký :[22. Định nghĩa Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh. Một hệ sắc ký bao gồm: chất phân tích, pha tĩnh và pha động.
Nguyên tắc của sắc ký Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố ác chất giữa hai pha: một pha thường cố định gọi là pha ĩnh(stationaryphase) và một pha chuyển động gọi là pha động (mobile phase). Khi cho mẫu chứa hỗn hợp chất cần phân tích đã được hoà tan trong dung môi thích hợp (pha động) di chuyển qua pha tĩnh do sự phân bố các chất cần phân tích giữa hai pha là khác nhau nên tốc độ di chuyển của chúng khác nhau và sẽ được tách khỏi nhau sau một thời gian nhất định. Các giai đoạn của quá trình sắc ký: Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn chính: a) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch các sắc tố lên đầu cột canxi cacbonat). Các chất được giữ trên pha tĩnh.
b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha động sẽ kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromato- gram). Giai đoạn này gọi là khai triển sắc ký. Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua thì các chất có thể lần lượt bị kéo ra ngoài pha tĩnh (ví dụ: ra khỏi cột). Đó là quá trình rửa giải và dung môi dùng được và dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng được ờ cuối cột gọi là dịch rửa giải (eluate).
3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta có thể lấy từng phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy chất. Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng thu lấy các phân đoạn dịch rửa giải có các chất cần phân tích. c) Phát hiện các chất: Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử. Trong sắc ký rửa giải có thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi là detec- tor đặt sau cột.
Sơ lược về phương pháp sắc ký lỏng [24] 1. Cơ sở lý thuyết Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột. Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể. Cấu trúc Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống HPLC Thiết bị bao gồm một hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ phận điều khiển nhiệt độ có thể được sử dụng nếu cần thiết), detector và một 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn hệ thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị).
Pha động được cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector.1 Hệ thống bơm Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn chảy với một lưu lượng không đổi. Những biến đổi áp suất sẽ được giảm thiểu, ví dụ cho dung môi chạy qua một thiết bị giảm xung. Ống dẫn và hệ thống nối phải là loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm. Các bơm có thể được lắp với thiết bị loại bỏ bọt khí.
Hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp pha động hoặc hằng định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi tỷ lệ thành phần (rửa giải gradient) theo một chương trình xác định. Trong trường hợp rửa giải gradient, hệ thống bơm lấy các dung môi từ một vài bình chứa và các dung môi có thể được trộn lẫn ở áp suất thấp hoặc áp suất cao. Bộ phận tiêm mẫu Dung dịch mẫu thử được đưa vào dòng pha động hoặc vào vị trí gần đầu hoặc đầu cột nhờ một bộ phận tiêm mẫu có khả năng hoạt động ở áp suất cao. Có thể dùng vòng chứa mẫu thử, có thể tích cố định hoặc thiết bị có thể tích thay đổi, có thể vận hành bằng tay hoặc tự động.
Khi tiêm mẫu bằng tay có thể gây ra sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ. Pha tĩnh Có nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc ký lỏng, bao gồm: - Silica (silica dioxyd), alumina trioxyd hoặc graphit xốp thường được dùng trong sắc ký pha thuận mà quá trình phân tách dựa trên sự khác nhau về khả năng hấp phụ hoặc (và) phân bố khối lượng; - Nhựa hoặc polymer có chứa các nhóm chức acid hoặc base, sử dụng trong sắc ký trao đổi ion mà trong đó sự chia tách được thực hiện dựa trên sự cạnh tranh giữa các ion cần tách và các ion trong pha động; 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn - Silica xốp hoặc polymer, sử dụng trong sắc ký rây phân tử, ở đó sự chia tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, tương ứng với sự loại trừ không gian; - Rất nhiều chất mang biến đổi hóa học được chế tạo từ polymer, silica gel hoặc graphit xốp được dùng trong sắc ký lỏng pha đảo mà ở đó sự chia tách về nguyên tắc cơ bản dựa trên sự phân bố phân tử các chất giữa pha động và pha tĩnh; - Pha tĩnh loại biến đổi hóa học đặc biệt, ví dụ dẫn xuất của celulose hoặc amylose, protein hoặc peptid, cyclodextrin v. dùng để tách các đồng phân đối quang (sắc ký đối quang). Phần lớn sự chia tách dựa trên cơ chế phân bố, sử dụng silica biến đổi hóa học làm pha tĩnh và các dung môi phân cực làm pha động.
Bề mặt của chất mang, ví dụ như các nhóm silanol của silica được phản ứng với các thuốc thử silan khác nhau tạo thành các dẫn xuất silyl có liên kết cộng hóa trị, che phủ một số lượng khác nhau các vị trí hoạt động trên bề mặt chất mang. Bản chất của các pha liên kết là tham số quan trọng để xác định các tính chất tách của hệ sắc ký. Các pha liên kết dùng phổ biến là: Octyl = Si–(CH2)7–CH3 Octadecyl = Si–(CH2)17–CH3 Phenyl = Si–(CH2)n–(C6H5) Cyanopropyl = Si–(CH2)3–CN Aminopropyl = Si–(CH2)3–NH2 Diol = Si-(CH2)3-OCH(OH)-CH2-OH Trừ khi có tiêu chuẩn riêng của nhà sản xuất, thông thường các cột sắc ký pha đảo dựa trên silica được coi là ổn định đối với pha động có pH từ 2,0 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc. Cột chứa graphit xốp hoặc các hạt vật liệu polymer như styren - divi- nylbenzen copolymer ổn định ở một khoảng pH rộng hơn.
Phân tích sử dụng sắc ký pha thuận với pha tĩnh là silica không bị biến đổi, graphit xốp hoặc silica biến đổi hóa học làm cho phân cực (ví dụ cy- anopropyl hoặc diol) và pha động không phân cực được sử dụng trong một số trường hợp. Đối với sự tách nhằm mục đích phân tích, kích thước hạt của pha tĩnh phổ biến nhất từ 3 µm đến 10 µm. Các hạt có thể hình cầu hoặc không có hình dạng nhất định, có độ xốp khác nhau và diện tích bề mặt đặc hiệu. Những tham số này cấu thành biểu hiện sắc ký của từng pha tĩnh cụ thể.
Trong trường hợp pha đảo, các yếu tố bổ sung như bản chất của pha tĩnh, mức độ liên kết, ví dụ như độ dài mạch carbon liên kết, hoặc các nhóm hoạt động bề mặt của pha tĩnh có được che phủ hết hay không. Sự kéo đuôi peak, đặc biệt của các chất base, có thể xảy ra khi có mặt các nhóm silanol bề mặt của silica. Cột được làm bằng thép không gỉ trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, có chiều dài và đường kính trong () khác nhau được sử dụng cho phân tích sắc ký. Cột với đường kính trong nhỏ hơn 2 mm thường được coi là vi cột.
Nhiệt độ của pha động và cột phải được giữ ổn định trong suốt thời gian phân tích. Phần lớn quá trình tách được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thu được hiệu quả cao hơn. Tuy nhiên, nhiệt độ cột cũng không được phép vượt quá 60 °C vì khả năng phân hủy của pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thể xảy ra. Pha động Đối với sắc ký pha thuận, thường sử dụng dung môi ít phân cực.
Sự có mặt của nước trong pha động phải được hạn chế và kiểm tra chặt chẽ nhằm thu được kết quả tái lặp lại. Đối với sắc ký lỏng pha đảo, sử dụng pha động chứa nước, có hoặc không có dung môi hữu cơ. 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn Các thành phần của pha động thường được lọc nhằm loại bỏ các tiểu phân lớn hơn 0,45 m. Pha động chứa nhiều thành phần được chuẩn bị bằng cách đong các thể tích qui định (trừ khi có chỉ định về khối lượng) của các thành phần riêng lẻ rồi sau đó trộn lẫn với nhau.
Ngoài ra, dung môi cũng có thể được cấp qua các bơm riêng lẻ, điều khiển bằng các van chia tỷ lệ, để có thể trộn lẫn theo các tỷ lệ mong muốn. Dung môi thường được loại khí trước khi bơm bằng cách sục khí heli, lắc siêu âm hoặc sử dụng hệ thống lọc màng lọc/chân không trực tuyến nhằm tránh sự tạo bọt khí trong cốc đo của detector. Dung môi dùng để chuẩn bị pha động thường không được chứa các chất làm ổn định và phải trong suốt (không hấp thụ quang) ở vùng bước sóng phát hiện, nếu như sử dụng detector tử ngoại. Dung môi và những thành phần khác được dùng phải có chất lượng phù hợp.
Khi cần điều chỉnh pH chỉ thực hiện với thành phần nước của pha động mà không điều chỉnh với hỗn hợp. Nếu sử dụng dung dịch đệm, cần phải rửa hệ thống bằng hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ nhằm ngăn chặn sự kết tinh muối sau khi kết thúc quá trình sắc ký.
