Tách và Xác Định Cấu Trúc Hợp Chất Thứ Cấp Từ Vi Nấm Biển Paraconiothyrium sp. VK-13

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tách xác định cấu trúc hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển Paraconiothyrium sp VK13 bằng phương pháp hóa lý hiện đại.

• Tác giả: Đinh Xuân Chung
• Người hướng dẫn: TS. Trần Hồng Quang
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Nghiên Cứu Cấu Trúc Hợp Chất Thứ Cấp Từ Vi Nấm Biển Paraconiothyrium sp. VK-13
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• MỞ ĐẦU
• 1. Chương 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Sơ lược về phương pháp sắc ký
• 1.1.1. Nguyên tắc của sắc ký
• 1.1.2. Các giai đoạn của quá trình sắc ký
• 1.2. Sơ lược về phương pháp sắc ký lỏng
• 1.3. Sơ lược về phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
• 1.3.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H
• 1.3.1.1. Cường độ vạch phổ
• 1.3.1.2. Phân loại phổ
• 1.3.2. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C
• 1.3.2.1. Phương pháp phổ 13C xóa tương tác 1H
• 1.4. Tình hình nghiên cứu vi nấm biển trên thế giới
• 2. Chương 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Mẫu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Dụng cụ và hóa chất
• 2.3.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết và phân tích sắc ký
• 2.3.2. Thiết bị phân tích xác định cấu trúc
• 2.3.3. Hóa chất sử dụng phân tích sắc ký và cấu trúc
• 2.4. Thực nghiệm phân tích sắc ký các hợp chất
• 2.5. Hằng số vật lí và dữ kiện phổ các hợp chất
• 2.5.1. Hợp chất VK-13-1 (modiolide D)
• 2.5.2. Hợp chất VK-13-2 (modiolide E)
• 2.5.3. Phân tích dữ kiện phổ 1H NMR
• 3. Chương 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân tích cấu trúc hợp chất VK-13-1
• 3.2. Phân tích cấu trúc của hợp chất VK-13-2
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Cấu Trúc Hợp Chất Thứ Cấp Từ Vi Nấm Biển

Nghiên cứu cấu trúc hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển Paraconiothyrium sp. VK-13 là một lĩnh vực mới mẻ và đầy tiềm năng. Vi nấm biển không chỉ là nguồn cung cấp các hợp chất sinh học mà còn có khả năng tạo ra các hoạt chất có giá trị cho y học. Việc phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất này sẽ giúp mở rộng hiểu biết về tính chất hóa học và sinh học của chúng.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Vi Nấm Biển Trong Nghiên Cứu Hóa Học

Vi nấm biển như Paraconiothyrium sp. VK-13 có khả năng sản sinh ra nhiều hợp chất thứ cấp với hoạt tính sinh học cao. Những hợp chất này có thể được ứng dụng trong y học và công nghiệp dược phẩm.

1.2. Mục Tiêu Nghiên Cứu Cấu Trúc Hợp Chất

Mục tiêu chính của nghiên cứu là phân tích và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển, từ đó tìm ra các hoạt chất có tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn.

II. Vấn Đề Và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Vi Nấm Biển

Mặc dù vi nấm biển có tiềm năng lớn, nhưng việc nghiên cứu và khai thác chúng vẫn gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như thiếu tài liệu, phương pháp nghiên cứu chưa phát triển đầy đủ và khó khăn trong việc thu thập mẫu từ môi trường biển là những trở ngại lớn.

2.1. Thiếu Tài Liệu Về Vi Nấm Biển

Nghiên cứu về vi nấm biển tại Việt Nam còn hạn chế, dẫn đến việc thiếu thông tin và tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Thu Thập Mẫu

Việc thu thập mẫu vi nấm từ môi trường biển đòi hỏi kỹ thuật và thiết bị chuyên dụng, điều này gây khó khăn cho các nhà nghiên cứu trong việc thực hiện các thí nghiệm.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Cấu Trúc Hợp Chất Thứ Cấp Từ Vi Nấm

Để xác định cấu trúc hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển, các phương pháp hóa lý hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được áp dụng. Những phương pháp này giúp phân tích và xác định cấu trúc hóa học một cách chính xác.

3.1. Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao HPLC

HPLC là phương pháp tách và phân tích các hợp chất trong mẫu một cách hiệu quả. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng và chính xác các hợp chất có trong vi nấm biển.

3.2. Phổ Cộng Hưởng Từ Hạt Nhân NMR

Phương pháp NMR giúp xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất thứ cấp. Kỹ thuật này cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc hóa học và các tương tác giữa các nguyên tử trong phân tử.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Hợp Chất Thứ Cấp Từ Vi Nấm Biển

Các hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển có nhiều ứng dụng trong y học, đặc biệt là trong việc phát triển thuốc mới. Những hợp chất này có thể được sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh, từ nhiễm khuẩn đến ung thư.

4.1. Ứng Dụng Trong Y Học

Hợp chất từ vi nấm biển có thể được phát triển thành thuốc kháng sinh, thuốc chống ung thư và các loại thuốc khác có hoạt tính sinh học cao.

4.2. Tiềm Năng Kinh Tế

Việc khai thác và phát triển các hợp chất từ vi nấm biển không chỉ mang lại lợi ích về sức khỏe mà còn có tiềm năng kinh tế lớn cho ngành dược phẩm.

V. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu Vi Nấm Biển

Nghiên cứu cấu trúc hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển Paraconiothyrium sp. VK-13 mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực hóa học và dược phẩm. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều phát hiện quan trọng và ứng dụng thực tiễn.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu vi nấm biển sẽ tiếp tục phát triển, mở rộng hiểu biết về các hợp chất sinh học và ứng dụng của chúng trong y học.

5.2. Khuyến Khích Nghiên Cứu Thêm

Cần khuyến khích các nghiên cứu sâu hơn về vi nấm biển để khai thác tiềm năng của chúng trong việc phát triển thuốc và các sản phẩm sinh học khác.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Đại dương bao phủ hơn 70% diện tích bề mặt Trái Đất và chứa đựng nguồn tài nguyên sinh học biển vô cùng phong phú. Trong bối cảnh các nguồn nấm trên cạn đang đối mặt với tình trạng tái phát hiện các hợp chất cũ lên tới trên 80%, việc chuyển hướng tìm kiếm các hoạt chất sinh học mới sang hệ sinh thái biển là một tất yếu khoa học. Các chủng vi sinh vật biển, đặc biệt là vi nấm sống cộng sinh trong động vật không xương sống, phải thích nghi với điều kiện áp suất cao, độ mặn lớn và nhiệt độ khắc nghiệt, từ đó sản sinh ra những chất chuyển hóa thứ cấp có cấu trúc độc đáo và hoạt tính dược lý mạnh mẽ.

Nghiên cứu tập trung giải quyết vấn đề khai thác nguồn dược liệu biển tại Việt Nam thông qua việc phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thứ cấp từ chủng vi nấm biển Paraconiothyrium sp. VK-13. Mẫu vi nấm được phân lập từ mô hải sâm thu thập tại vùng biển tỉnh Quảng Nam vào tháng 7 năm 2016. Trình tự vùng gen ITS rDNA của chủng nấm này đạt độ tương đồng 99% với các loài Paraconiothyrium thysanolaenae và Paraconiothyrium estuarinum trên ngân hàng gen quốc tế. Quá trình nuôi cấy sinh khối thực hiện trên môi trường thạch khoai tây dextrose ở nhiệt độ 25 độ C trong 15 ngày. Ý nghĩa của luận văn thể hiện ở việc làm sáng tỏ cấu trúc hóa học lập thể của hai hợp chất tự nhiên quý hiếm, đóng góp dữ liệu phổ cộng hưởng từ và phổ khối lượng chuẩn xác vào kho tàng hóa học hợp chất thiên nhiên biển Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng của lý thuyết sắc ký phân bố và hấp phụ, kết hợp với lý thuyết phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều. Quá trình tách sắc ký dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử giữa pha tĩnh và pha động. Trong kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo, tương tác kỵ nước giữa chất phân tích và chuỗi alkyl octadecyl đóng vai trò then chốt trong việc tách các đồng phân có độ phân cực gần nhau.

Cơ sở lý thuyết phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C giải thích sự tương tác của moment từ hạt nhân với từ trường ngoài. Độ chuyển dịch hóa học của cacbon biến thiên rộng từ 0 đến 230 ppm, lớn gấp khoảng 20 lần so với dải biến thiên của proton từ 0 đến 12 ppm, cung cấp bức tranh toàn diện về bộ khung phân tử. Quy tắc tương tác spin-spin và hằng số tương tác J từ 1.0 Hz đến 16.0 Hz cho phép xác lập cấu hình hình học cis hoặc trans của các liên kết đôi. Phương pháp este hóa Mosher sử dụng hiệu số độ dịch chuyển hóa học giữa hai dẫn xuất để xác định cấu hình lập thể tuyệt đối của các tâm bất đối xứng mang nhóm hydroxyl.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng mẫu vi nấm sạch Paraconiothyrium sp. VK-13 được nhân sinh khối có kiểm soát. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích tập trung vào các loài sinh vật biển có khả năng cộng sinh cao tại vùng biển miền Trung Việt Nam. Dịch chiết ethyl acetate được chiết xuất dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm ở 25 độ C nhằm tối đa hóa hiệu suất thu hồi các hợp chất thứ cấp mà không làm biến tính cấu trúc.

Quy trình phân tách kết hợp nhiều cấp độ: sắc ký cột pha đảo sử dụng silica gel ODS kích thước hạt 30 đến 50 micromet, sắc ký lọc gel Sephadex LH-20, và sắc ký lỏng hiệu năng cao bán điều chế trên cột C18 kích thước 21.2 x 150 mm với tốc độ dòng 3 đến 5 mL/phút. Cấu trúc hóa học được xác định bằng hệ thống phổ khối lượng phân giải cao ESI Q-TOF MS/MS và máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân JEOL công tác ở tần số 400 MHz cho 1H và 100 MHz cho 13C. Sự kết hợp các phương pháp phổ một chiều và hai chiều là giải pháp tối ưu để quy kết chính xác 100% vị trí các nguyên tử cacbon và hydro trong các phân tử macrolide phức tạp.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Từ cặn chiết dịch nuôi cấy vi nấm, nghiên cứu đã phân lập thành công 2 hợp chất thứ cấp sạch có khối lượng tinh sạch đạt 8 mg mỗi chất, ký hiệu là VK-13-1 và VK-13-2. Cả hai hợp chất đều tồn tại dưới dạng chất rắn không màu và có cùng khối lượng phân tử M = 240 g/mol, ứng với công thức phân tử C12H16O5.

Hợp chất VK-13-1 cho pic ion giả phân tử tại m/z 263.0890 và góc quay cực đo được là dương 65.8 độ trong methanol. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy sự có mặt của 12 nguyên tử cacbon, bao gồm 2 nhóm carbonyl, 4 cacbon olefin thuộc 2 liên kết đôi, 3 cacbon oxymethine, 1 cacbon methylene và 2 nhóm methyl. Hợp chất được xác định là modiolide D với tên gọi quốc tế là (2Z,4R,5E,7S,9R)-4-O-acetyl-7-hydroxy-9-methyl-2,5-nonadien-9-olide.

Hợp chất VK-13-2 thể hiện pic ion tại m/z 263.0892 trên phổ khối lượng phân giải cao, có góc quay cực dương 14.6 độ và thời gian lưu trên sắc ký đồ HPLC pha đảo là 23.7 phút. Cấu trúc được xác định là modiolide E mang tên khoa học (2Z,4R,5E,7S,9R)-4-hydroxy-7-O-acetyl-9-methyl-2,5-nonadien-9-olide. Cấu hình tuyệt đối của các tâm bất đối tại C-4 và C-7 của cả hai hợp chất được chứng minh thuyết phục qua dẫn xuất este hóa Mosher.

Thảo luận kết quả

Cả hai hợp chất VK-13-1 và VK-13-2 đều thuộc khung cấu trúc macrolide vòng 10 cạnh hiếm gặp trong tự nhiên. So sánh với hợp chất đối chứng modiolide A, sự khác biệt mấu chốt nằm ở vị trí gắn của nhóm acetyl. Ở hợp chất VK-13-1, nhóm O-acetyl liên kết tại vị trí C-4, làm cho độ dịch chuyển hóa học của proton H-4 chuyển dịch về phía trường yếu ở 5.95 ppm. Ngược lại, ở hợp chất VK-13-2, nhóm O-acetyl gắn tại vị trí C-7, làm tín hiệu proton H-7 dịch chuyển về 5.56 ppm trong khi H-4 dịch chuyển về vùng trường mạnh hơn ở 4.90 ppm.

Dữ liệu phân tích tương tác không gian NOESY đã chứng minh sự tương đồng về hình học phân tử: tương tác giữa proton H-7 với H-5 và H-9 khẳng định các proton này cùng hướng về một phía của mặt phẳng vòng lacton. Kết quả phân tích hóa lý có thể được biểu diễn trực quan thông qua bảng đối chiếu độ dịch chuyển hóa học 13C NMR kết hợp với sắc ký đồ HPLC phân tách tại bước sóng 210 nm và 254 nm. Việc phát hiện modiolide D và E từ chủng vi nấm Paraconiothyrium sp. VK-13 tại Việt Nam mở rộng hiểu biết về phân bố địa lý và sự đa dạng sinh học của các hợp chất chuyển hóa biển.

Đề xuất và khuyến nghị

Để phát triển các kết quả của luận văn thành những ứng dụng thực tiễn trong ngành công nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học biển, các giải pháp sau đây được đề xuất:

Thứ nhất, mở rộng quy mô nuôi cấy sinh khối vi nấm Paraconiothyrium sp. VK-13 từ quy mô phòng thí nghiệm lên hệ thống lên men bán công nghiệp từ 50 đến 100 lít. Viện Hóa Sinh Biển và các đơn vị nghiên cứu chuyên ngành cần chủ trì thực hiện nhằm nâng sản lượng thu hồi các hợp chất modiolide từ mức miligram lên mức gram trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới.

Thứ hai, triển khai đánh giá toàn diện hoạt tính sinh học in vitro và in vivo của modiolide D và modiolide E. Mục tiêu cụ thể là sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hướng tới xác định chỉ số ức chế IC50 dưới mức 5.0 micromol/L trong lộ trình 18 tháng.

Thứ ba, chuẩn hóa quy trình phân tách sắc ký lỏng hiệu năng cao ở quy mô điều chế. Cần tối ưu hóa tỷ lệ dung môi methanol và nước chứa 0.1% acid formic để rút ngắn thời gian phân tách xuống dưới 20 phút và nâng cao hiệu suất thu hồi sản phẩm tinh khiết lên trên 90%.

Thứ tư, xây dựng ngân hàng dữ liệu số hóa về thành phần hóa học của các chủng vi nấm biển Việt Nam. Các trường đại học khối khoa học tự nhiên phối hợp với cơ quan quản lý sở hữu trí tuệ để đăng ký bản quyền cấu trúc và quy trình chiết xuất, tạo cơ sở pháp lý vững chắc cho việc thương mại hóa dược liệu biển.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị thực tiễn và học thuật sâu sắc cho nhiều nhóm độc giả chuyên môn:

Nhóm nghiên cứu Hóa học hợp chất thiên nhiên và Hóa phân tích: Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết từ phân lập, tinh chế đến giải mã cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D, 2D và phổ khối lượng phân giải cao.

Các nhà khoa học và dược sĩ nghiên cứu phát triển thuốc mới: Cung cấp nguồn cấu trúc macrolide vòng 10 cạnh độc đáo, là tiền chất tiềm năng cho việc thiết kế và bán tổng hợp các loại thuốc kháng khuẩn, kháng nấm và ức chế tế bào ung thư.

Giảng viên, học viên cao học và sinh viên ngành Hóa học, Sinh học biển và Công nghệ sinh học: Tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp nghiên cứu vi sinh vật biển, kỹ thuật định danh phân tử qua chuỗi gen ITS rDNA và phương pháp Mosher xác định cấu hình lập thể tuyệt đối.

Các doanh nghiệp và viện nghiên cứu công nghệ sinh học biển: Cung cấp dữ liệu khoa học nền tảng để định hướng khai thác bền vững nguồn tài nguyên sinh vật biển Việt Nam phục vụ sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm sinh học.

Câu hỏi thường gặp

Chủng vi nấm Paraconiothyrium sp. VK-13 được thu thập và định danh như thế nào? Chủng nấm được phân lập từ mẫu hải sâm biển thu thập tại Quảng Nam vào tháng 7 năm 2016. Qua phân tích trình tự vùng gen ITS rDNA, độ tương đồng di truyền đạt 99% so với các loài chuẩn trên GenBank, xác định chính xác chủng nấm thuộc chi Paraconiothyrium.

Điểm khác biệt cơ bản giữa modiolide D và modiolide E là gì? Hai hợp chất là đồng phân vị trí của nhau với cùng công thức C12H16O5 và phân tử lượng 240. Khác biệt cốt lõi nằm ở vị trí nhóm O-acetyl: liên kết tại C-4 ở modiolide D và liên kết tại C-7 ở modiolide E, dẫn đến sự khác biệt rõ rệt về phổ NMR và góc quay cực.

Phương pháp Mosher có vai trò gì trong việc xác định cấu trúc phân tử? Phương pháp Mosher bán tổng hợp các dẫn xuất este với tác nhân MTPA clorua giúp xác định cấu hình lập thể tuyệt đối tại các tâm cacbon bất đối C-4 và C-7 thông qua sự chênh lệch độ chuyển dịch hóa học proton giữa hai dạng đồng phân đối quang.

Tại sao cần kết hợp cả phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D? Phổ 1D NMR xác định số lượng và loại nguyên tử cacbon, hydro nhưng không thể chỉ ra mối liên kết không gian phức tạp. Các phổ 2D như HSQC, HMBC, COSY và NOESY giúp thiết lập chính xác khung liên kết phân tử và cấu hình không gian của hợp chất.

Tiềm năng ứng dụng y dược của nhóm hợp chất macrolide vòng 10 cạnh là gì? Nhóm hợp chất 10-membered macrolide từ vi nấm biển đã được y văn ghi nhận có hoạt tính kháng sinh, kháng nấm và gây độc tế bào ung thư mạnh. Các hợp chất này đóng vai trò là khung cấu trúc giá trị để phát triển các thế hệ dược phẩm mới.

Kết luận

Luận văn đã thực hiện một công trình nghiên cứu hoàn chỉnh và mang tính tiên phong về hóa học các hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển tại Việt Nam.

• Phân lập thành công 02 hợp chất macrolide tinh khiết là modiolide D và modiolide E với khối lượng 8 mg mỗi chất từ sinh khối chủng vi nấm biển Paraconiothyrium sp. VK-13.
• Xác định chính xác công thức phân tử C12H16O5 và khối lượng phân tử M = 240 g/mol nhờ kỹ thuật phổ khối lượng phân giải cao HRESIMS với sai số khối lượng dưới 2 ppm.
• Giải mã chi tiết toàn bộ cấu trúc hóa học và cấu hình hình học của 12 nguyên tử cacbon bằng hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D ở tần số 400 MHz.
• Xác định cấu hình lập thể tuyệt đối của các tâm bất đối xứng tại C-4 và C-7 thông qua phương pháp bán tổng hợp dẫn xuất Mosher.
• Đóng góp cơ sở dữ liệu khoa học vững chắc về nguồn tài nguyên vi sinh vật biển Việt Nam, mở ra hướng nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính sinh học trong giai đoạn 6 đến 12 tháng tiếp theo nhằm phục vụ phát triển dược phẩm mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Sơ lược về phương pháp sắc ký :[22. Định nghĩa Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh. Một hệ sắc ký bao gồm: chất phân tích, pha tĩnh và pha động.

Nguyên tắc của sắc ký Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố ác chất giữa hai pha: một pha thường cố định gọi là pha ĩnh(stationaryphase) và một pha chuyển động gọi là pha động (mobile phase). Khi cho mẫu chứa hỗn hợp chất cần phân tích đã được hoà tan trong dung môi thích hợp (pha động) di chuyển qua pha tĩnh do sự phân bố các chất cần phân tích giữa hai pha là khác nhau nên tốc độ di chuyển của chúng khác nhau và sẽ được tách khỏi nhau sau một thời gian nhất định. Các giai đoạn của quá trình sắc ký: Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn chính: a) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch các sắc tố lên đầu cột canxi cacbonat). Các chất được giữ trên pha tĩnh.

b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha động sẽ kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromato- gram). Giai đoạn này gọi là khai triển sắc ký. Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua thì các chất có thể lần lượt bị kéo ra ngoài pha tĩnh (ví dụ: ra khỏi cột). Đó là quá trình rửa giải và dung môi dùng được và dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng được ờ cuối cột gọi là dịch rửa giải (eluate).

3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta có thể lấy từng phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy chất. Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng thu lấy các phân đoạn dịch rửa giải có các chất cần phân tích. c) Phát hiện các chất: Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử. Trong sắc ký rửa giải có thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi là detec- tor đặt sau cột.

Sơ lược về phương pháp sắc ký lỏng [24] 1. Cơ sở lý thuyết Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột. Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể. Cấu trúc Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống HPLC Thiết bị bao gồm một hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ phận điều khiển nhiệt độ có thể được sử dụng nếu cần thiết), detector và một 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn hệ thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị).

Pha động được cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector.1 Hệ thống bơm Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn chảy với một lưu lượng không đổi. Những biến đổi áp suất sẽ được giảm thiểu, ví dụ cho dung môi chạy qua một thiết bị giảm xung. Ống dẫn và hệ thống nối phải là loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm. Các bơm có thể được lắp với thiết bị loại bỏ bọt khí.

Hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp pha động hoặc hằng định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi tỷ lệ thành phần (rửa giải gradient) theo một chương trình xác định. Trong trường hợp rửa giải gradient, hệ thống bơm lấy các dung môi từ một vài bình chứa và các dung môi có thể được trộn lẫn ở áp suất thấp hoặc áp suất cao. Bộ phận tiêm mẫu Dung dịch mẫu thử được đưa vào dòng pha động hoặc vào vị trí gần đầu hoặc đầu cột nhờ một bộ phận tiêm mẫu có khả năng hoạt động ở áp suất cao. Có thể dùng vòng chứa mẫu thử, có thể tích cố định hoặc thiết bị có thể tích thay đổi, có thể vận hành bằng tay hoặc tự động.

Khi tiêm mẫu bằng tay có thể gây ra sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ. Pha tĩnh Có nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc ký lỏng, bao gồm: - Silica (silica dioxyd), alumina trioxyd hoặc graphit xốp thường được dùng trong sắc ký pha thuận mà quá trình phân tách dựa trên sự khác nhau về khả năng hấp phụ hoặc (và) phân bố khối lượng; - Nhựa hoặc polymer có chứa các nhóm chức acid hoặc base, sử dụng trong sắc ký trao đổi ion mà trong đó sự chia tách được thực hiện dựa trên sự cạnh tranh giữa các ion cần tách và các ion trong pha động; 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn - Silica xốp hoặc polymer, sử dụng trong sắc ký rây phân tử, ở đó sự chia tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, tương ứng với sự loại trừ không gian; - Rất nhiều chất mang biến đổi hóa học được chế tạo từ polymer, silica gel hoặc graphit xốp được dùng trong sắc ký lỏng pha đảo mà ở đó sự chia tách về nguyên tắc cơ bản dựa trên sự phân bố phân tử các chất giữa pha động và pha tĩnh; - Pha tĩnh loại biến đổi hóa học đặc biệt, ví dụ dẫn xuất của celulose hoặc amylose, protein hoặc peptid, cyclodextrin v. dùng để tách các đồng phân đối quang (sắc ký đối quang). Phần lớn sự chia tách dựa trên cơ chế phân bố, sử dụng silica biến đổi hóa học làm pha tĩnh và các dung môi phân cực làm pha động.

Bề mặt của chất mang, ví dụ như các nhóm silanol của silica được phản ứng với các thuốc thử silan khác nhau tạo thành các dẫn xuất silyl có liên kết cộng hóa trị, che phủ một số lượng khác nhau các vị trí hoạt động trên bề mặt chất mang. Bản chất của các pha liên kết là tham số quan trọng để xác định các tính chất tách của hệ sắc ký. Các pha liên kết dùng phổ biến là: Octyl = Si–(CH2)7–CH3 Octadecyl = Si–(CH2)17–CH3 Phenyl = Si–(CH2)n–(C6H5) Cyanopropyl = Si–(CH2)3–CN Aminopropyl = Si–(CH2)3–NH2 Diol = Si-(CH2)3-OCH(OH)-CH2-OH Trừ khi có tiêu chuẩn riêng của nhà sản xuất, thông thường các cột sắc ký pha đảo dựa trên silica được coi là ổn định đối với pha động có pH từ 2,0 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc. Cột chứa graphit xốp hoặc các hạt vật liệu polymer như styren - divi- nylbenzen copolymer ổn định ở một khoảng pH rộng hơn.

Phân tích sử dụng sắc ký pha thuận với pha tĩnh là silica không bị biến đổi, graphit xốp hoặc silica biến đổi hóa học làm cho phân cực (ví dụ cy- anopropyl hoặc diol) và pha động không phân cực được sử dụng trong một số trường hợp. Đối với sự tách nhằm mục đích phân tích, kích thước hạt của pha tĩnh phổ biến nhất từ 3 µm đến 10 µm. Các hạt có thể hình cầu hoặc không có hình dạng nhất định, có độ xốp khác nhau và diện tích bề mặt đặc hiệu. Những tham số này cấu thành biểu hiện sắc ký của từng pha tĩnh cụ thể.

Trong trường hợp pha đảo, các yếu tố bổ sung như bản chất của pha tĩnh, mức độ liên kết, ví dụ như độ dài mạch carbon liên kết, hoặc các nhóm hoạt động bề mặt của pha tĩnh có được che phủ hết hay không. Sự kéo đuôi peak, đặc biệt của các chất base, có thể xảy ra khi có mặt các nhóm silanol bề mặt của silica. Cột được làm bằng thép không gỉ trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, có chiều dài và đường kính trong () khác nhau được sử dụng cho phân tích sắc ký. Cột với đường kính trong nhỏ hơn 2 mm thường được coi là vi cột.

Nhiệt độ của pha động và cột phải được giữ ổn định trong suốt thời gian phân tích. Phần lớn quá trình tách được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thu được hiệu quả cao hơn. Tuy nhiên, nhiệt độ cột cũng không được phép vượt quá 60 °C vì khả năng phân hủy của pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thể xảy ra. Pha động Đối với sắc ký pha thuận, thường sử dụng dung môi ít phân cực.

Sự có mặt của nước trong pha động phải được hạn chế và kiểm tra chặt chẽ nhằm thu được kết quả tái lặp lại. Đối với sắc ký lỏng pha đảo, sử dụng pha động chứa nước, có hoặc không có dung môi hữu cơ. 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn Các thành phần của pha động thường được lọc nhằm loại bỏ các tiểu phân lớn hơn 0,45 m. Pha động chứa nhiều thành phần được chuẩn bị bằng cách đong các thể tích qui định (trừ khi có chỉ định về khối lượng) của các thành phần riêng lẻ rồi sau đó trộn lẫn với nhau.

Ngoài ra, dung môi cũng có thể được cấp qua các bơm riêng lẻ, điều khiển bằng các van chia tỷ lệ, để có thể trộn lẫn theo các tỷ lệ mong muốn. Dung môi thường được loại khí trước khi bơm bằng cách sục khí heli, lắc siêu âm hoặc sử dụng hệ thống lọc màng lọc/chân không trực tuyến nhằm tránh sự tạo bọt khí trong cốc đo của detector. Dung môi dùng để chuẩn bị pha động thường không được chứa các chất làm ổn định và phải trong suốt (không hấp thụ quang) ở vùng bước sóng phát hiện, nếu như sử dụng detector tử ngoại. Dung môi và những thành phần khác được dùng phải có chất lượng phù hợp.

Khi cần điều chỉnh pH chỉ thực hiện với thành phần nước của pha động mà không điều chỉnh với hỗn hợp. Nếu sử dụng dung dịch đệm, cần phải rửa hệ thống bằng hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ nhằm ngăn chặn sự kết tinh muối sau khi kết thúc quá trình sắc ký.