ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về chitin Chitin trong tự nhiên Chitin là polysaccaride có khối lượng lớn thứ 2 trong tự nhiên sau cellulose, phân bố rộng rãi với sản lượng hàng năm từ 1011-1014 tấn [1]. Chỉ tính riêng hệ sinh thái biển, ước tính có hơn 1011 tấn chitin được tạo thành mỗi năm. Polysaccharide này là nguồn carbon và nito chủ yếu trong đại dương. Tuy nhiên, đến đầu thế kỳ 20, vai trò sinh thái quan trọng của chitin mới được phát hiện, khi Johnstone nhận thấy nếu chitin không được chuyển đổi thành dạng hữu ích, nguồn carbon và nito ở đại dương sẽ cạn kiệt chỉ trong một thời gian ngắn do hai nguyên tố này thường có lượng giới hạn trong hệ sinh thái biển [2].
Hầu hết chitin tạo thành trên toàn cầu nằm ở các môi trường nước. Sản lượng chitin được cân bằng nhờ sự phân huỷ tương đương, tạo thành vòng tuần hoàn dinh dưỡng trong đại dương. Chitin có nhiều trong khung xương của động vật chân đốt và côn trùng, có cấu trúc cứng và vững chắc giúp định hình và bảo vệ vật chủ khỏi các loài săn mồi. Các phức hợp chitin-protein và khoáng hình thành cấu trúc sợi hữu cơ có độ bền cao.
Lớp vỏ giáp xác chủ yếu chứa chitin (20-30%), protein (20-40%), khoáng (30- 60%), sắc tố và có thể cả lipids (0-14%). Hàm lượng chitin có sự khác biệt tuỳ thuộc vào nguồn thu nhận, phần sinh khối sử dụng để phân tích hoặc các phương pháp sử dụng để phân tích. Chitin cũng là thành phần quan trọng nhất trong cấu trúc của thành tế bào nấm, bào tử, sợi nấm, chiếm 2-50% khối lượng thành tế bào khô. Chitin cũng có mặt trong thành tế bào của một số loại tảo như Pithophora oedogonia hay Chlorella vulgaris [1].
Cấu trúc chitin Cấu trúc hoá học Chitin là polysaccharide mạch thẳng gồm các β-(1-4)-2-acetamido-2- deoxy-D-glucose (hay GlcNAc) liên kết với nhau bằng liên kết 1,4- β-glycoside, tạo thành một mạng lưới các sợi có tổ chức. Chitin có cấu trúc hóa học tương đồng với cellulose, chitosan, chỉ khác nhau bởi các nhóm -OH, -NH2, -NHCOCH3 (Hình 1. Chitin có thể chuyển đổi thành chitosan thông qua quá trình deacetyl hoá. Đa số các nguồn tài liệu cho rằng phân tử chitosan cần có mức độ deacetyl hoá ít nhất ~50% trong khi một số tài liệu khác yêu cầu mức độ deacetyl hoá từ 60-75% [1].
Chitin dạng tự nhiên là một heteropolymer có mức độ deacetyl hoá từ 5-20%. Cấu trúc hoá học của chitin/chitosan và một số ví dụ nguồn chứa chitin [1] Các dạng cấu trúc tinh thể Chitin cấu tạo bởi các lớp polysaccharides xếp chồng lên nhau, mỗi lớp chứa các chuỗi chitin xếp song song. Khi các lớp polymer đặt sát nhau, các liên kết được hình thành làm tăng mức độ tinh thể hoá của chitin. Tuỳ thuộc vào hướng sắp xếp, chitin được phân loại thành ba cấu trúc tinh thể: α, β, và γ.
Alpha-chitin là dạng tồn tại phổ biến và phân bố rộng rãi nhất, có mặt trong hầu hết các loài giáp xác, côn trùng, nấm và thành tế nào nấm men. Ở dạng này, các chuỗi chitin xếp đối song song đều đặn, hình thành liên hết hydro trong hệ chuỗi và giữa các lớp, tạo cấu trúc tinh thể khiến α-chitin trở thành nguyên liệu bền, kém hoạt động và không hoà tan. Dạng Beta-chitin gồm các chuỗi chitin xếp song song cùng chiều, có lực tương tác yếu hơn tạo phân tử xốp, độ hoạt động cao và có ái lực cao với dung môi. Dạng này có thể tan trong acid formic và trương nở trong nước.
Beta-chitin thường có trong mai mực, ống của một số loài giun và trong các gai đơn tinh thể ở tảo Thalassiosira fluviatilis. Gamma-chitin (có trong một số loại nấm và nấm men) gồm hai chuỗi song song theo một hướng kết hợp với chuỗi thứ ba xếp đối diện, giữa các lớp không có liên kết hydro. Gamma-chitin rất ít được nghiên cứu vì được cho là cấu trúc lỗi của một trong hai dạng α hoặc β – chitin [3] Tuỳ thuộc vào nguồn thu nhận, chitin có thể ở dạng bán tinh thể hoặc tinh thể hoàn toàn. Dạng cấu trúc α, β, γ- chitin [3] 1.2 Enzyme phân giải chitin Chitin có thể được phân giải bởi vi khuẩn thông qua hai con đường: sự thuỷ phân chitin bởi chitinase đã được hiểu biết tương đối rõ ràng và con đường oxy hoá phân giải chitin khởi đầu với enzyme LPMOs (lytic polysaccharide monooxygenases) còn hạn chế về nghiên cứu [4].
Enzyme thuỷ phân chitin-Chitinase Phân loại Chitinase thuộc họ glycosidase hydrolase, phân cắt ngẫu nhiên liên kết glycoside trong phân tử chitin. Chitinases được phân loại thành hai nhóm chính dựa trên đặc tính phân cắt chitin là endo-chitinase và exo-chitinase. Endo-chitinase (EC.14) phân cắt liên kết β-1,4 glycoside một cách ngẫu nhiên trong phân tử chitin tạo thành các oligomer có khối lượng phân tử nhỏ hơn trong khi exo- chitinase cắt liên kết β-1,4 glycoside trong phân tử chitin từ đầu không khử. Exo- chitinase được phân loại thành hai nhóm nhỏ hơn dựa trên sản phẩm tạo thành là chitobiosidase (E.29) và β-(1, 4)-N-acetyl glucosaminidase (E.
Chitobiosidase cắt liên kết trong chitin từ đầu không khử tạo chitobiose còn β- (1,4)-N-acetyl glucosaminidase cắt liên kết β-1,4 glycoside từ đầu không khử tạo sản phẩm N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) (Hình 1. Tuy nhiên, Tổ chức quốc tế về Hoá sinh và Sinh học phân tử (IUBMB- International Union of Biochemistry and Molecular Biology) xếp cả hai loại exo-chitinase (EC.30) dưới cùng một danh pháp enzyme là β-N-acetylhexosaminidases (E. Hoạt động của hệ enzyme chitinase [6] Cấu trúc và phân bố của chitinase Dựa trên trình tự amino acid, enzyme chitinases được phân vào các họ glycosyl hydrolase (GH) 18, 19, 20. Các họ này khác nhau về nhiều đặc điểm như cấu trúc, cơ chế phân tử và trình tự amino acid, cho thấy sự phát sinh từ nhiều nguồn gốc khác nhau.
Họ chitinases 18 chứa nhiều cấu trúc cuộn gấp (barrel folds), trong khi họ chitinases 19 có chứa lượng lớn cấu trúc xoắn α. Sự khác biệt thứ hai thể hiện trong cơ chế thuỷ phân. Họ enzyme 18 xúc tác theo cơ chế bổ trợ cơ chất (substrate assisted catalysis) và họ 19 thuỷ phân theo cơ chế acid-base. Phân nhóm chitinase với cấu trúc và cơ chế xúc tác tương ứng được tóm tắt ở Bảng 1.
Phân nhóm chitinase Họ Phân Phân bố Cơ chế xúc tác Cấu trúc Glycosidase lớp 18 III, IV Vi khuẩn, cổ khuẩn, Xúc tác bổ trợ Cuộn gấp côn trùng, thực vật, cơ chất nấm, động vật 19 I, II, IV Thực vật và Cơ chế acid-base Xoắn α Streptomyces 20 V, VI Vi khuẩn, Xúc tác bổ trợ Cuộn gấp Sresptomyces và cơ chất người Chitinase phân bố rộng rãi trong nhiều nguồn khác nhau như vi khuẩn, cổ khuẩn, nấm, côn trùng, thực vật, động vật, v.v với vai trò đa dạng, trong đó chitinase từ vi khuẩn được cho là yếu tố chính giúp phân giải chitin trong tự nhiên. Chitinase vi khuẩn thuộc họ GH18, tuy nhiên, chitinase của Streptomyces lại được xếp vào họ 19. Chitinase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau có chứa các vùng chức năng khác nhau như: vùng bám chitin (giàu cysteine), vùng giàu serine/threonine được glycosyl hoá và vùng xúc tác. Ở một số loài vi khuẩn, vùng bám chitin có thể nằm ở đầu C hoặc đầu N của enzyme.
Chitinase vi khuẩn được chia thành ba lớp A, B và C dựa vào trình tự amino acid của mỗi vùng xúc tác riêng biệt. Đa số các chitinase phân lập từ vi khuẩn được phân loại vào phân nhóm A, cho thấy chitinase A có sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên. 4 Chitinase từ vi khuẩn có khối lượng phân tử trong khoảng 20-60 KDa, thường hoạt động trong khoảng pH rộng và nhiệt độ tuỳ thuộc từng loài. Các enzyme thể hiện hoạt tính ở pH 5-8 và nhiệt độ tối ưu khoảng 40°C.
Trong nhiều trường hợp, kim loại nặng có thể ảnh hưởng làm ức chế hoạt tính enzyme [5]. Vi khuẩn sinh chitinase nhằm phân giải, tiêu thụ các đại phân tử chứa GlcNAc làm nguồn cơ chất và năng lượng, chuyển hoá polymer (GlcNAc)n thành acetate, NH3 và Fructose-6-phosphate. Chitinase phân bố rộng rãi ở các loài Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus, Aeromonas, Arthrobacter, Clostridium, Vibrio, Chromobacterium, Beneckea, Klebsiella và Serratia trong đó Serratia thường sinh lượng lớn enzyme [5]. Vai trò của chitinase Chitinase phân bố rộng rãi ở rất nhiều loài sinh vật và có vai trò khác nhau với mỗi loài.
Ở vi khuẩn, chitinases đóng vai trò trong ký sinh, dinh dưỡng và tuần hoàn chitin trong tự nhiên. Ở thực vật và các loài có đốt sống, chitinase liên quan đến cơ chế phòng vệ, giúp kháng nấm, v. Một số virus như Baculovirus cũng sinh enzyme chitinase trong quá trình gây độc. Chitinase sử dụng trong phân huỷ sinh học chitin thành các hợp chất có ích, được khai thác để kiểm soát nấm và côn trùng trong bảo vệ mùa màng, một số loại chitinase từ vi khuẩn được bổ sung trong thuốc bảo vệ thực vật, ngăn côn trùng xâm hại.
Ngoài ra, chitinase cũng được khai thác trong nông nghiệp và môi trường, trong công nghiệp mỹ phẩm và thực phẩm,v. Enzyme oxi hoá phân giải chitin LPMOs (lytic polysaccharide monooxygenases) là enzyme phụ thuộc đồng (copper-dependent enzymes) sử dụng phản ứng oxy hoá để cắt mạch polysaccharide ở những vùng tinh thể. Hoạt tính enzyme phụ thuộc vào nguồn cung cấp năng lượng khử và chất oxy hoá có thể là oxy hoặc hydrogen peroxide. Thông qua việc tạo ra các đứt gãy trong những phần tinh thể của cơ chất, LPMOs thúc đẩy tối ưu hoạt động của các enzyme thuỷ phân.
Sự phát hiện các enzyme oxy hoá khử phá vỡ liên kết glycoside đã làm cách mạng hoá lĩnh vực enzyme chuyển đổi các polysaccharides khó phân huỷ. Loài Jonesia denitrificans dù sinh tổng hợp duy nhất một enzyme nhưng có chứa cả 3 vùng LPMO AA10, vùng bám chitin họ 5 (CBM5) và vùng xúc tác chitinase họ 18 (Chi18) nên có hoạt động như một hệ enzyme (cocktail) phân giải hiệu quả cả α và β-chitin [7]. Trong cơ sở dữ liệu CAZy (Carbohydrate-active enzyme), LPMOs được nhóm vào 3 họ enzyme hoạt động phụ trợ (auxiliary activity families) AA10, AA11 và AA15, trong đó phần lớn các enzyme đã biết thuộc họ AA10. Tất cả các LPMOs đã xác định đặc tính chỉ oxi hoá cacbon C1 của liên kết glycoside trong chitin, tạo thành chitooligosaccharides với một sản phẩm đường oxy hoá cuối là 2-(acetylamino)-2-deoxy-D-gluconic acid (GlcNAc1A).
Hiện tại, cơ chế oxy hoá chitooligosaccharides theo sau vẫn chưa được làm sáng tỏ. GlcNAc1A là sản phẩm oxy hoá độc nhất từ con đường phụ thuộc LPMO, có cấu trúc hoá học và điện tích tương đồng với một N-acetyl-D-amino acids hơn 5 là đường GlcNAc. Sản phẩm GlcNAc1A được dị hoá trong tế bào chất theo con đường khác với quá trình thuỷ phân chitin đã biết về cả hệ enzymes, các kênh vận chuyển và hệ thống điều hoà.