Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm về màng sinh vật (biofilm) Vi sinh vật là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ, muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi. Vi sinh vật không phải là một nhóm riêng biệt trong sinh giới. Chúng thậm chí thuộc về nhiều giới sinh vật khác nhau và giữa các nhóm có thể không có quan hệ mật thiết với nhau [1].
Lịch sử nghiên cứu và phát triển của vi sinh vật học đã ghi nhận người có công phát hiện ra thế giới vi sinh vật và cũng là người đầu tiên mô tả hình thái nhiều loại vi sinh vật - Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723). Với việc tự chế tạo ra trên 400 chiếc kính hiển vi, ông đã lần lượt quan sát mọi thứ có xung quanh mình, trong đó có cả các vi khuẩn và động vật nguyên sinh mà ông đã gọi là những “động vật vô cùng nhỏ bé”. Ông là người đầu tiên phát hiện ra hiện tượng bám dính và phát triển phổ biến của vi khuẩn trên bề mặt răng tạo thành các mảng bám răng, một dạng của màng sinh vật sau này [1]. Cùng với sự ra đời của kính hiển vi quang học hoàn chỉnh vào đầu thế kỷ 19, đặc biệt là việc chế tạo thành công chiếc kính hiển vi điện tử đầu tiên (1934) đã góp phần tạo nên những cống hiến lớn lao của các nhà khoa học trong lĩnh vực vi sinh vật học [1].
Năm 1936, Zobell và cộng sự [87] đã nghiên cứu cho thấy số lượng vi khuẩn bám dính tại vị trí tiếp xúc giữa nước biển và bề mặt vật rắn lớn hơn nhiều so với các vị trí xung quanh. Lợi ích của bề mặt chất rắn mang lại được đánh giá như một nơi cư trú của các vi khuẩn giúp tập trung hấp thụ chất dinh dưỡng, tăng cường hoạt động của các enzyme và hấp thụ các chất chuyển hóa. Trong những nghiên cứu về hiệu quả của bề mặt rắn đối với hoạt tính của vi khuẩn, Zobell [86] đã chỉ ra rằng bên cạnh việc cung cấp nơi khu trú và tập trung chất dinh dưỡng, bề mặt chất rắn còn làm chậm sự khuếch tán của các enzyme ngoại bào, thúc đẩy sự đồng hóa các chất dinh dưỡng thông qua quá trình thủy phân trước khi chúng được hấp thụ. Một loạt những nghiên cứu tiếp theo đó cũng đề cập đến khả năng hoạt động và tăng trưởng đáng kể của vi sinh vật bằng cách bám dính vào một bề mặt xác Trường Đại học KHTN 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng định.
Nghiên cứu của Heukelekian và cộng sự [39] cho thấy giới hạn nồng độ chất dinh dưỡng không cố định mà phụ thuộc vào tổng diện tích bề mặt tiếp xúc với môi trường. Jones và cộng sự [43] đã sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) để chỉ ra sự xuất hiện của màng sinh vật trong bộ lọc nhỏ giọt của một nhà máy xử lý nước thải và cho thấy rằng chúng bao gồm nhiều loại, nhóm các vi sinh vật khác nhau (dựa trên đặc điểm hình thái tế bào). Bằng cách sử dụng chất nhuộm màu polysaccarit đặc biệt là đỏ Ruthenimum và cố định bởi Osmium tetroxide (OsO4), các nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng vật liệu chất nền bao xung quanh và kết dính các tế bào trong cấu trúc màng sinh vật chính là polysaccarit. Các vi sinh vật gắn kết với bề mặt nhựa nhân tạo và liên kết với nhau thông qua mạng lưới polysaccarit dưới kính hiển vi điện tử ( 57700) [43].
Dựa trên những quan sát ở mảng bám răng và một số thí nghiệm khác, năm 1978, Costerton và cộng sự [14] đã đưa ra giả thuyết về màng sinh học: “Trong tự nhiên, các tế bào vi khuẩn gắn kết với nhau và bám dính trên một bề mặt nhất định nhờ hệ thống sợi glycocalyx”. Giả thuyết này đã góp phần giải thích cơ chế bám dính của vi sinh vật trên các vật liệu vô sinh và hữu sinh và những lợi ích thu được nhờ phương thức sinh thái thích hợp này. Trường Đại học KHTN 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Cùng với những tiến bộ trong quá trình nghiên cứu, khái niệm về màng sinh vật được đưa ra ngày càng hoàn thiện và đầy đủ hơn. Hiện nay, khái niệm màng sinh vật được hiểu là tập hợp các quần xã vi sinh vật bám dính và phát triển trên bề mặt các môi trường khác nhau thông qua mạng lưới chất ngoại bào do chính chúng tạo ra [26], [56].
Màng sinh vật có thể hình thành trên bề mặt môi trường vô sinh hay hữu sinh và là một hiện tượng phổ biến xuất hiện trong tự nhiên, trong đời sống hay trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Ảnh SEM một màng sinh vật do Staphylococcus aureus tạo nên [26] Các tế bào vi sinh vật trong một màng sinh vật khác biệt với các tế bào sống trôi nổi tự do bởi việc tổng hợp các chất ngoại bào giúp các tế bào bám dính với nhau trên bề mặt, sự giảm tỷ lệ tăng trưởng, và sự điều hòa tăng hoặc giảm của các gen đặc biệt nào đó. Khả năng bám dính của vi sinh vật là một quá trình phức tạp được điều hòa bởi các đặc điểm khác nhau về môi trường nuôi cấy, chất nền ngoại bào và bề mặt tế bào [57]. Vi khuẩn bắt đầu quá trình tạo màng sinh vật để đáp ứng với những tác động cụ thể từ môi trường sống như nguồn chất dinh dưỡng và oxy.
Quá trình tạo thành màng sinh vật cũng trải qua các biến đổi động học trong việc chuyển từ đời sống tự Trường Đại học KHTN 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng 10 m 1 m Hình 3. Ảnh SEM màng sinh vật nổi được hình thành bởi chủng Bacillus subtilis B-1 [57] do sang dạng sống bám dính trong cấu trúc màng sinh vật, bao gồm cả việc sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp và gia tăng các chất chống lại các tác nhân vật lý, hóa học và sinh học gây hại [56].2 Các dạng màng sinh vật trong tự nhiên và vai trò đối với vi sinh vật 1.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật trong tự nhiên Các vi sinh vật trong tự nhiên ít khi tồn tại riêng rẽ mà thường hình thành tập hợp quần xã vi sinh vật với một loạt các hoạt động chức năng sinh lý và sinh hóa. Sự tạo thành màng sinh vật diễn ra tại bề mặt rắn tiếp xúc với môi trường chất lỏng. Tại đây, các mảnh vụn hữu cơ và chất khoáng tập trung lại tạo điều kiện cho phép các vi sinh vật có thể sinh trưởng và phát triển thành các vi khuẩn lạc và dần hình thành nên màng sinh vật trưởng thành [13].
Phân tích thành phần vi sinh vật của màng cho thấy sự hiện diện của vi tảo và vi khuẩn Gallionella spp. Đặc biệt khả năng oxi hóa sắt của chủng Gallionella spp gây kết tủa sắt trong đường ống tạo ra những thay đổi không mong muốn về độ đục, màu sắc và mùi của nước [58]. Các chủng vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas putrefaciens, Escherichia coli, Bacillus sp, Serratia sp cũng được phân lập. Trong Trường Đại học KHTN 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng đó, nghiên cứu cho thấy chủng P.
putrefaciens có khả năng tạo chất ngoại bào giúp gắn kết các nhóm vi sinh vật với nhau để hình thành màng sinh vật [66]. Trong công nghiệp thực phẩm, khả năng bám dính của các vi sinh vật trên bề mặt các thiết bị chế biến có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến giá trị cảm quan của sản phẩm thực phẩm. Nghiên cứu của Sule và cộng sự [78] cho thấy chủng E. coli O157:H7 là tác nhân gây bệnh có thể phân lập từ các mẫu thịt tươi.
Bằng kỹ thuật Real-time PCR, 13 trong số 15 gen ở chủng E. coli này được nghiên cứu cho thấy có liên quan đến các chức năng sống như trao đổi chất, phân chia tế bào, hình thành màng sinh học và khả năng gây bệnh. Nghiên cứu của Kubota và cộng sự [47] về khả năng hình thành màng sinh vật trên 3 chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis và Lactobacillus fructivorans đại diện cho nhóm vi khuẩn lactic gây hư hỏng thực phẩm. Đặc điểm của sự hình thành màng sinh vật ở các chủng vi khuẩn này cung cấp cho chúng ta một hướng nghiên cứu trong việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh trong các sản phẩm thực phẩm.
Một trong những hướng nghiên cứu ứng dụng của màng sinh vật là kiểm soát sinh học các tác nhân gây bệnh hại ở cây trồng. Các chủng vi khuẩn được phân lập từ rễ cây hoặc đất trồng ở các khu vực canh tác nông nghiệp cũng cho thấy khả năng hình thành màng sinh vật tương đối cao như: Bacillus subtilis, Agrobacterium tumefaciens, Xylella fastidiosa, Rhizobium leguminosarum… Nghiên cứu của Fall và cộng sự [30] cho thấy Bacillus subtilis bám dính ở rễ cây có khả năng hình thành màng sinh vật tốt ở nồng độ K+ cao trong môi trường nuôi cấy. Bacillus subtilis cũng có khả năng ức chế sự lây nhiễm của tác nhân gây bệnh Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 ở rễ cây Arabidopsis nhờ khả năng tạo thành màng sinh vật và sản xuất surfactin [5]. Khả năng cộng sinh với mô thực vật cũng như sự tạo thành màng sinh vật trên bề mặt chóp rễ của các chủng Agrobacterium tumefaciens, Xylella fastidiosa [69] cho thấy sự tương tác cùng có lợi giữa thực vật và vi khuẩn trong việc cung cấp chất dinh dưỡng và hạn chế các tác nhân gây bệnh.
Trường Đại học KHTN 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Ngoài ra, một số chủng vi khuẩn được thu thập từ khu vực nước thải của các nhà máy, làng nghề cũng được phân lập nhằm tìm ra những chủng có khả năng hình thành màng sinh vật tốt, ứng dụng trong việc xử lý nước thải và vệ sinh môi trường.2 Các dạng tồn tại của màng sinh vật Trong tự nhiên, có thể bắt gặp và quan sát thấy màng sinh vật trong rất nhiều môi trường khác nhau: từ môi trường tự nhiên như trên bề mặt của các viên đá nằm dưới đáy sông suối, trên bề mặt nước của các hồ, ao tù đến các hệ thống nhân tạo như vòi hoa sen, ống dẫn nước.1 Trong môi trường tự nhiên Môi trường nước trong các hồ, ao, sông, suối là điều kiện thuận lợi nhất cho việc hình thành và phát triển một mạng lưới màng sinh vật.