Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Clenbuterol (CLB) là hợp chất tổng hợp thuộc nhóm $\beta_2$-agonist, ban đầu được phát triển và sử dụng trong y học làm thuốc điều trị các bệnh lý đường hô hấp như hen suyễn, co thắt phế quản nhờ tác dụng làm giãn cơ trơn cuống phổi. Tuy nhiên, từ những năm 1980, các nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra rằng khi sử dụng cho động vật ở liều lượng cao gấp 5 đến 10 lần liều điều trị thông thường (10–20 $\mu\text{g/kg/ngày}$), CLB thể hiện tác dụng phân phối lại dưỡng chất, kích thích quá trình chuyển hóa lipid thành các mô cơ, ức chế sự phát triển của xương, giúp động vật tăng trọng nhanh và nâng cao tỷ lệ thịt nạc. Do lợi nhuận kinh tế, hoạt chất này đã bị lạm dụng phối trộn trái phép vào thức ăn chăn nuôi.

CLB có thời gian bán hủy dài, khó bị phân hủy hay bay hơi trong quá trình nấu nướng và chế biến thực phẩm. Tồn dư CLB tích tụ chủ yếu tại các mô nội tạng (gan, thận chiếm tới 60%) và mô cơ thịt. Khi con người tiêu thụ thực phẩm chứa tồn dư CLB, hoạt chất này hấp thụ nhanh qua đường tiêu hóa và gây ngộ độc cấp tính với các triệu chứng: run cơ, đau đầu, buồn nôn, tim đập nhanh, tăng huyết áp, choáng váng, suy thận cấp, tổn thương hệ thần kinh trung ương và có thể dẫn đến tử vong.

Nhằm bảo vệ sức khỏe cộng đồng, nhiều quốc gia và tổ chức quốc tế đã ban hành lệnh cấm sử dụng CLB trong chăn nuôi (Hoa Kỳ cấm từ năm 1991, Liên minh Châu Âu cấm từ năm 1988 và khẳng định lệnh cấm toàn diện năm 2006, Trung Quốc cấm từ năm 1990). Tại Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ban hành Quyết định số 54/2002/QĐ-BNN ngày 20/06/2002 cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông và sử dụng CLB cùng các hóa chất thuộc họ $\beta$-agonist. Mặc dù vậy, tình trạng lén lút sử dụng chất cấm trong chăn nuôi lợn, bò vẫn diễn biến phức tạp.

Để kiểm soát dư lượng CLB, các phương pháp phân tích tiêu chuẩn hiện hành như sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS), sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết enzyme (ELISA) và cảm biến điện hóa phát quang (ECL) đã được ứng dụng. Tuy nhiên, các kỹ thuật khối phổ đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, chi phí vận hành cao, quy trình xử lý mẫu qua nhiều bước tách chiết và thời gian kéo dài, không phù hợp cho việc triển khai diện rộng hoặc kiểm tra nhanh tại hiện trường. Phương pháp ELISA có chi phí thấp hơn nhưng đòi hỏi bảo quản kháng thể nghiêm ngặt và dễ gặp hiện tượng dương tính giả.

Khoảng trống nghiên cứu đặt ra là cần phát triển một phương pháp phân tích quang học mới có quy trình xử lý đơn giản, thời gian phân tích rút ngắn, chi phí chế tạo hợp lý nhưng vẫn đảm bảo độ nhạy và độ chọn lọc cao. Chấm lượng tử (Quantum dots - Qds) và chấm lượng tử graphen (Graphene quantum dots - GQds) sở hữu các đặc tính quang học vượt trội như phổ hấp thụ rộng, phổ phát xạ hẹp đối xứng, hiệu suất huỳnh quang cao và độ bền quang tốt. Việc kết hợp Qds với hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET) mở ra hướng tiếp cận chế tạo cảm biến quang học đồng thể không cần sử dụng kháng thể sinh học để định lượng dư lượng CLB. Đề tài luận án tiến sĩ "Nghiên cứu chế tạo sensor huỳnh quang xác định dư lượng clenbuterol trong chăn nuôi" của nghiên cứu sinh Đào Văn Chương được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống kỹ thuật này.

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của luận án là thiết lập quy trình chế tạo sensor huỳnh quang từ các chấm lượng tử bán dẫn ($\text{CdTe}$, $\text{CdS}$) và chấm lượng tử graphen ($\text{GQds}$) dựa trên hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) phục vụ nhận biết và định lượng dư lượng clenbuterol trong chăn nuôi.

Các nội dung và mục tiêu cụ thể được triển khai theo 4 nhiệm vụ:

  1. Chế tạo và khảo sát đặc trưng quang học, hình thái cấu trúc của các vật liệu chấm lượng tử bán dẫn ($\text{CdTe}$, $\text{CdS}$) và chấm lượng tử gốc carbon ($\text{GQds}$).
  2. Nghiên cứu phản ứng biến tính hóa học của CLB tạo hợp chất hấp thụ quang học đóng vai trò chất nhận năng lượng (Acceptor/Quencher) và đánh giá khả năng tạo phức với phối tử nhằm thiết lập hệ sensor huỳnh quang FRET.
  3. Khảo sát các thông số kỹ thuật phân tích (khoảng tuyến tính, độ nhạy, giới hạn phát hiện LOD) của sensor huỳnh quang chế tạo từ $\text{CdTe}$, $\text{CdS}$ và $\text{GQds}$ đối với hoạt chất CLB.
  4. Thử nghiệm đánh giá khả năng xác định CLB của sensor huỳnh quang FRET trên các nền mẫu thực tế trong chăn nuôi (thịt lợn, nội tạng lợn, nước tiểu lợn, thức ăn chăn nuôi) và so sánh đối chứng độ chính xác với hai phương pháp tiêu chuẩn là ELISA và HPLC-MS/MS.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Hoạt chất tăng trọng clenbuterol ($\text{C}{12}\text{H}{18}\text{Cl}2\text{N}2\text{O}$ và dạng muối $\text{C}{12}\text{H}{18}\text{Cl}_2\text{N}_2\text{O}\cdot\text{HCl}$).
    • Vật liệu chấm lượng tử bán dẫn $\text{CdTe}$, $\text{CdS}$ và chấm lượng tử graphen ($\text{GQds}$).
    • Tác nhân biến tính: phản ứng diazo hóa giữa nhóm amin thơm của CLB với natri nitrit ($\text{NaNO}_2$) trong môi trường acid và phản ứng cộng hợp ghép đôi với $N$-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride ($\text{NED}$).
    • Hệ cảm biến huỳnh quang FRET dạng dung dịch.
  • Phạm vi nghiên cứu:
    • Không gian và nền mẫu: Thu thập và khảo sát thực nghiệm trên 4 loại mẫu thực phẩm và chăn nuôi tại Việt Nam, bao gồm mẫu thịt lợn, mẫu nội tạng lợn (gan, thận), mẫu nước tiểu lợn và mẫu thức ăn chăn nuôi (TACN).
    • Thời gian thực hiện: Luận án được hoàn thành và bảo vệ năm 2021 tại Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, các nghiên cứu phát hiện và định lượng CLB chủ yếu tập trung vào việc chuẩn hóa và ứng dụng các kỹ thuật sắc ký khối phổ hiện đại và xét nghiệm miễn dịch:

  • Nguyễn Thị Thu Thủy, Lâm Văn Xự, Phạm Thị Ánh, Trần Kim Tính, Chu Phạm Ngọc Sơn (2007): Nghiên cứu phương pháp phân tích CLB trong thức ăn chăn nuôi và thịt bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ một tứ cực (LC/MS), đạt giới hạn phát hiện $\text{LOD} = 0{,}037,\mu\text{g/kg}$ đối với mẫu thịt và $\text{LOD} = 0{,}500,\mu\text{g/kg}$ đối với mẫu thức ăn chăn nuôi.
  • Nguyễn Thị Thu Thủy và cộng sự (cuối năm 2007, 2008): Phát triển phương pháp phân tích đồng thời CLB và salbutamol bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực (LC-MS/MS) có sử dụng chất nội chuẩn đồng vị $\text{CLB-d}_9$ để loại trừ ảnh hưởng nền mẫu và sự suy giảm ion hóa trong đầu dò ESI. Phương pháp đạt $\text{LOD} = 0{,}01,\text{ppb}$ ($0{,}017,\mu\text{g/kg}$) trên thịt heo và $0{,}074,\mu\text{g/kg}$ trên thức ăn chăn nuôi, đáp ứng tiêu chuẩn giới hạn dư lượng tối đa (MRL) của Châu Âu và Codex.
  • Trung tâm Dịch vụ Phân tích và Thí nghiệm TP. Hồ Chí Minh (2008): Xây dựng quy trình phân tích nhóm $\beta$-agonist (CLB, salbutamol) bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) với giới hạn phát hiện cực tiểu của CLB là $0{,}16,\text{ppb}$ trong thức ăn gia súc, $0{,}05,\text{ppb}$ trong thịt và gan heo, hiệu suất thu hồi đạt 65–88%.
  • Bùi Quốc Anh (2009): Chế tạo bộ kit phát hiện nhanh CLB trong thịt dựa trên phản ứng tạo màu hóa học trong 2 giờ, tuy nhiên chỉ dừng lại ở mức độ định tính.
  • Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Văn Lượng, Lê Thị Quỳnh, Đỗ Khắc Hải, Nguyễn Kiều Hưng (2016): Xây dựng quy trình xác định đồng thời salbutamol, ractopamine và CLB trong thức ăn chăn nuôi bằng kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu năng hai lần khối phổ (UHPLC-MS/MS) với $\text{LOD}$ của CLB đạt $1{,}07,\mu\text{g/kg}$.
  • Nguyễn Hương Giang (2017): Ứng dụng kỹ thuật chiết QuEChERS kết hợp UPLC-MS/MS sử dụng nội chuẩn đồng vị xác định tồn dư $\beta_2$-agonist trong thịt, gan, thận heo với $\text{LOD} = 0{,}06,\mu\text{g/kg}$, khoảng tuyến tính 0,05–15,00 $\mu\text{g/L}$, độ đúng 72,91–115,10%.
  • Phòng Phân tích Thức ăn và Sản phẩm Chăn nuôi (Viện Chăn nuôi): Áp dụng quy trình ELISA thương mại để sàng lọc định tính CLB và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi với hiệu suất thu hồi $> 65%$ và $\text{RSD} < 10%$.

Các hướng nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, các công trình phát triển phương pháp phân tích CLB diễn ra đa dạng qua nhiều giai đoạn kỹ thuật:

  • Guy và cộng sự (Nestlé - Thụy Sĩ, 1999): Phân tích CLB trong thịt bằng HPLC/MS qua quy trình chiết mẫu với $\text{HClO}_4$, đạt $\text{LOD} = 0{,}01,\text{ppb}$ và độ thu hồi 63–70%.
  • Viện Nghiên cứu Sức khỏe và Môi trường Hà Lan: Kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng polymer in dấu phân tử (MIPs) với LC-MS bẫy ion để làm sạch và làm giàu mẫu.
  • Liu Pengyan và cộng sự (Đại học Hà Bắc - Trung Quốc, 2005): Phân tích CLB trong thịt lợn bằng GC-MS, đạt $\text{LOD} = 0{,}4,\text{ppb}$, độ thu hồi 73,4%.
  • Limin He và cộng sự (Đại học Nông nghiệp Nam Trung Quốc, 2007): Xác định ractopamine và CLB trong thức ăn bằng GC-MS, đạt $\text{LOD} = 2,\text{ppb}$, độ thu hồi 64,4%.
  • Aresta và cộng sự (2007): Ứng dụng vi chiết pha rắn (SPME) sợi phủ PDMS/DVB kết hợp LC-UV xác định CLB trong nước tiểu ($\text{LOD} = 9,\text{ng/mL}$) và huyết thanh ($\text{LOD} = 5,\text{ng/mL}$).
  • Liu (2011): Chế tạo cảm biến miễn dịch điện hóa dựa trên ống nano carbon đa tường kết hợp kháng thể ($\text{MWNTs-IgG}$) phát hiện CLB trong nước tiểu lợn với thời gian xét nghiệm 16 phút, $\text{LOD} = 0{,}1,\text{ng/mL}$.
  • Chen và cộng sự (2012): Xác định đồng thời CLB, chloramphenicol và diethylstilbestrol trong sữa bò bằng UPLC-MS/MS pha loãng đồng vị qua cột Acquity UPLC BEH C18, đạt $\text{LOD} = 0{,}009,\text{ng/g}$.
  • Huy và cộng sự (2014): Phát triển cảm biến huỳnh quang quang học trên cơ sở chấm lượng tử $\text{CdTe}$ gắn polymer in dấu phân tử ($\text{Qds MIP-CdTe}$) dựa trên sự dập tắt huỳnh quang, đạt $\text{LOD} = 0{,}4,\mu\text{M}$ ($120,\text{ng/mL}$) cho CLB trong sữa và gan với độ thu hồi 92–97%.
  • Duvivier (2015): Ứng dụng UHPLC-MS/MS phân tích CLB trong mẫu tóc và lông gia súc kích thước nhỏ ($25,\text{mg}$), đạt $\text{LOD} = 33{,}7,\text{pg}$, độ thu hồi trung bình 37%, $\text{LOQ} = 1{,}0,\mu\text{g/kg}$.
  • Yan và cộng sự (2016): Tách sắc ký HPLC pha đảo sử dụng pha động gradient acetonitrile – acid formic – amoni acetat xác định salbutamol, ractopamine và CLB trong thịt lợn với thời gian phân tích $< 20$ phút, $\text{LOD} < 0{,}05,\mu\text{g/L}$.
  • Gaichore (2012): Chế tạo cảm biến điện hóa trên vật liệu compozit MWCNTs kết hợp 4-tert-butyl calixarene, đạt khoảng tuyến tính $1{,}99\times 10^{-8} - 4{,}76\times 10^{-5},\text{M}$, $\text{LOD} = 1{,}38\times 10^{-9},\text{M}$.
  • Yuan và cộng sự (2017): Tổng hợp compozit 3D graphen/ống nano carbon gắn ethylenediamine (EGC) để làm giàu và chiết xuất CLB từ thịt lợn, đạt độ thu hồi 92,2–96,2%.
  • Yan (2014): Thiết lập xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh điện hóa phát quang (ECL) dựa trên hạt nano vàng (GNPs) và chấm lượng tử $\text{CdSe}$, ghi nhận khoảng tuyến tính 0,02–50 ng/mL và $\text{LOD} = 0{,}0084,\text{ng/mL}$.
  • Liu (2017): Thiết kế hệ thống cảm biến FRET quang học gồm chấm carbon (C-dots) và hạt nano vàng (AuNPs) để xác định CLB trong thịt lợn với khoảng tuyến tính 8–200 nM và $\text{LOD} = 3,\text{nM}$.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Tổng quan các công trình cho thấy phần lớn phương pháp có độ nhạy cao đều phụ thuộc vào hệ thống khối phổ phức tạp hoặc kỹ thuật miễn dịch sử dụng kháng thể sinh học đắt tiền, độ bền hạn chế. Một số nghiên cứu cảm biến quang học dùng chấm lượng tử trước đây chủ yếu dựa trên cơ chế dập tắt huỳnh quang trực tiếp hoặc polymer in dấu phân tử (MIP), vốn có độ chọn lọc và độ tái lặp chưa đồng đều.

Luận án của Đào Văn Chương lựa chọn giải quyết khoảng trống này bằng cách:

  1. Tận dụng nhóm chức amin thơm đặc trưng trên phân tử CLB để thực hiện phản ứng diazo hóa tạo muối diazonium ($\text{DCL}$), sau đó ghép đôi với phối tử $\text{NED}$ hình thành hợp chất màu azo ($\text{NDCL}$). Hợp chất này có phổ hấp thụ quang học trùng chập trực tiếp với phổ phát xạ của các chấm lượng tử.
  2. Xây dựng hệ cảm biến huỳnh quang FRET dạng dung dịch, trong đó các chấm lượng tử ($\text{CdTe}$, $\text{CdS}$, $\text{GQds}$) đóng vai trò là chất cho năng lượng (Donor) và phức azo $\text{NDCL}$ đóng vai trò chất nhận dập tắt huỳnh quang (Acceptor/Quencher).
  3. Đánh giá tính khả thi của việc thay thế chấm lượng tử bán dẫn chứa kim loại nặng ($\text{CdTe}$, $\text{CdS}$) bằng chấm lượng tử graphen ($\text{GQds}$) thân thiện môi trường được tổng hợp từ tiền chất sinh học (acid L-glutamic).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và hóa học phân tích

  • Đặc trưng hóa học của Clenbuterol:
    • Tên IUPAC: 1-(4-amino-3,5-dichlorophenyl)-2-(tert-butylamino)ethanol.
    • Công thức phân tử: $\text{C}{12}\text{H}{18}\text{Cl}_2\text{N}_2\text{O}$ (Khối lượng phân tử: $277{,}19,\text{g/mol}$).
    • Dạng muối hydrochloride: $\text{C}{12}\text{H}{18}\text{Cl}_2\text{N}_2\text{O}\cdot\text{HCl}$ ($313{,}66,\text{g/mol}$).
    • Tính chất vật lý: Dạng bột vi tinh thể không màu, tan nhiều trong nước, methanol, ethanol; ít tan trong chloroform; không tan trong benzen; điểm nóng chảy ở 174–175,5°C. Độc tính cấp: $\text{LD}_{50}$ đường miệng đối với chuột nhắt là $170,\text{mg/kg}$, chuột cống là $350,\text{mg/kg}$, chuột bạch là $67{,}1,\text{mg/kg}$.
  • Hiệu ứng giam giữ lượng tử và tính chất của Quantum Dots: Chấm lượng tử là các tinh thể nano bán dẫn có kích thước nhỏ hơn bán kính Bohr của exciton (khoảng 1–20 nm), tạo ra sự giam giữ hạt tải điện trong cả ba chiều không gian. Năng lượng vùng cấm ($E_g$) tỷ lệ nghịch với bình phương kích thước hạt, cho phép điều chỉnh bước sóng phát xạ huỳnh quang theo kích thước chế tạo. Qds có hệ số dập tắt phân tử cao ($2{,}5\times 10^5,\text{M}^{-1}\text{cm}^{-1}$, gấp 10–100 lần chất màu hữu cơ), phổ hấp thụ liên tục mở rộng về phía UV, phổ phát xạ hẹp (bề rộng phổ 25–40 nm), độ dịch chuyển Stokes lớn ($> 200,\text{nm}$) và thời gian sống huỳnh quang dài (10–40 ns).
  • Cơ chế truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET): FRET là quá trình truyền năng lượng kích thích không bức xạ từ một phân tử chất cho (Donor) ở trạng thái kích thích sang một phân tử chất nhận (Acceptor) ở trạng thái cơ bản thông qua tương tác lưỡng cực - lưỡng cực tầm xa. Ba điều kiện để FRET xảy ra:
    1. Phổ phát xạ huỳnh quang của Donor phải trùng chập đáng kể với phổ hấp thụ quang học của Acceptor.
    2. Khoảng cách không gian giữa Donor và Acceptor phải đủ gần (thường nằm trong khoảng 1–10 nm).
    3. Hướng của các momen lưỡng cực chuyển dời quang học của Donor và Acceptor phải tương thích.
  • Hóa học tạo chất nhận (Acceptor) từ CLB: Phân tử CLB chứa nhóm amin thơm ($\text{-NH}_2$) gắn trên nhân benzen. Dưới tác dụng của $\text{NaNO}_2$ trong môi trường acid ($\text{HCl}$), nhóm amin chuyển hóa thành muối diazonium ($\text{DCL}$). Sau đó, $\text{DCL}$ tham gia phản ứng ghép đôi cộng hợp với phối tử $N$-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride ($\text{NED}$) để tạo ra phức hợp azo $\text{NDCL}$. Hợp chất $\text{NDCL}$ này hấp thụ mạnh ánh sáng trong vùng khả kiến, đóng vai trò là chất dập tắt huỳnh quang (Quencher) của Qds.

Bảng so sánh đặc tính quang học của Qds và chất huỳnh quang hữu cơ

Dữ liệu đối chiếu tính chất quang - lý giữa chất huỳnh quang truyền thống và chấm lượng tử được tổng hợp trong bảng sau:

Đặc tính quang lý Chất huỳnh quang hữu cơ / Protein Chấm lượng tử (Qds)
Phổ hấp thụ Dải hấp thụ hẹp, rời rạc Tăng liên tục về phía vùng tử ngoại (UV)
Hệ số dập tắt Molar $\sim 2{,}5\times 10^5,\text{M}^{-1}\text{cm}^{-1}$ Cao gấp 10–100 lần chất hữu cơ
Phổ phát xạ Rộng, có đuôi đỏ bất đối xứng Bề rộng hẹp, đối xứng (khoảng 25–40 nm)
Dịch chuyển Stokes Nhỏ ($< 100,\text{nm}$) Lớn ($> 200,\text{nm}$)
Thời gian sống huỳnh quang Ngắn ($< 5,\text{ns}$) Dài ($10–20,\text{ns}$ hoặc lớn hơn)
Hiệu suất lượng tử Biến đổi từ thấp đến cao Cao ($0{,}2–0{,}7$ trong dung dịch đệm)
Độ bền quang Kém, dễ bị bạc màu quang hóa Tốt, bền vững dưới chiếu xạ
Kích thước vật lý Phân tử đơn lẻ ($< 0{,}5,\text{nm}$) Cấu trúc nano hạt (đường kính 1–10 nm)
Khả năng chức hóa bề mặt Hạn chế theo nhóm chức sẵn có Dễ gắn phối tử đơn hoặc đa hóa trị

Phương pháp thực nghiệm và thiết bị phân tích

  • Tổng hợp vật liệu:
    • Chế tạo Qds $\text{CdTe}$ và $\text{CdS}$: Tổng hợp bằng phương pháp hóa ướt trong môi trường nước có sử dụng các chất bọc bảo vệ bề mặt chứa nhóm thiol (như MPA, MSA).
    • Chế tạo $\text{GQds}$ từ dưới lên (Bottom-up): Nhiệt phân acid L-glutamic ở nhiệt độ 210°C đến khi chuyển sang màu nâu, hòa tan sản phẩm trong nước cất, khuấy nhẹ và ly tâm ở tốc độ $10.000,\text{vòng/phút}$ trong 30 phút để thu dịch chiết $\text{GQds}$.
  • Kỹ thuật phân tích cấu trúc và tính chất quang:
    • Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua độ phân giải cao (HR-TEM) để xác định kích thước hạt và cấu trúc tinh thể.
    • Quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis).
    • Quang phổ phát xạ huỳnh quang (Photoluminescence - PL) và đo phổ thời gian sống huỳnh quang.
    • Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) để xác định các nhóm chức bề mặt và liên kết giữa Qds với phối tử $\text{NED}$.
  • Quy trình xử lý mẫu thực:
    • Mẫu thức ăn chăn nuôi: Nghiền mịn qua rây $1,\text{mm}$, cân $1,\text{g}$ mẫu, chiết bằng $8,\text{mL}$ acetonitrile và $1,\text{mL}$ ethyl acetate, đồng hóa 3 phút, ly tâm $4.000,\text{vòng/phút}$ trong 5 phút. Lấy $6,\text{mL}$ dịch chiết, thêm $1,\text{mL}$ $n$-hexane và $1,\text{mL}$ đệm PBS, ly tâm tách lớp và lấy phần dịch đáy để phân tích.
    • Mẫu thịt lợn và nội tạng (gan, thận): Đồng hóa mẫu, chiết tách bằng dung môi hữu cơ kết hợp dung dịch đệm, ly tâm làm sạch để loại bỏ lipid và protein cản trở.
    • Mẫu nước tiểu lợn: Ly tâm loại bỏ cặn lơ lửng, chỉnh pH thích hợp trước khi thực hiện phản ứng diazo hóa và đo quang.
  • Phương pháp phân tích đối chứng:
    • Phương pháp ELISA: Sử dụng bộ kit thương mại của hãng Tecna (Ý), đo mật độ quang ở bước sóng $\lambda = 450,\text{nm}$ trên máy đọc ELISA Reader.
    • Phương pháp HPLC-MS/MS: Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Varian. Cấu hình MS theo dõi ion sơ cấp tại $m/z = 276{,}96$ và phân mảnh thu ion thứ cấp định lượng có cường độ cực đại tại $m/z = 202{,}89$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Chất tăng trọng CLB, các phương pháp phát hiện và cơ sở cảm biến huỳnh quang FRET

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận và thực trạng liên quan đến chất tăng trọng clenbuterol và các phương pháp phân tích:

  • Trình bày công thức cấu tạo, tính chất lý hóa, cơ chế tác động sinh học và độc tính của 15 hợp chất thuộc họ $\beta_2$-agonist, trong đó nhấn mạnh CLB, salbutamol và ractopamine là 3 chất bị lạm dụng phổ biến nhất.
  • Đánh giá thực trạng sử dụng CLB trên thế giới (các vụ ngộ độc tại Tây Ban Nha năm 1990 với hàm lượng trong nước tiểu 160–291 ppb; tại Ý năm 1996 với 62 người nhập viện; tại Quảng Đông, Thượng Hải - Trung Quốc các năm 2001, 2006, 2009 làm hàng trăm người nhập viện và ghi nhận ca tử vong năm 2006) và tại Việt Nam (các đợt thanh tra ghi nhận mẫu thịt và thức ăn chăn nuôi dương tính từ 6% đến 30%).
  • Phân tích ưu nhược điểm của 4 nhóm phương pháp phát hiện CLB:
    1. Khối phổ (LC-MS/MS, GC-MS): Độ nhạy cao, độ chọn lọc tuyệt đối nhờ theo dõi các mảnh ion đặc trưng ($m/z$ 276,96 và 202,89), nhưng chi phí cao, quy trình chuẩn bị mẫu phức tạp, thiết bị cồng kềnh.
    2. Điện hóa: Chi phí vừa phải, độ nhạy cao nhưng điện cực dễ bị ngộ độc bề mặt bởi các chất hoạt động bề mặt, độ tái lặp phụ thuộc kỹ thuật làm sạch điện cực.
    3. Quang học: Xử lý mẫu đơn giản, thời gian đo nhanh, thiết bị có mức đầu tư hợp lý.
    4. Sinh học (ELISA, cảm biến sinh học): Phân tích nhanh, thao tác thuận tiện nhưng phụ thuộc độ bền kháng thể, nguy cơ dương tính giả cao.
  • Trình bày tổng quan về chấm lượng tử bán dẫn ($\text{CdTe}$, $\text{CdS}$) và chấm lượng tử graphen ($\text{GQds}$); nguyên lý FRET, điều kiện xảy ra FRET và các mô hình cảm biến FRET trên thế giới.

Chương 2. Chế tạo sensor huỳnh quang dạng dung dịch xác định CLB dựa vào hiệu ứng FRET

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, hóa chất, thiết bị và các bước tổng hợp cảm biến:

  • Thiết lập quy trình phản ứng diazo hóa CLB với $\text{NaNO}_2/\text{HCl}$ tạo $\text{DCL}$ và khảo sát điều kiện ghép đôi giữa $\text{DCL}$ với phối tử $N$-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride ($\text{NED}$) tạo phức hợp azo $\text{NDCL}$.
  • Tổng hợp chấm lượng tử bán dẫn $\text{CdTe}$, $\text{CdS}$ trong pha nước và tổng hợp chấm lượng tử graphen ($\text{GQds}$) từ tiền chất acid L-glutamic ở 210°C.
  • Quy trình gắn kết phối tử $\text{NED}$ lên bề mặt các Qds để tạo phức hợp cảm biến đầu dò ($\text{CdTe-NED}$, $\text{CdS-NED}$, $\text{GQds-NED}$).
  • Xây dựng quy trình đo quang học FRET: khi có mặt CLB đã diazo hóa ($\text{DCL}$), phản ứng ghép đôi xảy ra trực tiếp tại bề mặt Qds thông qua phối tử $\text{NED}$, đưa chất nhận $\text{NDCL}$ lại gần chất cho Qds, kích hoạt quá trình FRET làm suy giảm (dập tắt) cường độ huỳnh quang của Qds.
  • Thiết lập quy trình xử lý 4 loại mẫu thực tế (thịt lợn, nội tạng lợn, nước tiểu lợn, thức ăn chăn nuôi) và các bước đo đối chứng bằng kit ELISA (Tecna - Ý) và HPLC-MS/MS (Varian).

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được, phân tích cơ chế và đánh giá hiệu năng cảm biến:

  • Đặc tính vật liệu chấm lượng tử:
    • Ảnh TEM của $\text{CdTe}$ và $\text{CdS}$ cho thấy các hạt nano bán dẫn phân tán đồng đều, kích thước hạt nằm trong khoảng 2–5 nm. Phổ hấp thụ tăng dần về vùng tử ngoại và phổ phát quang huỳnh quang có dạng đỉnh hẹp đối xứng.
    • Ảnh HR-TEM của $\text{GQds}$ điều chế từ acid L-glutamic thể hiện cấu trúc tinh thể dạng đĩa nano đơn/ít lớp với kích thước trung bình 3–5 nm. Phổ hấp thụ UV-Vis xuất hiện dải hấp thụ đặc trưng và phổ phát huỳnh quang mạnh.
  • Khảo sát phản ứng tạo chất nhận (Acceptor) và gắn kết phối tử:
    • Phổ UV-Vis của sản phẩm diazo hóa $\text{DCL}$ và phức liên hợp $\text{NDCL}$ ở các giá trị pH và tỷ lệ phản ứng khác nhau chứng minh phản ứng diazo hóa diễn ra hoàn toàn và phức $\text{NDCL}$ tạo thành có cực đại hấp thụ quang học trùng chập mạnh với vùng phát xạ của các Qds.
    • Phổ FTIR của $\text{GQds}$, $\text{GQds-NED}$ và hỗn hợp $\text{GQds-NED-DCL}$ xác nhận sự xuất hiện của các liên kết amide và liên kết azo ($\text{-N=N-}$), chứng minh sự tạo phức thành công trên bề mặt nano.
  • Nghiên cứu hiệu ứng FRET và khả năng định lượng CLB:
    • Khảo sát phổ trùng chập quang học cho thấy diện tích chồng lấn giữa phổ phát xạ của Donor ($\text{CdTe}$, $\text{CdS}$, $\text{GQds}$) và phổ hấp thụ của Acceptor ($\text{NDCL}$) rất lớn.
    • Phổ thời gian sống huỳnh quang của Qds $\text{CdS}$ giảm rõ rệt khi nồng độ CLB tăng từ $10^{-8},\text{g/mL}$ đến $10^{-6},\text{g/mL}$, là bằng chứng vật lý khẳng định cơ chế dập tắt huỳnh quang diễn ra theo con đường truyền năng lượng FRET không bức xạ chứ không phải dập tắt tĩnh hay va chạm đơn thuần.
    • Khảo sát sự thay đổi cường độ huỳnh quang theo nồng độ CLB: Cường độ phát xạ của cả 3 loại sensor ($\text{CdTe}$, $\text{CdS}$, $\text{GQds}$) giảm tuyến tính theo hàm logarit nồng độ CLB ($\log C_{\text{CLB}}$) trên dải nồng độ rộng.
  • Đánh giá trên mẫu thực và so sánh đối chứng:
    • Thử nghiệm trên các mẫu thịt lợn, nội tạng lợn, nước tiểu lợn và thức ăn chăn nuôi thêm chuẩn ở các dải nồng độ khác nhau cho thấy sensor huỳnh quang FRET có độ thu hồi cao và sai số chấp nhận được.
    • Đối chứng với phương pháp ELISA: Phương pháp sensor huỳnh quang cho kết quả định lượng tương đương về xu hướng nhưng có độ lặp lại ổn định và thời gian phản ứng nhanh hơn.
    • Đối chứng với phương pháp HPLC-MS/MS: Kết quả định lượng CLB trong mẫu thức ăn chăn nuôi bằng sensor huỳnh quang đạt độ chính xác tương đương phương pháp HPLC-MS/MS tiêu chuẩn, khẳng định tính khả thi của cảm biến trong phân tích kiểm nghiệm thực tế.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

  1. Đã thiết lập thành công nguyên lý và quy trình chế tạo hệ sensor huỳnh quang dạng dung dịch hoàn toàn mới để xác định clenbuterol dựa trên hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET).
  2. Phát triển phương pháp tạo chất nhận năng lượng (Acceptor/Quencher) thông qua phản ứng diazo hóa nhóm amin thơm của CLB với $\text{NaNO}_2$ trong môi trường acid tạo $\text{DCL}$, tiếp theo là phản ứng ghép đôi cộng hợp với phối tử $\text{NED}$ trên bề mặt chấm lượng tử. Đây là giải pháp hóa học chọn lọc cao mà không cần sử dụng đến kháng thể sinh học.
  3. Nghiên cứu so sánh đồng bộ ba loại vật liệu chấm lượng tử ($\text{CdTe}$, $\text{CdS}$ và $\text{GQds}$), làm sáng tỏ sự trùng chập phổ quang học và động học suy giảm thời gian sống huỳnh quang khi xảy ra FRET. Đã chứng minh khả năng ứng dụng của chấm lượng tử graphen ($\text{GQds}$) tổng hợp từ tiền chất sinh học acid L-glutamic như một vật liệu quang học không độc hại, thân thiện với môi trường để thay thế các chấm lượng tử bán dẫn chứa cadmium.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  1. Xây dựng quy trình phân tích dư lượng CLB có thời gian thực hiện nhanh, thao tác đơn giản, không đòi hỏi hệ thống thiết bị đắt tiền như sắc ký ghép khối phổ (LC-MS/MS, GC-MS).
  2. Thẩm định và ứng dụng thành công cảm biến FRET trên 4 nền mẫu thực tế phức tạp trong chăn nuôi gồm: thịt lợn, nội tạng lợn (gan, thận), nước tiểu lợn và thức ăn chăn nuôi.
  3. Cung cấp dữ liệu thực nghiệm so sánh đối chứng trực tiếp với phương pháp ELISA thương mại và phương pháp HPLC-MS/MS tiêu chuẩn, chứng minh sensor có độ tin cậy cao, mở ra tiềm năng ứng dụng trong công tác giám sát, kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm và phòng chống tội phạm môi trường.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Cảm biến chế tạo từ chấm lượng tử bán dẫn $\text{CdTe}$ và $\text{CdS}$ chứa kim loại nặng cadmium ($\text{Cd}$), có nguy cơ gây độc hại cho môi trường nếu thải bỏ không qua xử lý.
  • Hệ cảm biến hiện tại vận hành ở pha lỏng (dạng dung dịch), đòi hỏi bảo quản dung dịch keo chấm lượng tử trong điều kiện nhiệt độ và độ pH ổn định để tránh hiện tượng kết tụ hạt nano.
  • Phản ứng diazo hóa có tính chọn lọc cao với nhóm amin thơm bậc một, tuy nhiên trong các nền mẫu sinh học phức tạp nếu tồn tại các hợp chất chứa amin thơm tương tự với hàm lượng lớn có thể gây ảnh hưởng đến phép đo nếu không qua bước xử lý làm sạch mẫu ban đầu.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Nghiên cứu cố định hóa hệ sensor huỳnh quang FRET (đặc biệt là $\text{GQds}$) lên các chất mang rắn như que thử nhanh (lateral flow test strip), màng polymer hoặc vi lưu (microfluidic chip) để nâng cao tính cơ động phục vụ phân tích tại hiện trường.
  • Mở rộng tổng hợp các dòng chấm lượng tử carbon/graphen pha tạp dị nguyên tố (như Nitơ, Lưu huỳnh, Flo) nhằm tăng cường hiệu suất lượng tử huỳnh quang và dịch chuyển bước sóng phát xạ sang vùng khả kiến dài/hồng ngoại gần.
  • Tối ưu hóa quy trình chiết xuất mẫu một bước để rút ngắn hơn nữa thời gian phân tích tổng thể và nghiên cứu khả năng xác định đồng thời các chất khác cùng nhóm $\beta_2$-agonist (như salbutamol, ractopamine).

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và nhà nghiên cứu: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về kỹ thuật tổng hợp hạt nano bán dẫn, chấm lượng tử graphen từ tiền chất hữu cơ, phương pháp biến tính hóa học bề mặt nano và cơ chế phân tích quang phổ huỳnh quang FRET.
  • Đối với giảng viên và cơ sở đào tạo chuyên ngành Hóa học, Kỹ thuật hóa học, Công nghệ nano: Cung cấp tài liệu thực nghiệm phục vụ giảng dạy các học phần Hóa phân tích nâng cao, Vật liệu nano quang học và Cảm biến hóa sinh.
  • Đối với các cơ quan quản lý, trung tâm kiểm nghiệm và lực lượng chức năng: Cung cấp cơ sở khoa học và quy trình phân tích tham khảo cho Trung tâm Kiểm định, Cục Cảnh sát Phòng chống tội phạm về Môi trường, các Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm trong việc nghiên cứu phát triển các bộ công cụ phát hiện nhanh chất cấm trong chăn nuôi.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguyên lý nhận biết Clenbuterol của sensor huỳnh quang trong luận án dựa trên cơ chế nào?

Cơ chế nhận biết dựa trên hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET). Nhóm amin thơm trên phân tử CLB được diazo hóa bằng $\text{NaNO}_2/\text{HCl}$ tạo muối diazonium ($\text{DCL}$), sau đó phản ứng cộng hợp ghép đôi với phối tử $N$-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride ($\text{NED}$) gắn trên bề mặt chấm lượng tử. Phức hợp azo ($\text{NDCL}$) tạo thành đóng vai trò là chất nhận năng lượng (Acceptor/Quencher) có phổ hấp thụ trùng chập với phổ phát xạ của chấm lượng tử (Donor), dẫn đến sự suy giảm cường độ huỳnh quang tỷ lệ tuyến tính với logarit nồng độ CLB.

2. Ba loại chấm lượng tử được chế tạo và khảo sát trong luận án gồm những loại nào?

Tác giả đã tổng hợp và nghiên cứu 3 loại chấm lượng tử:

  1. Chấm lượng tử bán dẫn $\text{CdTe}$ tổng hợp trong pha nước.
  2. Chấm lượng tử bán dẫn $\text{CdS}$ tổng hợp trong pha nước.
  3. Chấm lượng tử graphen ($\text{GQds}$) tổng hợp theo phương pháp từ dưới lên (bottom-up) bằng cách nhiệt phân acid L-glutamic ở nhiệt độ 210°C.

3. Phương pháp sensor huỳnh quang FRET có ưu điểm gì so với HPLC-MS/MS và ELISA?

So với HPLC-MS/MS, phương pháp sensor huỳnh quang có quy trình xử lý mẫu đơn giản hơn, thời gian phân tích nhanh hơn, chi phí trang thiết bị thấp hơn và dễ triển khai ở các phòng thí nghiệm thông thường. So với ELISA, sensor huỳnh quang sử dụng phối tử hóa học $\text{NED}$ và chấm lượng tử bền vững, không phụ thuộc vào kháng thể sinh học dễ bị biến tính, giảm nguy cơ dương tính giả và có chi phí hóa chất thấp hơn.

4. Luận án đã thử nghiệm cảm biến trên những loại mẫu thực tế nào?

Luận án đã thẩm định khả năng phát hiện và định lượng CLB trên 4 loại mẫu thực tế trong chăn nuôi gồm:

  1. Mẫu thịt lợn.
  2. Mẫu nội tạng lợn (gan, thận lợn).
  3. Mẫu nước tiểu lợn.
  4. Mẫu thức ăn chăn nuôi.

5. Tại sao chấm lượng tử graphen (GQds) được coi là hướng phát triển ưu tiên thay thế CdTe và CdS?

Chấm lượng tử graphen ($\text{GQds}$) được điều chế từ nguồn tiền chất hữu cơ/sinh học (acid L-glutamic), có cấu trúc carbon trơ, độ bền hóa học và độ bền quang cao, không chứa các kim loại nặng độc hại như cadmium ($\text{Cd}$) có trong $\text{CdTe}$ và $\text{CdS}$, do đó an toàn cho người thao tác và thân thiện với môi trường.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Đào Văn Chương đã nghiên cứu thành công quy trình chế tạo sensor huỳnh quang xác định dư lượng clenbuterol dựa trên hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) giữa các chấm lượng tử ($\text{CdTe}$, $\text{CdS}$, $\text{GQds}$) và phức hợp azo diazo-clenbuterol với phối tử $\text{NED}$. Nghiên cứu đã làm sáng tỏ cơ chế truyền năng lượng không bức xạ thông qua việc khảo sát phổ trùng chập quang học và sự suy giảm thời gian sống huỳnh quang của các cấu trúc nano. Kết quả thử nghiệm trên các nền mẫu thịt lợn, nội tạng, nước tiểu và thức ăn chăn nuôi cho thấy phương pháp đạt độ chính xác và độ tin cậy tương đương với các phương pháp tiêu chuẩn ELISA và HPLC-MS/MS, mở ra hướng ứng dụng hiệu quả trong kiểm soát an toàn thực phẩm.