Đặt vấn đề Nhựa là các hợp chất cao phân tử, đƣợc dùng làm vật liệu để sản xuất nhiều loại vật dụng trong đời sống hằng ngày cho đến những sản phẩm công nghiệp, gắn với đời sống hiện đại của con ngƣời. Tuy có lợi thế rất mạnh nhƣ vậy nhƣng nhựa - polymer lại cũng có nhƣợc điểm đó là các phế thải rất khó phân hủy trong môi trƣờng tự nhiên (hàng chục đến hàng trăm năm), tồn đọng, tích lũy gây ô nhiễm môi trƣờng sống của chúng ta.Chính vì thế việc tìm ra vật liệu mới biopolymer - một loại polymer nhƣng có nguồn gốc sinh học (từ thực vật, động vật, các sản phẩm sẵn có từ sinh vật) là một trong các nghiên cứu quan trọng nhất. Khắc phục đƣợc những điểm yếu của polymer thông thƣờng, không độc hại đối với con ngƣời và môi trƣờng, dễ phân hủy trong môi trƣờng tự nhiên nên biopolymer hiện nay rất đƣợc nhiều nƣớc phát triển nghiên cứu và sản xuất. Vì có khả năng tự phân hủy cũng nhƣ hấp thụ những hợp chất hữu cơ nhƣ vậy nên biopolymer đƣợc ứng dụng để xử lý nƣớc thải nhƣ là chất giúp keo tụ các kim loại nặng cũng nhƣ các khoáng chất khác có trong nƣớc thải.
Hiện nay, ngành công nghiệp dệt nhuộm có những bƣớc phát triển mạnh mẽ, tạo ra nhiều sản phẩm đa dạng có chất lƣợng cao, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trƣờng. Trong nền kinh tế quốc dân, ngành dệt nhuộm chiếm một vị trí khá quan trọng thúc đẩy tăng trƣởng nhanh kim ngạch xuất khẩu cho đất nƣớc. Tuy nhiên, hàng năm ngành dệt nhuộm sử dụng hàng triệu tấn thuốc nhuộm để nhuộm vải và tạo ra lƣợng nƣớc thải lớn chứa nhiều chất độc hại đối với môi sinh và trực tiếp ảnh hƣởng đến sức khoẻ con ngƣời. Trong khi các phƣơng pháp xử lý khác có chi phí đầu tƣ và vận hành cao thì phƣơng pháp xử lý sinh học với biopolymer tổng hợp nhờ vi khuẩn cũng có thể đƣợc sử dụng để xử lý nƣớc thải dệt nhuộm với hiệu quả cao.
Nằm trong họ vi khuẩn Bacillaceae, các vi khuẩn đƣợc phân lập từ mùn ao có thể tổng hợp đƣợc biopolymer để xử lý nƣớc thải, giúp phân hủy các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, amin, vòng benzen và anthrone. Đây là một hƣớng nghiên cứu mới và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong xử lý nƣớc thải và ổn định bùn thải. 1 Từ những xuất phát trên, tôi đã chọn đề tài: “NGHIÊN CỨU THU NHẬN BIOPOLYMER TỪ VI KHUẨN Bacillus subtilis” để thực hiện nhằm góp phần vào việc xử lý nƣớc thải giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng. Yêu cầu và phạm vi đề tài Phân lập vi khuẩn Bacillus từ bùn ao.
Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sự tổng hợp biopolymer của vi khuẩn Bacillus nhƣ tỉ lệ giống, nhiệt độ, thời gian,. Khảo sát hiệu quả xử lý nƣớc thải của biopolymer thu nhận đƣợc. Ý nghĩa của đề tài Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng tổng hợp polymer sinh học từ nguyên liệu bùn ao. Tối ƣu hóa các yếu tố của môi trƣờng nuôi cấy nhằm thu đƣợc biopolymer cao nhất.
Đánh giá khả năng hấp thụ các hợp chất hữu cơ có trong nƣớc thải ngành dệt nhuộm của các biopolymer đƣợc tạo ra từ chủng vi khuẩn đã phân lập đƣợc. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus 2. Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis đƣợc phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu đƣợc sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi.
Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách đƣợc chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "liệu pháp subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm (Lý Kim Hữu, 2005). Đặc điểm phân loại Bacillus là giống có mức độ phổ biến cao và có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh lý, về khả năng cảm ứng và tổng hợp các loại enzyme nhƣ protease, amylase, cellulase,.
Theo Ferdinand (1872) thì Bacillus có vị trí phân loại nhƣ sau: Giới (regnum) : Bacteria Ngành (divisio): Firmicutes Lớp (class) : Bacilli Bộ (ordo) : Bacillales Họ (familia) : Bacillaceae Chi (genus) : Bacillus Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis www.com/Gallery/pages/Ba. Chi Bacillus có 48 loài, trong đó Bacillus sbtilis là một trong những vi khuẩn đầu tiên đƣợc nghiên cứu. Những nghiên cứu gần đây cho thấy chỉ có B.cereus là gây bệnh cho ngƣời. 3 Bacillus subtilis trƣớc đây tên là Vibrio subtilis (Ehrenberg, 1935) và sau này còn có tên là B.
Đặc điểm phân bố Bacillus subtilis có thể đƣợc phân lập từ nhiều môi trƣờng khác nhau trong sinh quyển (trên cạn, dƣới nƣớc), chúng có nhiều trong rơm cỏ (cho gia súc ăn), chúng còn phân bố rộng rãi trên các bề mặt của hạt và các sản phẩm đƣợc chế biến từ các hạt đó. Chúng có khả năng thích nghi với môi trƣờng rất cao, nhiệt độ thích hợp là 25 – 270C, một số chủng có thể sống trong môi trƣờng 1000C trong 30 phút. Bacillus subtilis có thể phát triển cộng sinh trên bề mặt rễ cây Arabidopsis thaliana. Bacillus subtilis cũng đƣợc tìm thấy trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật ăn thực vật, đóng vai trò là probiotic giúp duy trì hay khôi phục lại “Hệ vi khuẩn có lợi”, đƣợc tìm thấy trong các sản phẩm lên men.
Ví dụ: Đậu nành lên men với B.natto phổ biến ở Nhật. Đặc điểm hình thái B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, gram dƣơng, kích thƣớc 0. Đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn, có khả năng di động, có từ 8 – 12 tiên mao, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào.
subtilis có kích thƣớc 0.8 µm, phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt của vỏ, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, phóng xạ,… (Tô Minh Châu, 2000). Hình dạng của vi khuẩn trên môi trƣờng TSA (Trypcase Soya Agar) là khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cƣa không đều, đƣờng kính 3 – 5 mm, màu vàng xám, tâm sẫm màu. Sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi ngả nâu. Trên môi trƣờng canh TSB (Trypton Soya Broth) B.
subtilis phát triển làm đục môi trƣờng, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại nhƣ vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều. Đặc điểm sinh hoá Lên men nhƣng không sinh hơi các loại đƣờng: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. Các phản ứng sinh hóa của B. subtilis Phản ứng sinh hoá Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1994) 2.
Đặc điểm dinh dƣỡng Là vi khuẩn hiếu khí có khả năng tiết nhiều enzyme nhƣ protease, amylase, cellulase, lipase,. Hầu hết có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ từ nhiều nguồn nhƣ: tinh bột, đƣờng, protein, chất béo,. Tuy là loài hiếu khí nhƣng trong điều kiện kỵ khí có thể tạo ra ATP thông qua quá trình lên men butadiol cũng nhƣ amoni hóa nitrate.subtilis có thể nhận nitrate hay nitrite là chất nhận điện tử cuối cùng trong quá trình hô hấp kỵ khí. Hầu hết họ Bacillus là hoại sinh.
Mỗi loại vi khuẩn khi gặp điều kiện bất lợi bên ngoài nhƣ: nhiệt độ nóng lạnh, tia phóng xạ, môi trƣờng khô, chất tẩy uế,. sẽ tạo ra một bào tử để có thể sống sót. Khi điều kiện thuận lợi sẽ hoạt động lại bình thƣờng. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 2.
Cấu tạo bào tử Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dƣới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nƣớc và các chất hoà tan trong nƣớc. Dƣới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất.
Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phƣơng, 2004). Bào tử khác tế bào dinh dƣỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý. Khả năng tạo bào tử Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dƣỡng trong môi trƣờng bị kiệt quệ) (Tô Minh Châu, 2000).
Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất. Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào đƣợc sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bào tử (Prospore).
Tiền bào tử bắt đầu đƣợc bao bọc dần bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trƣởng thành, tế bào dinh dƣỡng tự phân giải và bào tử đƣợc giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nƣớc và trƣơng ra.
Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dƣỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phƣơng, 2004). Tính chất đối kháng Với vi sinh vật gây bệnh Hình thức đối kháng chủ yếu của Bacillus subtilis đối với vi sinh vật gây bệnh là cạnh tranh dinh dƣỡng và tiết kháng sinh. Tác dụng chủ yếu của kháng sinh đối với vi khuẩn có thể biểu hiện ở 3 hƣớng chủ yếu nhƣ sau: Làm ngừng tổng hợp thành (màng) tế bào hay làm tan màng tế bào vi khuẩn và do đó phá hủy tính chất thẩm thấu của tế bào, các ion Mg++, Na+, Ca++ thoát ra ngoài, tế bào chết.
6 Ảnh hƣởng quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Chất kháng sinh có thể phong bế quá trình tổng hợp protein bằng cách ngăn cản ribosome tổng hợp chuỗi polypeptid hay đƣa đến tổng hợp protein bất thƣờng. Ảnh hƣởng đối với acid acetic cụ thể là phá hủy sự trao đổi của ADN và ARN bằng cách ức chế men RNA polymerase hay gắn vào các base làm đứt đoạn chuỗi xoắn kép ADN. Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lƣợng lớn sẽ xảy ra cạnh tranh dinh dƣỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm.