Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Đái tháo đường là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa mạn tính đặc trưng bởi tình trạng tăng glucose huyết kéo dài, bắt nguồn từ sự thiếu hụt tiết insulin, giảm tác động sinh học của insulin hoặc kết hợp cả hai cơ chế. Tình trạng tăng đường huyết mạn tính gây tổn thương cấu trúc và suy giảm chức năng ở nhiều cơ quan trọng yếu, đặc biệt là hệ tim mạch, mắt, thận và hệ thần kinh. Theo số liệu của Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF) năm 2015, toàn cầu có khoảng 415 triệu người mắc bệnh đái tháo đường (độ tuổi 20–79), dự báo đạt 642 triệu người vào năm 2040. Tại Việt Nam, kết quả điều tra STEPwise của Bộ Y tế năm 2015 trên nhóm tuổi 18–69 ghi nhận tỷ lệ mắc đái tháo đường toàn quốc là 4,1% và tỷ lệ tiền đái tháo đường là 3,6%.

Trong tiến trình tiêu hóa, các phân tử carbohydrate phức tạp như tinh bột không thể hấp thu trực tiếp qua niêm mạc ruột non mà phải trải qua quá trình thủy phân xúc tác bởi hệ enzyme tiêu hóa. Trong đó, enzyme $\alpha$-glucosidase (bao gồm maltase, sucrase, isomaltase và glucoamylase) giữ vai trò xúc tác thủy phân các liên kết $\alpha$-1,4-glycosidic ở đầu không khử của oligosaccharide và disaccharide để tạo thành các phân tử D-glucose đơn phân dễ dàng hấp thu vào hệ tuần hoàn. Việc ức chế hoạt tính enzyme $\alpha$-glucosidase giúp làm chậm quá trình phân giải carbohydrate tại ruột non, kiểm soát hiệu quả mức tăng glucose huyết sau bữa ăn, đóng vai trò là một trong những chiến lược trị liệu quan trọng đối với bệnh nhân đái tháo đường type 2.

Địa y là dạng sinh vật cộng sinh đặc biệt giữa nấm (mycobiont) và vi tảo hoặc vi khuẩn lam (photobiont), sở hữu khả năng sinh tồn trong các điều kiện môi trường khắc nghiệt và tích lũy nhiều nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp đặc thù (depside, depsidone, dibenzofuran, steroid, terpene). Nấm cộng sinh địa y thuộc chi Graphis đã được ghi nhận có khả năng tổng hợp các hoạt chất ức chế $\alpha$-glucosidase. Tuy nhiên, khả năng sinh trưởng và hoạt tính sinh học của nấm cộng sinh địa y chịu sự chi phối mạnh mẽ bởi các yếu tố lý hóa của môi trường nuôi cấy nhân tạo (in vitro). Nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase của nấm cộng sinh địa y Graphis sp.

Mục tiêu và các nội dung nghiên cứu được xác định cụ thể như sau:

  1. Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (nguồn carbon, độ pH và nhiệt độ) đến hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase của chủng nấm cộng sinh địa y Graphis sp.
  2. Nội dung nghiên cứu:
    • Nuôi cấy chủng nấm cộng sinh địa y Graphis sp. trong các điều kiện môi trường khác nhau.
    • Chiết xuất và tạo cao thô ethyl acetate từ sinh khối nấm thu nhận theo các mốc thời gian nuôi cấy.
    • Khảo sát, đánh giá hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase in vitro của các mẫu cao chiết ethyl acetate và xác định giá trị $\text{IC}_{50}$ của nghiệm thức tối ưu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm cộng sinh địa y Graphis sp. mang mã số lưu trữ UE-MY08, được phân lập từ mẫu địa y Graphis sp. (mã số UE-L014) thu thập tại tỉnh Trà Vinh vào tháng 3/2023 và định danh bởi TS. Võ Thị Phi Giao (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh).
  • Thời gian và địa điểm: Đề tài được triển khai từ tháng 10/2023 đến tháng 3/2024 tại Phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi nghiên cứu: Đề tài tập trung khảo sát 3 yếu tố môi trường nuôi cấy gồm nguồn carbon (D-glucose, mannitol, sorbitol, sucrose), độ pH môi trường (pH 5, pH 6, pH 7) và nhiệt độ nuôi cấy (18°C, 24°C, 30°C) qua 3 mốc thời gian thu sinh khối (6 tuần, 8 tuần và 10 tuần).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và cơ sở sinh học

Enzyme $\alpha$-glucosidase (EC 3.2.1.20) thuộc nhóm glycoside hydrolase, xúc tác phản ứng cắt liên kết glycosidic với cơ chế thủy phân ngoài (exohydrolysis) giải phóng phân tử $\alpha$-D-glucose. Các chất ức chế enzyme thuận nghịch hoạt động theo 4 cơ chế cơ bản: ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh, ức chế kháng cạnh tranh và ức chế hỗn hợp. Các thuốc ức chế $\alpha$-glucosidase thương mại hiện hành (như acarbose, voglibose, miglitol) giúp giảm glucose máu sau ăn nhưng có thể gây tác dụng không mong muốn trên đường tiêu hóa. Do đó, việc tìm kiếm các hợp chất ức chế tự nhiên từ vi sinh vật và địa y là hướng nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn.

Chi địa y Graphis thuộc họ Graphidaceae, bộ Ostropales, lớp Lecanoromycetes, ngành Ascomycota, giới Fungi. Trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo, sự biến dưỡng thứ cấp của sợi nấm chịu ảnh hưởng từ các nguồn cơ chất carbon, nồng độ ion hydro ($pH$) và nhiệt độ môi trường, dẫn đến sự khác biệt về hàm lượng cũng như hoạt tính sinh học của các hợp chất tạo thành.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm phòng thí nghiệm kết hợp phân tích quang phổ:

  • Phương pháp nuôi cấy vi sinh: Nấm cộng sinh địa y Graphis sp. được cấy truyền từ đĩa giống ban đầu sang môi trường Sabouraud cơ bản và các môi trường Sabouraud biến tính chứa trong đĩa petri, bình tam giác hoặc ống nghiệm, nuôi hoàn toàn trong điều kiện tối. Môi trường Sabouraud chuẩn gồm: 10 g peptone, 40 g D-glucose, 15 g agar trong 1.000 mL nước cất. Các công thức biến tính gồm: thay 40 g D-glucose bằng 40 g mannitol, 40 g sorbitol hoặc 40 g sucrose; điều chỉnh độ pH ở các mức pH 5, pH 6, pH 7; đặt tủ nuôi ở các mức nhiệt độ 18°C, 24°C và 30°C.
  • Phương pháp chiết xuất tạo cao thô ethyl acetate: Sinh khối nấm sau khi thu hoạch ở các mốc 6 tuần, 8 tuần và 10 tuần được sấy khô ở 50°C trong tủ sấy Memmert, nghiền mịn và ngâm chiết với dung môi ethyl acetate 99,5%. Hỗn hợp dịch chiết được lọc qua giấy lọc Whatman, cô đặc dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không Heidolph và để bay hơi tự nhiên ở nhiệt độ phòng để thu nhận cao thô ethyl acetate.
  • Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase in vitro:
    • Dung dịch mẫu thử: 0,1 mg cao chiết nấm được hòa tan trong 25 µL DMSO và 475 µL dung dịch đệm phosphate 1 mM (pH 6,8).
    • Phản ứng enzyme: Thực hiện trên đĩa 96 giếng, phối trộn 40 µL enzyme $\alpha$-glucosidase (từ nấm men Saccharomyces cerevisiae, Sigma-Aldrich) và 50 µL mẫu thử, ủ 20 phút ở 37°C. Phản ứng thủy phân được kích hoạt bằng cách thêm 40 µL cơ chất $p$-nitrophenyl-D-glucopyranoside ($p$-NPG) 5 mM, ủ tiếp 20 phút ở 37°C. Phản ứng được kết thúc bằng 130 µL dung dịch $\text{Na}_2\text{CO}_3$ 0,2 M.
    • Định lượng: Đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 405 nm ($\text{OD}{405}$) trên máy quang phổ Thermo Genesys 20. Đối chứng âm sử dụng dung dịch DMSO 5%. Tỷ lệ phần trăm ức chế được tính theo công thức: $$\text{Tỷ lệ ức chế (%)} = \left(1 - \frac{\text{OD}{\text{mẫu}}}{\text{OD}_{\text{đối chứng}}}\right) \times 100$$
  • Phương pháp xử lý số liệu: Mọi thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập ($n=3$). Số liệu được tính toán giá trị trung bình và độ lệch chuẩn ($\text{Mean} \pm \text{SD}$) bằng phần mềm Microsoft Excel 2016. Giá trị nồng độ ức chế 50% enzyme ($\text{IC}_{50}$) được xác định thông qua mô hình hồi quy phi tuyến trên phần mềm GraphPad Prism 8.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương 1 hệ thống hóa các cơ sở lý luận về bệnh học đái tháo đường, phân loại đái tháo đường (type 1, type 2, đái tháo đường thai kỳ, LADA và các thể chuyên biệt khác) theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) và châu Âu. Tác giả phân tích chi tiết cấu trúc, chức năng sinh học của enzyme $\alpha$-glucosidase trong quá trình hấp thu đường tại ruột non, cơ chế dược lý của các nhóm thuốc ức chế $\alpha$-glucosidase trong lâm sàng và các tác dụng không mong muốn phổ biến.

Chương này cũng tổng quan về đặc điểm hình thái học, cấu trúc phân loại của địa y nói chung và chi Graphis nói riêng (họ Graphidaceae). Đồng thời, tác giả tổng hợp tình hình nghiên cứu trong nước và quốc tế về các hoạt chất có khả năng ức chế $\alpha$-glucosidase phân lập từ thực vật và địa y, chẳng hạn như các hợp chất methyl orsellinate, tinctorin B từ địa y Parmotrema tinctorum, các dẫn xuất dịch chiết từ Graphis ajarekarii, Flemingia macrophylla, Orthosiphon stamineus, Psidium guajava, và Momordica charantia. Ngoài ra, chương 1 phân tích các công bố về ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng khoáng, cơ chất đường, pH và nhiệt độ đến tốc độ tăng trưởng sinh khối và sự hình thành các chất biến dưỡng thứ cấp ở nấm cộng sinh địa y khi nuôi cấy in vitro.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết danh mục trang thiết bị (nồi hấp vô trùng ALP, tủ sấy Memmert, máy cô quay chân không Heidolph, máy lắc Gerhardt, máy đo quang phổ Thermo Genesys 20, micropipette Scilogex) và hóa chất thí nghiệm (chất ức chế chuẩn đối chứng dương acarbose, cơ chất $p$-NPG, enzyme $\alpha$-glucosidase, ethyl acetate 99,5%, DMSO, các muối đệm phosphate).

Tác giả mô tả chi tiết quy trình bố trí các nghiệm thức nuôi cấy nấm Graphis sp. trên môi trường Sabouraud có biến đổi các yếu tố dinh dưỡng và điều kiện vật lý:

  • Khảo sát nguồn carbon: D-glucose (đối chứng), mannitol, sorbitol, sucrose (đều sử dụng nồng độ 40 g/L).
  • Khảo sát pH: pH 5, pH 6 (đối chứng), pH 7.
  • Khảo sát nhiệt độ: 18°C, 24°C (đối chứng), 30°C.

Chương này cũng chuẩn hóa quy trình thu hoạch sinh khối ở các mốc thời gian 6, 8, 10 tuần, quy trình ngâm chiết thu hồi cao thô ethyl acetate và quy trình định lượng hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase trên đĩa 96 giếng.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được từ quá trình nuôi cấy, tạo cao và thử hoạt tính sinh học:

  1. Đặc điểm sinh trưởng và tạo cao: Sợi nấm Graphis sp. phát triển trên môi trường Sabouraud tạo khuẩn lạc hình tròn, bề mặt lồi, ban đầu có màu đỏ. Sau khoảng 1 tuần nuôi cấy, sợi nấm tiết dịch màu đỏ ra môi trường xung quanh, bề mặt xuất hiện các lỗ nhỏ li ti, thạch môi trường mất nước và co lại. Kích thước khuẩn lạc sau 6, 8 và 10 tuần nuôi cấy ở các nghiệm thức không có sự chênh lệch lớn. Tổng cộng 27 mẫu cao thô ethyl acetate đã được tạo thành từ các điều kiện nuôi cấy tương ứng.
  2. Ảnh hưởng của nguồn carbon: Cao chiết ethyl acetate từ sinh khối nấm nuôi trên môi trường Sabouraud chứa glucose ở mốc 6 tuần thể hiện tỷ lệ ức chế $\alpha$-glucosidase đạt mức cao nhất ($70,72 \pm 1,32%$). Khi kéo dài thời gian nuôi cấy lên 8 tuần và 10 tuần trên môi trường glucose, hoạt tính giảm mạnh (lần lượt còn $8,80 \pm 0,51%$ và $5,39 \pm 0,34%$). Các nguồn carbon thay thế (sucrose, mannitol, sorbitol) cho tỷ lệ ức chế rất thấp hoặc không thể hiện hoạt tính ở hầu hết các mốc thời gian.
  3. Ảnh hưởng của độ pH: Nghiệm thức môi trường pH 6 ở mốc 6 tuần cho tỷ lệ ức chế enzyme cao nhất ($70,72 \pm 1,32%$). Ở môi trường pH 5, hoạt tính dao động ở mức thấp ($7,37 \pm 1,19%$ đến $9,53 \pm 0,72%$). Ở môi trường pH 7, hoạt tính ức chế tăng dần theo thời gian nuôi cấy, đạt $4,91 \pm 0,00%$ (6 tuần), $14,36 \pm 0,12%$ (8 tuần) và $24,42 \pm 1,13%$ (10 tuần).
  4. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nghiệm thức nuôi cấy ở 24°C trong 6 tuần cho tỷ lệ ức chế tối ưu ($70,72 \pm 1,32%$). Nghiệm thức 18°C ở 6 tuần đạt tỷ lệ ức chế $48,66 \pm 0,67%$, sau đó giảm xuống $15,39 \pm 0,87%$ (8 tuần) và $11,49 \pm 0,75%$ (10 tuần). Nghiệm thức 30°C ở 6 tuần đạt tỷ lệ ức chế $64,58 \pm 5,88%$, nhưng giảm xuống $3,23 \pm 0,00%$ (8 tuần) và $10,86 \pm 0,85%$ (10 tuần).
  5. Xác định giá trị $\text{IC}_{50}$: Mẫu cao chiết tối ưu (môi trường Sabouraud, nguồn carbon glucose, pH 6, nhiệt độ 24°C, thời gian 6 tuần) được khảo sát ở dãy nồng độ từ 3,125 đến 800 µg/mL. Hoạt tính ức chế tăng tỷ lệ thuận theo nồng độ cao chiết (đạt $98,25%$ ở 800 µg/mL). Phương trình đường cong liều – đáp ứng xác định được giá trị $\text{IC}_{50}$ của cao chiết nấm Graphis sp. là $90,18 \pm 5,70\text{ }\mu\text{g/mL}$.

Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm tổng hợp

Các kết quả khảo sát tỷ lệ phần trăm ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase của các mẫu cao chiết ethyl acetate nấm Graphis sp. (nồng độ thử nghiệm 200 µg/mL) được tổng hợp trong bảng dưới đây:

Yếu tố khảo sát Nghiệm thức Tỷ lệ ức chế sau 6 tuần (%) Tỷ lệ ức chế sau 8 tuần (%) Tỷ lệ ức chế sau 10 tuần (%)
Nguồn carbon D-glucose $70,72 \pm 1,32$ $8,80 \pm 0,51$ $5,39 \pm 0,34$
Sucrose $7,38 \pm 0,66$ $10,50 \pm 1,17$ $6,93 \pm 0,56$
Mannitol / Sorbitol Không đáng kể Không đáng kể Không đáng kể
Độ pH pH 5 $7,66 \pm 0,00$ $7,37 \pm 1,19$ $9,53 \pm 0,72$
pH 6 $70,72 \pm 1,32$ $8,80 \pm 0,51$ $5,39 \pm 0,34$
pH 7 $4,91 \pm 0,00$ $14,36 \pm 0,12$ $24,42 \pm 1,13$
Nhiệt độ 18°C $48,66 \pm 0,67$ $15,39 \pm 0,87$ $11,49 \pm 0,75$
24°C $70,72 \pm 1,32$ $9,80 \pm 1,03$ $21,28 \pm 0,72$
30°C $64,58 \pm 5,88$ $3,23 \pm 0,00$ $10,86 \pm 0,85$

Thông số ức chế tối ưu:

  • Điều kiện nuôi cấy tối ưu: Môi trường Sabouraud (D-glucose 40 g/L, peptone 10 g/L, agar 15 g/L), pH 6, nhiệt độ nuôi 24°C, thời gian nuôi 6 tuần.
  • Tỷ lệ ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase cực đại: $70,72 \pm 1,32%$.
  • Nồng độ ức chế bán tối đa ($\text{IC}_{50}$): $90,18 \pm 5,70\text{ }\mu\text{g/mL}$.

Đóng góp học thuật và kiến nghị

  • Đóng góp của đề tài: Khóa luận cung cấp dẫn liệu thực nghiệm về khả năng sinh tổng hợp hoạt chất ức chế $\alpha$-glucosidase của chủng nấm cộng sinh địa y Graphis sp. phân lập tại Việt Nam khi nuôi cấy in vitro. Nghiên cứu đã xác định được tổ hợp điều kiện môi trường tối ưu (carbon glucose, pH 6, 24°C, thu hoạch ở tuần thứ 6) để thu nhận sinh khối có hoạt tính sinh học cao nhất.
  • Kiến nghị của tác giả: Tiếp tục nghiên cứu sâu về thành phần hóa học của sinh khối nấm cộng sinh địa y Graphis sp. nhằm phân lập, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất nguyên chất chịu trách nhiệm cho hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Nghiên cứu chỉ mới thực hiện đánh giá hoạt tính trên mẫu cao chiết thô ethyl acetate toàn phần, chưa tiến hành phân đoạn chiết xuất chi tiết hoặc cô lập các đơn chất tinh khiết. Đánh giá hoạt tính mới dừng lại ở quy mô in vitro sử dụng enzyme thương mại nguồn gốc từ nấm men Saccharomyces cerevisiae, chưa kiểm tra trên hệ enzyme của động vật có vú hoặc mô hình in vivo.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Khảo sát bổ sung các yếu tố dinh dưỡng khác (nguồn nitơ hữu cơ/vô cơ, tỷ lệ C/N, các vi lượng ion kim loại).
    • Chiết xuất phân đoạn định hướng hoạt tính sinh học (bioassay-guided fractionation) kết hợp các phương pháp phổ nghiệm (NMR, MS) để nhận diện cấu trúc hoạt chất.
    • Đánh giá độc tính tế bào và thử nghiệm hạ đường huyết trên mô hình động vật thực nghiệm.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Sinh học, Công nghệ sinh học, Hóa sinh học, Vi sinh vật học và Hóa thực vật:

  • Nội dung phương pháp luận: Cung cấp quy trình chi tiết về kỹ thuật phân lập, cấy truyền và duy trì sợi nấm cộng sinh địa y trong điều kiện nhân tạo.
  • Thiết kế thí nghiệm vi sinh: Cung cấp phương pháp thiết kế các công thức môi trường Sabouraud biến tính để khảo sát động học tích lũy hoạt chất sinh học theo thời gian.
  • Quy trình thử nghiệm enzyme: Cung cấp giao thức chuẩn hóa thử nghiệm ức chế $\alpha$-glucosidase trên đĩa 96 giếng và phương pháp xử lý số liệu xác định $\text{IC}_{50}$ bằng phần mềm chuyên dụng.

Câu hỏi thường gặp

1. Nấm cộng sinh địa y Graphis sp. trong nghiên cứu này có nguồn gốc và mã số định danh như thế nào?
Chủng nấm mang mã số UE-MY08, được phân lập từ mẫu địa y Graphis sp. (mã số lưu trữ UE-L014) thu thập tại tỉnh Trà Vinh vào tháng 3/2023. Mẫu địa y do TS. Võ Thị Phi Giao (Khoa Sinh học – Công nghệ Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM) định danh.

2. Điều kiện nuôi cấy nào mang lại hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase cao nhất cho chủng nấm Graphis sp.?
Hoạt tính ức chế cao nhất đạt được khi nấm được nuôi cấy trên môi trường Sabouraud chứa nguồn carbon là D-glucose (40 g/L), độ pH 6, nuôi ở nhiệt độ 24°C trong thời gian 6 tuần (tỷ lệ ức chế đạt $70,72 \pm 1,32%$).

3. Giá trị $\text{IC}_{50}$ của cao chiết nấm Graphis sp. ở điều kiện tối ưu là bao nhiêu?
Cao chiết ethyl acetate từ sinh khối nấm nuôi ở điều kiện tối ưu (Sabouraud, glucose, pH 6, 24°C, 6 tuần) có giá trị $\text{IC}_{50}$ đạt $90,18 \pm 5,70\text{ }\mu\text{g/mL}$, được tính toán qua phương trình hồi quy phi tuyến trên phần mềm GraphPad Prism 8.

4. Khi nuôi cấy nấm Graphis sp. trên môi trường Sabouraud, khuẩn lạc có những đặc điểm hình thái và biến đổi nào?
Khuẩn lạc nấm có dạng hình tròn, bề mặt lồi lên trên và ban đầu có màu đỏ. Sau khoảng 1 tuần nuôi cấy, sợi nấm tiết ra chất dịch màu đỏ làm đổi màu môi trường thạch xung quanh, bề mặt khuẩn lạc xuất hiện nhiều lỗ nhỏ li ti và môi trường thạch co lại do mất nước.

5. Hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase của nấm Graphis sp. có biến thiên tuyến tính theo thời gian nuôi cấy không?
Hoạt tính ức chế không tỷ lệ tuyến tính với thời gian nuôi cấy. Ở hầu hết các nghiệm thức tối ưu (môi trường glucose, pH 6, 24°C), hoạt tính đạt đỉnh cao nhất ở tuần thứ 6, sau đó giảm mạnh ở tuần thứ 8 và tuần thứ 10.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Thị Hoa Quyên đã khảo sát thành công ảnh hưởng của nguồn carbon, độ pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase của chủng nấm cộng sinh địa y Graphis sp. (UE-MY08). Kết quả thực nghiệm xác định môi trường Sabouraud bổ sung D-glucose, duy trì ở pH 6, nhiệt độ 24°C và thu hoạch ở tuần thứ 6 là điều kiện tối ưu, cho tỷ lệ ức chế đạt $70,72 \pm 1,32%$ và giá trị $\text{IC}_{50}$ đạt $90,18 \pm 5,70\text{ }\mu\text{g/mL}$. Đây là cơ sở khoa học quan trọng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo về phân lập và tinh sạch hoạt chất hỗ trợ điều trị đái tháo đường từ nguồn nấm cộng sinh địa y tại Việt Nam.