CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP ETHYLENE TRONG RAU QUẢ 1. Ethylene và cơ chế sinh tổng hợp ethylene 1. Vài nét về ethylene Ethylene là hydrocacbon đơn giản đầu tiên trong dãy hydrocacbon chưa no.
Ethylene có trọng lượng phân tử là 28,05 với công thức cấu tạo là CH2 = CH2. Ở điều kiện thường, nó là một chất khí không màu, có mùi ete nhẹ. Phân tử ethylene có ái lực đáng kể với lipid, tan kém ở trong nước, tan tốt ở trong rượu và rất tốt trong ete (Nguyễn Quang Thạch và cs, 1999) [18]. Ethylene có thể được sản xuất từ các nguồn tự nhiên như cây trồng và các sản phẩm của cây trồng (hoa, quả) hay từ các nguồn nhân tạo như sự đốt cháy.
Trong cây trồng, ethylene được tổng hợp với một lượng nhỏ từ các quá trình trao đổi chất ở tất cả các mô khác nhau của cây rồi được khuếch tán đến các cơ quan, bộ phận khác nhau của cây dưới dạng hợp chất ACC (acid 1-aminocyclopropane-1-carboxylic). Tại mọi nơi trong cây trồng, ACC có thể được chuyển hóa thành ethylene và gây ảnh hưởng đến sinh lý phát triển của cây cho dù vị trí đó ở xa nơi sản sinh ra ACC (Nguyễn Quang Thạch và cs, 1999) [18]. Ethylene là một hormone tự nhiên liên quan đến quá trình sinh trưởng, phát triển, chín và già hóa của thực vật (Nguyễn Quang Thạch và cs, 1999) [18]. Vì vậy, muốn kéo dài thời gian bảo quản rau quả tươi, cần phải tìm các biện pháp kỹ thuật ức chế quá trình tổng hợp ethylene trong quả hoặc sử dụng các chất ức chế tác động của ethylene nhằm làm chậm quá trình chín, từ đó kéo dài thời hạn bảo quản của rau quả sau thu hoạch.
Cơ chế sinh tổng hợp ethylene Theo Capitani và cs (1999), ethylene là tín hiệu biểu đạt cho hoạt động của nhiều enzyme khác nhau dẫn đến sự thay đổi về màu sắc, hương vị và trạng thái của quả. Vì vậy, có thể xem ethylene là chất xúc tác sinh học quan trọng cho nhiều quá trình sinh lý, sinh hóa xảy ra trong cơ thể thực vật [52]. Đường hướng sinh tổng hợp ethylene đã được Yang và Edward phát hiện vào năm 1984 [146], thể hiện qua sơ đồ hình 1. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 4 S COO- H3 C NH3+ L-Methionine SAM synthase O N HN CH3 N S+ COO- H2 N N O NH3 + OH OH S-adenosyl methionine (SAM) ACC synthase ACC - N - malonyl O H2 C + - transferase H COO- NH3 H2 C N C C H2 C COO- H2 C COO- 1-aminocyclopropane-1- Malonyl ACC carboxylic acid (ACC) (MACC) ½ O2 ACC oxydase CO2 + HCN + H2O H2 C CH2 Ethylene Hình 1.
Sơ đồ sinh tổng hợp ethylene (Yang và Edward, 1984) [146] Trong cây trồng, quá trình sinh tổng hợp ethylene được bắt đầu từ acid amin L- methionine (MET) và được tiến hành thông qua hai hợp chất trung gian chính, đó là S- adenosyl methionine (SAM) và ACC. Từ MET chuyển hoá thành SAM nhờ tác dụng xúc tác của enzyme SAM synthase. Từ SAM chuyển hóa theo 2 con đường khác nhau: một phần tổ hợp lại acid amin MET để tiếp tục quá trình sinh tổng hợp trong cơ thể sinh vật, một phần chuyển hóa thành ACC nhờ tác dụng xúc tác của enzyme aminocyclopropane carboxylate synthase (ACC synthase). Khi quả còn xanh, con đường hình thành trở lại MET xảy ra mạnh và sự hình thành hợp chất ACC là yếu hơn.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 5 Quá trình này sẽ diễn ra ngược lại khi quả chín dần. Từ ACC chuyển hoá thành ethylene nhờ tác dụng xúc tác của enzyme aminocyclopropane carboxylate oxydase (ACC oxydase) (Bleecker và cs, 1988) [48]. Như vậy trong quá trình sinh tổng hợp ethylene từ acid amin MET, hoạt lực của hai enzyme ACC synthase và ACC oxydase đóng vai trò rất quan trọng. Nếu có tác động của các biện pháp kỹ thuật nhằm chống lại sự hình thành ACC, chẳng hạn như sử dụng chất kháng ethylene (aminoethoxyvinylglycine (AVG), auxin, xytokinin…) thì chất này sẽ có tác dụng ức chế sự tổng hợp hay hoạt động của enzyme ACC synthase (Nguyễn Quang Thạch và cs, 1999) [18].
Do đó, quá trình chuyển hoá từ SAM để tạo thành hàm lượng ACC thấp (chất tiền ethylene). Chính vì vậy, hàm lượng ethylene tạo thành thấp, ứng dụng tính chất này để kéo dài thời gian bảo quản bơ. Một hướng thực hiện khác theo con đường sử dụng khả năng chuyển hóa của enzyme ACC-N-malonyltransferase để hàm lượng ACC tạo thành thấp. Khi trong môi trường có mặt enzyme ACC-N-malonyltransferase thì enzyme này có thể làm đổi hướng đi từ ACC đến ethylene để tạo ra một dẫn xuất kết hợp, đó là Malonyl ACC (MACC).
MACC được coi là một sản phẩm không hoạt động, bị cô lập ở trong không bào và chỉ có thể biến đổi trở lại ACC dưới những điều kiện phi sinh lý học. Bên cạnh đó, oxy giữ vai trò quan trọng trong quá trình chuyển ACC thành ethylene. Đây chính là cơ sở cho việc bảo quản rau quả tươi trong môi trường kín (thiếu O2) hay trong khí quyển điều chỉnh (Nguyễn Quang Thạch và cs, 1999) [18]. Tuy nhiên, các biện pháp trên chỉ có tác dụng ức chế sự hình thành ethylene nội sinh, mà không thể chống lại được tác động của ethylene ngoại sinh.
Gần đây, một hợp chất đã chứng tỏ khả năng hữu hiệu của nó trong việc kìm hãm sự chín ở nhiều loại quả do ethylene nội sinh và ngoại sinh gây ra, đó là 1-methylcyclopropene (1-MCP) (Ming và cs, 2006) [104]. Các enzyme chính tham gia vào sinh tổng hợp ethylene 1. Enzyme aminocyclopropane carboxylate synthase ACC synthase là một enzyme xúc tác quá trình tổng hợp ACC (một tiền chất của ethylene) từ SAM và đồng thời tách nhóm metylthio (CH3S-) ra khỏi sự chuyển hóa trên (Jobling và cs, 2003) [80]. ACC synthase có khối lượng phân tử từ 40 - 50 kDa (Acaster và Kende, 1983) [32] và pH tối thích vào khoảng 8,5 (Boller và cs, 1979) [49].
ACC synthase được sản sinh từ một số stress trong môi trường bao gồm các stress cơ học, sự hạn hán, sự làm lạnh… (Yang, 1989) [147]. Do ACC synthase thường không bền và có nồng độ thấp nên việc phân lập và mô tả đặc tính của enzyme này trở nên khó khăn (Kevin và cs, 2002) [85]. Hoạt lực của PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 6 enzyme này cũng được tìm thấy trong quả táo, quả bơ, quả dưa chuột và quả cà chua (Abeles và cs, 1992) [31]. Enzyme aminocyclopropane carboxylate oxydase Enzyme ACC oxydase là một enzyme mang hoạt tính sinh học, có tác dụng xúc tác cho sự chuyển hóa ACC thành ethylene.
Hoạt lực của enzyme này đòi hỏi phải có chất cảm ứng là ion Fe2+ (Kende, 1993) [84]. Đã có rất nhiều nhà khoa học cố gắng thử phân lập và mô tả đặc tính của enzyme này nhưng rất khó khăn để có thể thực hiện được do ACC oxydase tồn tại ở nồng độ thấp và dễ bị phân hủy (Abeles và cs, 1992) [31]. Theo Moya-León và John (1994) [106], enzyme ACC oxydase xúc tác cho phản ứng sau: ACC oxydase ACC + ascorbate + Fe2+ + HCO3− + O2 C2H4 + HCN + CO2↑+ 2H2O [1.1] Trong đó, sự oxy hóa của 2 electron của ACC đòi hỏi phải có Fe2+, ascobate và CO2. Các sản phẩm tạo thành là ethylene và cyanuaformic (chất này sau đó phân hủy thành HCN và CO2) (Abeles và cs, 1992) [31].
Các nhà khoa học cũng đã chỉ ra rằng không chỉ có enzyme ACC oxydase mà các enzyme khác như lypoxygenase và peroxydase cũng có tác dụng chuyển hóa ACC thành ethylene khi có mặt các nhân tố phụ khác. Tuy nhiên, chỉ enzyme ACC oxydase là có tính đặc hiệu (Abeles và cs, 1992) [31]. ACC oxydase có cấu trúc bậc cao và định vị ở màng tế bào (Kevin và cs, 2002; Liberman, 1975) [85], [88]. Hoạt lực của enzyme ACC oxydase trên màng nguyên sinh chất và trên màng không bào là như nhau (Bouzayen và cs, 1990) [50].
Tuy nhiên, ACC oxydase trên màng nguyên sinh chất sẽ chuyển đổi ACC thành ethylene nhanh và nhạy hơn dẫn đến sự thẩm thấu cao hơn so với ACC oxydase trên màng không bào. Trong một vài loại cây trồng thì hàm lượng của ACC oxydase trên cả 2 màng là như nhau trong khi đó ở các cây trồng khác chỉ có một loại trội hơn. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực enzyme 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng của enzyme.
Nhiệt độ tăng, tốc độ phản ứng tăng. Khi nhiệt độ tăng tới một mức độ nào đó sẽ có tác dụng ngược lại, làm giảm vận tốc phản ứng do enzyme bị biến tính bởi nhiệt. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 400C - 500C.
Nhiệt độ này của mỗi enzyme là không giống nhau. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính của enzyme sẽ bị giảm. Khi đó enzyme không còn khả năng phục hồi hoạt tính (Đỗ Thị Bích Thủy, 2011) [20]. Thí nghiệm của Renar (2003) cho thấy hoạt lực của enzyme ACC oxydase trong quả xoài PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.com to remove the waterma 7 “Keitt” tăng đáng kể sau khi quả được xử lý nước nóng ở 460C trong 90 phút (Bender và cs, 2003) [39].
Ảnh hưởng của pH pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme. pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu hoặc trung tính, chỉ có một số enzyme có pH tối thích nằm trong vùng acid mạnh hoặc kiềm mạnh. pH có ảnh hưởng nhiều đến vận tốc phản ứng của enzyme do trung tâm hoạt động của enzyme gồm các nhóm có chức năng ion hóa, nếu thay đổi pH của môi trường sẽ ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa của chúng (Đỗ Thị Bích Thủy, 2011) [20].
Theo McGarvey và Christoffersen (1992), enzyme ACC oxydase trong quả bơ có pH tối thích khoảng 7,2 - 7,5 và hoàn toàn bị bất hoạt khi pH < 6 [100]. Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme gọi là các chất hoạt hóa. Chúng có bản chất hóa học rất khác nhau, có thể là các ion kim loại, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp. Tuy nhiên, các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng ở một nồng độ nhất định.
Vượt quá nồng độ này, chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme.