CHƯƠNG 1: TONG QUAN TÀI LIEU 1. Vi khuẩn lactic và quá trình lên men 1. Đặc điểm chung của hệ vi khuẩn lactic Thuật ngữ vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria — LAB) dau tién duoc str dụng dé chi những vi sinh vật có nguén gốc từ sữa và sau đó được mở rộng dé chi những vi khuẩn từ thực phẩm lên men. Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae.
Các loài vi khuẩn thuộc nhóm này có đặc điểm sinh thái khác nhau, nhưng đặc tính sinh lý tương đối giống nhau. Tat cả đều có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, hau hết không di động, không sinh bào tử và ky khí tùy tiện. Chúng không chứa cytochrome và enzyme catalase, tuy nhiên chúng vẫn sinh trưởng khi có oxy. LAB thu nhận năng lượng nhờ quá trình phân giải carbonhydrate, tạo ra acid lactic như là sản phẩm chính của quá trình trao đôi chất và sinh sản băng hình thức phân đôi tế bào.
Acid lactic sinh ra có thể ở dạng D(-), L(+) hay DL. Đa số chúng lên men được mono và disaccharide, một số không lên men được saccharose và số khác không lên men được maltose. Cac LAB không có kha năng lên men tinh bột và các polysaccharide khác (chỉ có loài L. delbruckii là đồng hóa được tinh bột).
Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều loài khác nhau: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus và Streptococcus. Ngày nay người ta bỗ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc loài Bifidobacterium. Căn cứ vào hình thái tế bào vi khuẩn có thể chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm: hình que và hình cầu. Nhóm hình que rất phố biến ở vi khuẩn lactic, từ dạng hình que ngăn (0,5 — 0.7 um) đến hình que dài (3 — 8 pm).
Các tế bào có thé đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi. Nhóm hình cau có dạng tế bào thay đối từ hình cau đến hình oval, đường kính khoảng 0,5 — 1,5 pm. Các tế bào hình cầu xếp thành từng cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng tạo acid khác nhau và sức chịu đựng acid cũng khác nhau.
Đa số các trực khuẩn lactic tạo thành acid cao hơn (khoảng 2 — 3,5 %) so với liên cầu khuẩn (khoảng 1 %). Các trực khuẩn này có thé phát triển được ở pH = 3,8 — 4; còn cầu khuẩn không thé phát triển được ở môi trường này. Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn lactic ở vùng pH = 5,5 — 5,8. Các vi khuan lactic ưa 4m có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 25 — 35 °C, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối ưu là 40 — 45 °C, loài ưa lạnh có thể phát triển được ở nhiệt độ tương đối thấp (khoảng 5 °C hoặc thấp hơn).
Khi gia nhiệt tới 60 — 80 °C hau hết chúng bị chết sau 10 — 30 phút. LAB là những vi sinh vật có nhu cầu dinh dưỡng cao. Dé sinh trưởng bình thường, ngoài nguồn carbon, chúng còn cần nito, một phần dưới dang các acid amin, một số các vitamin, các chất sinh trưởng, và các chất khoáng. Chúng không thé phát triển được trong môi trường có thành phan đơn giản như glucose và NH,* như một số loài khác.
Vì thế, người ta phải cho vào môi trường một số chất giàu định dưỡng như cao nam men, cao thịt, các loại đường. đê chúng có thê lên men. LAB có hoạt tinh protease, chúng phân hủy được protein của sữa tới các peptide và acid amin. Hoạt tính này ở các loài có khác nhau, thường trực khuẩn là cao hơn.
Chúng có thé tôn tại trong môi trường khô hạn, có thể chịu được hàm lượng côn trong môi trường từ 10 — 15 %, chịu được nồng độ CO, và một số trực khuẩn bền với NaCl tới 7 — 10 %. Ngoài ra, một số loài cũng có khả năng tạo màng nhây, một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh và làm thối rữa thực phẩm. Bên cạnh đó, LAB còn có khả năng sản sinh ra các chat kháng khuẩn gọi là bacteriocin — được ứng dụng nhiễu trong y học cũng như trong bảo quản thực phẩm. Nhóm vi khuẩn lactic là nhóm vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng nhất trong ngành công nghiệp sữa, thực phẩm lên men truyền thống, y học (sản xuất men tiêu hóa) và trong công nghiệp (dùng để ủ thức ăn gia súc.
LAB là vi sinh vật công nghiệp với những ưu điểm như: không sinh độc tổ hay sản phâm gây độc, không gây bệnh do được sử dụng chung với thực phẩm, phát triển nhanh giúp quá trình lên men ngan, lên men được nhiều loại cơ chat rẻ tiền. Sự phát triển của chúng sẽ giúp ngăn cản sự hư hỏng trong thực phẩm [1, 2, 3, 4]. Một sô đặc diém của các vi sinh vật sản sinh acid lactic ; Nhiệt độtối | Acid được Vị sinh vật | Hình thái học Cơ chât ưu (°C) sản sinh L. bulgaricus Hinh que Lactose, whey 45 —50 Racemic L.
delbrueckii Hinh que Glucose 45 — 50 L(+) Đường pentose, gỗ L. brevis Hinh que 30 Racemic da thuy phan L. casei Hinh que Whey, lactose 30 —50 L(+) Duong pentose, L. plantarum Hinh que 30 Racemic dung dich sulfite L.
leichmannii Hinh que Sucrose, glucose 30 D(-) S. lactis Cau khuân Lactose, whey 35 L(+) Hinh que, tao B. coagulan Glucose, lactose 45 — 50 L(+) bao tu R. oryzae Nam méc Glucose, tinh bot 30 L(+) [5] 1.
Vi khuẩn Lactobacillus casei Lactobacillus casei là một trong nhiều loài vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus; là một loại vi khuân Gram (+), hình que, ưa nhiệt trung bình, không sinh bào tử, không có khả năng di động, ky khí tùy tiện, không chứa các cytochrome và sinh năng lượng thông qua quá trình lên men. Hau hết các chủng L. casei đều có thể lên men đường galactose, glucose, fructose, mannose, mannitol, N- acetylglucosamine va tagatose. Kha năng lên men lactose thì ít phố biến hon trong các chủng phân lập từ nguồn nguyên liệu thực vật so với từ phô mai va đường tiêu hóa của con người.
Các điều kiện của quá trình lên men như pH, nhiệt độ, nông độ oxy, môi trường phát triển và một số chất trung tính đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng của L. Khoảng pH tối ưu cho L. casei là từ 5,5 — 5,8; chúng có thé bắt đầu phát triển ở nhiệt độ 15 °C và không quá 45 °C. Hợp chat quan trọng nhất mà L.
casei sản xuat ra là acid lactic; nó có thê được sử dụng dé làm phô mai và sữa chua, làm giảm nông độ cholesterol, tang cường đáp ứng miên dịch, làm giảm hiện tượng tiêu chảy, giảm bớt sự không dung nạp đường lactose, ức ché các tác nhân gây bệnh đường ruột. Lactobacillus casei có thê được tìm thay trong nhiều môi trường khác nhau; như các sản phẩm sữa lên men và sữa tươi, trong đường ruột và hệ thống sinh sản của người và động vật và các sản phẩm từ thực vật tươi và lên men. casei đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh hệ thống miễn dịch của đường tiêu hóa. Chúng sẽ liên kết với bề mặt của các tế bào dạ dày và giúp kích thích đường ruột.
Đề chồng lại các tác nhân gây bệnh có thé xâm nhập vào hệ thống miễn dịch, L. casei có thé cạnh tranh về chất đinh dưỡng hoặc vi trí bám dính chồng lại các tác nhân gây bệnh. Vi khuẩn này cũng có thể ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn gây bệnh bằng cách giảm độ pH thông qua việc sản xuất các acid hữu cơ như acetic, propionic, acid lactic hoặc bằng cách tao ra hydrogen peroxide. casei có thé tiết ra các bacteriocin, các peptide kháng khuẩn dưới dang cation, các phân tử vừa ưa nước vừa ky nước để loại bỏ các tác nhân gây bệnh trong cơ thê.
Lactobacillus casei được xem là không gây bệnh và an toàn. Tuy nhiên, một số trường hợp nhiễm trùng huyết, viêm màng não và nhiễm trùng khu trú ở các cơ quan đã được báo cáo [5, 6]. Cơ chế của qua trình lên men lactic Cơ chế của quá trình lên men lactic là hoạt động trao đối chất của vi khuẩn lactic. Đó là quá trình chuyển hóa ky khí từ đường tạo ra acid lactic, diễn ra trong tế bao vi khuân.
Tuy vào loại enzyme có trong vi khuân lactic, con đường phân giải va tính chat của các san phâm tao ra cua quá trình lên men, người ta phân chia thành hai loại: a) Lên men lactic đồng hình Acid lactic là sản phẩm chính của quá trình lên men va hàm lượng của nó chiếm tỷ lệ vượt trội hơn nhiều so với các sản phẩm phụ khác (90 — 98 % tổng sản phẩm lên men). Sản phẩm phụ là ethanol, acid acetic, CO». Glucose Lactic acid “ ATP NMAD- ` 1 J (9) | > ADP NADH Glucose-6- Pyruvic phosphate acid ATP = (2) (8) W ADP ~ Fructose-6- Phosphoenol phosphate pyruvic acid Z ATP † (3) (7) ¬ > ADP Fructose-1 ,B- 3-Phosphoglyceric diphosphate acid H,PO, a” (4) __ ATP (6) Triose —> 4,3-Diphosphoglyceric phosphate (5) acid Hình 1. Quá trình lên men lactic đồng hình [7] Bản chất của quá trình là đường được chuyển hóa theo sơ đồ Embden- Meyerhof Parnas (con đường EMP) tạo ra acid pyruvic.
Trong tế bao vi khuẩn lactic lên men đồng hình không có đủ enzyme carboxylase nên acid pyruvic không bị phân giải tiếp mà nhận hydro tạo acid lactic. Một phân nhỏ acid pyruvic bị decarboxy hóa thành các sản phẩm phụ như ethanol, acid acetic, CO2. Được dùng trong sản xuất acid lactic và công nghiệp thực phẩm, đặc biệt trong công nghiệp chế biến sữa. Một số chung vi khuẩn tiêu biểu: Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticcus, Lactobacillus thermophilus, Lactobacillus plantanrum |2|.
b) Lên men lactic dị hình Quá trình lên men này khá phức tạp do tạo ra các sản phẩm đa dạng. Hàm lượng acid lactic thu được (chiếm khoảng 40 % tong sản phẩm lên men) không cao hơn nhiêu so với hàm lượng các sản phầm còn lại (acid succinic va ethanol khoảng 20 %, acid acetic khoảng 10 % và các chất khí khoảng 20 %). Phương trình phản ứng tổng quát: 2C6H 1.4 + CO, + Q Givcose ATP ADP Glucose 6-phosphsate NAD~ NADH + tí” S-phosphogiuconic acid NAD NADH + H- co, Ribulose 5-phosphate ] Mylulose S-phosphate Glyceralidehyde 3-phosphate Acety! phosphate 2ADP NAD coA — = P, 2ATP a +H Pyruvate Acetyt CoA NADH + HT” NADH + t4” NAD” NAD + coA Lactate Acetaidehyde NADH + HT NAD* Ethanol Hinh 1. Qua trinh lén men lactic di hinh [8] Vi khuẩn lên men có enzyme decarboxylase dé phân hủy acid pyruvic tao CO, và CH3CHO.
Tuy nhiên, enzyme trên không phân hủy hết acid pyruvic nên một phan acid này chuyền thành acid lactic và acid succinic. Do có nhiều giả thuyết khác nhau, cơ chế chuyển hóa trong lên men lactic dị hình chưa được giải thích đầy đủ.