CHƯƠNG 1. Bệnh tay chân miệng Bệnh tay-chân-miệng là bệnh truyền nhiễm lây từ người sang người, dễ gây thành dịch do vi rút đường ruột thuộc họ Picornaviridae gây ra. Hai nhóm tác nhân gây bệnh thường gặp là Coxsackie virus A16 và Enterovirus 71 (EV71). Bệnh chủ yếu xuất hiện ở trẻ em.
Biểu hiện chính là tổn thương da, niêm mạc dưới dạng phỏng nước ở các vị trí đặc biệt như niêm mạc miệng, lòng bàn tay, lòng bàn chân, mông, gối. Các trường hợp biến chứng nặng thường do EV71 gây ra như viêm não- màng não, viêm cơ tim, phù phổi cấp dẫn đến tử vong [1], [30], [37]. Đặc điểm dịch tễ học 1. Trên thế giới Tại khu vực Châu Á Thái Bình Dương, sau dịch bệnh gây ra ở Australia và Nhật Bản năm 1970, EV71 tiếp tục gây ra các trận dịch nhỏ ở Hồng Kông năm 1985 và Australia năm 1986.
Trong năm 1997 xuất hiện trận dịch lớn do EV71 gây ra ở Sarawak, Malaysia (bảng 1). Tại Sarawak, 2618 trường hợp mắc TCM và 34 trường hợp tử vong được ghi nhận vào tháng 5 và tháng 7 năm 1997. Trận dịch EV71 lớn nhất cho đến nay xảy ra ở Đài Loan, khoảng 1.5 triệu người đã nhiễm bệnh và 405 trường hợp biến chứng thần kinh, 78 ca chết. Năm 2008 tại Trung Quốc có 490.000 trường hợp nhiễm bệnh, 126 trẻ em tử vong; tại tỉnh Anhui hơn 6000 trường hợp mắc TCM và 22 trẻ em tử vong.
Ngoài ra, xuất hiện nhiều trận dịch lớn ở nhiều quốc gia như: Nhật Bản, Sarawark, Đài Loan, Singapore, và Việt Nam theo chu kỳ 2 đến 3 năm (Hình 1) [37]. Ngoài khu vực Châu Á Thái Bình Dương, EV71 tiếp tục lưu hành với mức độ thấp và gây ra các trận dịch nhỏ ở Châu Phi, Châu Âu và Châu Mỹ. Luận văn Thạc sỹ Tổng quan tài liệu -3- Bảng 1: Các phân nhóm EV71 phân lập được ở Châu Á – Thái Bình Dương 1973- 2008 Hình 1: (A) phân bố dịch bệnh TCM và (B) dịch bệnh do EV71 ở Sarawak, Malaysia tháng 3 năm 1998 đến giữa năm 2009 Luận văn Thạc sỹ Tổng quan tài liệu -4- 1. Dịch tễ học bệnh tại Việt Nam Bệnh TCM do virus EV71 được phát hiện đầu tiên năm 2003 qua phân tích 12 mẫu bệnh phẩm từ các bệnh nhi.
Trong số các bệnh nhân bị bệnh TCM, các biến chứng thần kinh và tử vong đa phần do nhiễm virus EV71. Vào năm 2005, tại miền Nam Việt Nam, trong số 411 bệnh nhân bị TCM, 173 (42.1%) trường hợp nhiễm EV71 và 52% do Cosxackie A16. Trong số các bệnh nhân bị nhiễm EV71, 51 trường hợp (29,3%) bị biến chứng thần kinh cấp tính, trong đó 3 trường hợp tử vong (1. Vào năm 2006-2007, trong số 305 bệnh nhân bị biến chứng thần kinh, có 36 (11%) trường hợp nhiễm EV71, trong đó 3 trường hợp tử vong (0.
Trong năm 2008, tại miền Bắc Việt Nam, trong số 88 trường hợp bị bệnh TCM tại 16 tỉnh thành, 9 (10.2%) trường hợp bị nhiễm EV71. Trong năm 2011, số ca bị nhiễm virus EV71 trong tổng số bị bệnh TCM là 1380 (60.01%), số trường hợp tử vong do virus EV71 là 76 ca (3. Năm 2012 số ca mắc bệnh là 152.287 ca, tăng 1,3 lần so với năm 2011 nhưng số ca tử vong giảm (45 ca tử vong). Trong 7 tháng đầu năm 2013, cả nước ghi nhận 46.598 ca bệnh, 18 trường hợp tử vong tại 63/63 tỉnh thành phố (tỷ lệ chết/mắc: 0,04% ).
Số lượng ca bệnh TCM ghi nhận giảm hơn so với cùng kì năm 2012 (giảm khoảng 40%), tuy nhiên vẫn ở mức cao so với năm 2011 [3]. Hình 2: diễn biến dịch bệnh tay chân miệng tại Việt Nam theo thời gian từ năm 2011 đến năm 2013 Luận văn Thạc sỹ Tổng quan tài liệu -5- 2. Phân loại và cấu tạo Enterovirus 71 (EV71) thuộc loài enterovirus tuýp A ở người (HEV-A), chi Enterovirus, họ Picornaviridae. EV71 có kích thước nhỏ (đường kính 30nm), không có màng bao, 20 mặt chứa RNA sợi đơn kích thước khoảng 7.
Mỗi protomer trong vỏ casid virus này chứa một bản sao 4 protein cấu trúc (VP1-VP4), trong đó VP1, VP2 và VP3 ở mặt ngoài, VP4 nằm hoàn toàn bên trong. Toàn bộ các protein cấu trúc mã hóa bởi vùng gen P1. Vùng gen P2 và P3 mã hóa 7 protein phi cấu trúc -2A-2C và 3A-3D [23], [45]. Hình 3: Cấu trúc EV71 và cấu trúc gen của EV71 2.
Dịch tễ học phân tử Qua phân tích sự biến đổi di truyền gen VP1 và VP4 của các chủng EV71 gần đây chỉ ra rằng nhiều nhóm gen của virus này đã lưu hành ở khu vực Châu Á Thái Bình Dương từ năm 1997. EV71 được xác định gồm 3 nhóm A, B và C trong đó nhóm B và C chia thành các phân nhóm B1-B5 và C1-C5. Nhóm A trong đó có chủng BrCr – được phát hiện ở California 1970 nhưng sau đó không phát hiện được ngoài nước Mỹ cho đến 2008. Trận dịch đầu tiên của EV71 ở Sarawak (Maylasia Borneo) năm 1997 do nhóm B3 gây ra.
Sau trận dịch này là trận dịch lớn ở Taiwan năm 1998 do nhóm C2 gây ra, và ở Perth (Australia) năm 1999 do virus thuộc nhóm B3 và C2 gây ra. Năm 2000 ở Singapore, Đài Loan, và Sarawak trận dịch EV71 gây ra chủ yếu bởi virus Luận văn Thạc sỹ Tổng quan tài liệu -6- thuộc nhóm B4. Tại Hàn Quốc EV71 được xác định trong một trận dịch TCM thuộc nhóm C3 [9]. Nhóm B chiếm ưu thế ở Malaysia và Singapore, trong khi nhóm C cũng xuất hiện ở Đông Nam Á đặc biệt ở Trung Quốc và Việt Nam.
Virus nhóm B ban đầu được phân thành B1 và B2, có 12% nucleotide khác nhau ở 2 nhóm này và lưu hành trong những năm 1970 và 1980 (hình 4). Virus nhóm C, ban đầu được phân thành nhóm C1 và C2 đã được xác định vào giữa những năm 1980 (hình 4). Một số nhóm con đã được bổ sung vào nhóm B và C trong 12 năm qua ở khu vực Châu Á Thái Bình Dương (hình 4, bảng 1). Virus thuộc các phân nhóm B3 và B4 lưu hành trong khu vực này kể từ năm 1997.
Phân nhóm B5 phân lập đầu tiên tại Nhật Bản và Sarawak năm 2003 đã gây ra dịch bệnh ở Brunei, Sarawak và Đài Loan năm 2006. Ngoại trừ sự bùng nổ trận dịch ở Sydney năm 1986, phân nhóm C1 đã được phân lập từ các trường hợp lẻ tẻ từ giữa những năm 1980, điều này cho thấy sự lưu hành ở mức độ thấp. Phân nhóm C2 gây ra trận dịch năm 1998, và một trận dịch ở Perth, Autralia năm 1999. Phân nhóm C3 được phân lập ở Nhật Bản vào năm 1994, và tại Hàn Quốc năm 2000.
Phân nhóm C4 lưu hành chủ yếu ở Trung Quốc từ năm 2000 và cũng được báo cáo ở Nhật Bản, Việt Nam và Đài Loan. Phân nhóm C5 đã được tìm thấy ở miền nam Việt Nam và Đài Loan [37]. Luận văn Thạc sỹ Tổng quan tài liệu -7- Hình 4: cây phả hệ di truyền EV71 dựa trên gen VP1 [37] Tại Việt Nam, ban đầu EV71 được xác định thuộc 3 phân nhóm C1, C4 và C5. Phân nhóm C5 xuất hiện đầu tiên vào năm 2003, nổi trội năm 2003-2010 và tiếp tục lưu hành ở khu vực phía Nam cho đến năm 2012.
Phân nhóm C4 lưu hành đầu tiên năm 2004-2005, nổi trội năm 2011-2012 và lưu hành đến năm 2013. Phân nhóm B5 xuất hiện đầu tiên năm 2011 và nổi trội từ năm 2013 đến nay [39]. Quá trình nhân bản Giống như hầu hết các enterovirus khác, chu kỳ sao chép của EV71 tương tự poliovirus [13]. Virus xâm nhập vào tế bào chủ phụ thuộc vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào [25].
Các thụ thể đặc hiệu này bao gồm poliovirus (CD155), 3 integrin (α2β1, αvβ3, v2β6), yếu tố gia tăng phân rã (CD55), thụ thể coxsackievirus-adenovirus và phân tử bám dính nội bào 1. Một số enterovirus sử dụng nhiều hơn một thụ thể để gây nhiễm tế bào chủ. Luận văn Thạc sỹ Tổng quan tài liệu -8- Sau khi EV71 gắn với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, enzym protease phân giải vỏ capsid của virus để giải phóng ARN vào bào tương (1). ARN của virus hoạt động như mARN (2) để phiên mã thành polyprotein lớn duy nhất (3).
Gen P1 làm nhiệm vụ tổng hợp protein cấu trúc VP1, VP2, VP3, VP4 (5). Gen P2 và P3 làm nhiệm vụ tổng hợp protein phi cấu trúc (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D) (6). VPg hoạt động như protein mồi nhằm tạo ra ARN sợi (-) bổ sung cho ARN sợi (+) của virus. Quá trình lắp ráp giữa ARN virus với các protein cấu trúc tạo ra hạt virus hoàn chỉnh (9, 10).
EV71 thoát ra khỏi tế bào sau khi màng tế bào bị phá vỡ hoàn toàn (11) [4], [21], [38] (Hình 5). Hình 5: Cơ chế xâm nhiễm của EV 71 vào tế bào 3. Cấu trúc và chức năng gen VP1 Gen VP1 của EV71 có chiều dài 891 nucleotide mã hóa cho phân tử protein có trọng lượng phân tử 36 kDa với 297 acid amin chứa vùng quyết định kháng nguyên đặc hiệu với IgG, IgM [20], [34], [35]. Protein VP1 chủ yếu tạo thành các đỉnh của vỏ capsid.
Protein VP1 tương tác với thụ thể của tế bào chủ để đưa hạt virus tấn công tế bào đích. Sau khi gắn vào thụ thể đặc hiệu, protein VP1 trải qua những biến đổi hình dạng. Sau đó, hình thành lỗ màng trên bề mặt tế bào chủ, RNA virus được giải phóng và dịch mã trong tế bào chất [46]. Như vậy, chức năng chính của protein VP1 là tiếp xúc với tế bào đích và Luận văn Thạc sỹ Tổng quan tài liệu -9- bắt đầu quá trình tổng hợp gen gây độc.
Đây là protein capsid vừa quyết định kháng nguyên, vừa quyết định tính gây bệnh của virus. Cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về gen VP1 trên thế giới đã được công bố nhằm mục đích tạo vaccine hoặc kít chẩn đoán sớm bệnh TCM do EV71 gây ra [10], [11], [36] [40]. Sản xuất protein tái tổ hợp trong E.coli trong sản xuất protein tái tổ hợp Eschierichia coli là vi khuẩn gram âm, hiếu khí tùy ý, hình que, có kích thước khoảng 0,3-1,0 x 1,0-6,0 µm, di động, được tìm thấy khắp nơi trong tự nhiên. Do chúng có khả năng phát triển rất mạnh (thời gian thế hệ khoảng 20 phút) và nhu cầu dinh dưỡng đơn giản nên được sử dụng trong nghiên cứu và công nghiệp.
Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của E.coli là 37oC, pH 6,0-7,0. Thành phần môi trường tối thiểu để E.coli phát triển là glucose 0,5%, Na2HP04 0,6%, KH2PO4 0,3%, NH4Cl 0,1%, NaCl 0,05%, MgSO4 0,012%, CaCl2 0,001%. Ngoài ra, tùy theo loài E.coli khác nhau mà có những môi trường chọn lọc khác nhau [29].