Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột bởi mucoraceae trong sản xuất rượu truyền thống việt nam

Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột bởi Mucoraceae trong sản xuất rượu truyền thống Việt Nam, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm.

• Tác giả: Lê Thị Quyên
• Người hướng dẫn: PGS.TS Vũ Nguyên Thành
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học
• Đề tài: Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột bởi Mucoraceae trong sản xuất rượu truyền thống Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu về rượu truyền thống
• 1.2. Giới thiệu về họ Mucoraceae
• 1.3. Tình hình nghiên cứu về rượu truyền thống Việt Nam
• 1.4. Giới thiệu về sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS)
• 1.5. Ứng dụng phương pháp HS-SPME GCMS trong phân tích các hợp chất tạo hương của đồ uống
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp phân lập
• 2.2.2. Làm sạch và giữ giống
• 2.2.3. Chụp ảnh hình thái khuẩn lạc, tế bào
• 2.2.4. Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm mốc, nấm men, giả men
• 2.2.5. Phương pháp tinh chế DNA
• 2.2.6. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting
• 2.2.7. Phương pháp điện di
• 2.2.8. Nhuộm gel và đọc kết quả
• 2.2.9. Phương pháp phân loại nấm dựa vào đọc trình tự rDNA
• 2.3. Phân tích hoạt lực enzyme amylase từ các chủng mốc
• 2.4. Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện
• 2.5. Kiểm tra sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường
• 2.6. Lên men rượu từ các chủng mốc và men thuần chọn lọc
• 2.7. Đo độ cồn bằng sôi kế
• 2.8. Phân tích phổ hương của các mẫu rượu gạo chưng cất bằng máy sắc ký khí kết nối khối phổ GCMS
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả phân lập vi nấm từ 15 bánh men
• 3.2. Kết quả hình thái khuẩn lạc, tế bào
• 3.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật PCR-fingerprinting và định danh chủng nấm đại diện dựa vào phân tích trình tự rDNA
• 3.4. Phân tích hoạt lực enzyme amylase bằng DNS
• 3.5. Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện
• 3.6. Kết quả sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường
• 3.7. Kết quả lên men rượu từ các chủng nấm mốc và nấm men thuần
• 3.8. Phân nhóm mẫu rượu dựa trên kết quả các hợp chất bay hơi trong các mẫu rượu thu thập và các mẫu sử dụng chủng thuần
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu thủy phân tinh bột bởi Mucoraceae

Nghiên cứu về thủy phân tinh bột bởi Mucoraceae trong sản xuất rượu truyền thống Việt Nam đang thu hút sự quan tâm lớn. Rượu truyền thống không chỉ là một phần văn hóa mà còn là sản phẩm có giá trị kinh tế cao. Việc hiểu rõ quá trình thủy phân tinh bột sẽ giúp cải thiện chất lượng rượu và tối ưu hóa quy trình sản xuất. Mucoraceae là họ nấm có khả năng thủy phân tinh bột thành đường, đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượu. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cái nhìn sâu sắc về vai trò của Mucoraceae trong sản xuất rượu truyền thống.

1.1. Đặc điểm của rượu truyền thống Việt Nam

Rượu truyền thống Việt Nam có nhiều loại khác nhau, mỗi loại mang hương vị và đặc trưng riêng. Các loại rượu như rượu Làng Vân, rượu Kim Sơn, và rượu Bầu Đá đều có quy trình sản xuất riêng biệt. Sự đa dạng này không chỉ đến từ nguyên liệu mà còn từ phương pháp sản xuất. Việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng rượu là rất cần thiết.

1.2. Vai trò của Mucoraceae trong sản xuất rượu

Họ nấm Mucoraceae có khả năng thủy phân tinh bột thành đường, là bước quan trọng trong quá trình sản xuất rượu. Các chủng nấm thuộc họ này thường được sử dụng trong sản xuất rượu truyền thống. Nghiên cứu cho thấy rằng các enzyme amylase từ Mucoraceae có thể cải thiện hiệu suất đường hóa, từ đó nâng cao chất lượng rượu.

II. Thách thức trong nghiên cứu thủy phân tinh bột

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về thủy phân tinh bột, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc áp dụng các phương pháp này vào sản xuất rượu truyền thống. Một trong những vấn đề chính là sự đa dạng của các chủng nấm và khả năng thủy phân của chúng. Việc lựa chọn đúng chủng nấm có thể ảnh hưởng lớn đến chất lượng rượu. Ngoài ra, điều kiện môi trường như nhiệt độ và pH cũng có thể tác động đến hoạt động của enzyme amylase.

2.1. Đa dạng chủng nấm Mucoraceae

Có nhiều chủng nấm thuộc họ Mucoraceae có khả năng thủy phân tinh bột khác nhau. Việc phân lập và xác định các chủng nấm này là rất quan trọng để tìm ra những chủng có hoạt tính enzyme cao nhất. Nghiên cứu trước đây cho thấy rằng không phải tất cả các chủng nấm đều có khả năng thủy phân tinh bột hiệu quả.

2.2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường

Điều kiện môi trường như nhiệt độ, độ ẩm và pH có thể ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase. Việc tối ưu hóa các điều kiện này sẽ giúp tăng cường hiệu suất thủy phân tinh bột, từ đó nâng cao chất lượng rượu. Nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các điều kiện tối ưu cho từng chủng nấm.

III. Phương pháp nghiên cứu thủy phân tinh bột hiệu quả

Để nghiên cứu hiệu quả quá trình thủy phân tinh bột bởi Mucoraceae, cần áp dụng các phương pháp khoa học hiện đại. Các phương pháp này bao gồm phân lập chủng nấm, xác định hoạt tính enzyme, và phân tích sản phẩm thủy phân. Việc sử dụng các công nghệ như PCR-fingerprinting và sắc ký khí kết nối khối phổ (GC-MS) sẽ giúp xác định chính xác các chủng nấm và sản phẩm tạo ra trong quá trình thủy phân.

3.1. Phân lập và xác định chủng nấm

Phân lập các chủng nấm từ bánh men rượu truyền thống là bước đầu tiên trong nghiên cứu. Các chủng nấm sẽ được xác định bằng phương pháp PCR-fingerprinting để đảm bảo tính chính xác. Việc này giúp tìm ra những chủng nấm có khả năng thủy phân tinh bột tốt nhất.

3.2. Đánh giá hoạt tính enzyme amylase

Hoạt tính enzyme amylase sẽ được đánh giá thông qua các phương pháp định lượng. Các mẫu nấm sẽ được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu và sau đó tiến hành phân tích để xác định khả năng thủy phân tinh bột. Kết quả sẽ giúp xác định chủng nấm nào có hoạt tính cao nhất.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu thủy phân tinh bột

Nghiên cứu về thủy phân tinh bột bởi Mucoraceae không chỉ có giá trị lý thuyết mà còn có ứng dụng thực tiễn trong sản xuất rượu truyền thống. Việc áp dụng các chủng nấm có hoạt tính enzyme cao sẽ giúp cải thiện chất lượng rượu, tăng hiệu suất sản xuất và giảm chi phí. Ngoài ra, nghiên cứu cũng có thể mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm rượu đặc trưng của Việt Nam.

4.1. Cải thiện chất lượng rượu

Việc sử dụng các chủng nấm có khả năng thủy phân tinh bột tốt sẽ giúp nâng cao chất lượng rượu. Các sản phẩm rượu sẽ có hương vị phong phú hơn và đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc cải tiến quy trình sản xuất rượu.

4.2. Tăng hiệu suất sản xuất

Nghiên cứu cũng sẽ giúp tăng hiệu suất sản xuất rượu bằng cách tối ưu hóa quy trình thủy phân tinh bột. Việc này không chỉ giúp tiết kiệm thời gian mà còn giảm chi phí sản xuất. Các nhà sản xuất có thể áp dụng các phương pháp này để nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về thủy phân tinh bột bởi Mucoraceae trong sản xuất rượu truyền thống Việt Nam mở ra nhiều cơ hội mới. Kết quả nghiên cứu sẽ giúp cải thiện quy trình sản xuất rượu, nâng cao chất lượng sản phẩm và đáp ứng nhu cầu thị trường. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành công nghiệp rượu Việt Nam.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa trong việc cải thiện chất lượng rượu mà còn góp phần bảo tồn và phát triển văn hóa rượu truyền thống Việt Nam. Việc hiểu rõ về các chủng nấm và quá trình thủy phân sẽ giúp các nhà sản xuất nâng cao giá trị sản phẩm.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu

Tương lai của nghiên cứu này có thể mở rộng sang các lĩnh vực khác như phát triển các sản phẩm mới từ rượu truyền thống. Việc áp dụng công nghệ hiện đại trong sản xuất rượu sẽ giúp nâng cao giá trị kinh tế và tạo ra những sản phẩm độc đáo cho thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Rượu gạo truyền thống là nét văn hóa ẩm thực đặc trưng và hiện chiếm khoảng 80% tổng sản lượng đồ uống có cồn được tiêu thụ tại Việt Nam. Quy trình chế biến thủ công phụ thuộc chủ yếu vào hoạt động của hệ vi sinh vật tự nhiên trong bánh men, với mật độ dao động từ 10^3 đến 10^6 CFU nấm mốc, 10^3 đến 10^7 CFU nấm men và 10^3 đến 10^6 CFU vi khuẩn lactic trên mỗi gam cơ chất. Trong khi các nền sản xuất rượu danh tiếng ở Châu Á đã sớm định danh vi nấm cốt lõi như loài Aspergillus oryzae trong rượu Sake của Nhật Bản hay Monascus purpureus trong rượu Hong Qu của Trung Quốc, thì tại Việt Nam vẫn chưa có công trình nào xác định chính xác loài nấm mốc giữ vai trò trung tâm trong quá trình đường hóa.

Nghiên cứu của học viên Lê Thị Quyên (chuyên ngành Vi sinh vật học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội phối hợp cùng Viện Công nghiệp Thực phẩm) tập trung giải quyết bài toán kiểm soát chất lượng rượu gạo truyền thống. Mục tiêu cốt lõi là phân lập, định danh phân tử và đánh giá đặc tính sinh học của các chủng nấm mốc thuộc họ Mucoraceae thu thập từ 15 mẫu bánh men tại 8 tỉnh thành miền Bắc (Hà Nội, Bắc Giang, Ninh Bình, Nam Định, Hà Nam, Hưng Yên, Thái Bình, Tuyên Quang) trong năm 2019.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài thể hiện qua việc nâng cao hiệu suất thu hồi sản phẩm. Việc ứng dụng chủng nấm mốc thuần khiết giúp nâng sản lượng cồn đặc từ 180 gam lên đến 340 gam trên 1000 gam gạo nguyên liệu, đồng thời mở ra hướng chuẩn hóa chất lượng và hương vị đồ uống truyền thống Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký khí hiện đại.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết thủy phân tinh bột đa giai đoạn bởi hệ thống enzyme amylase ngoại bào. Trong đó, enzyme alpha-amylase thực hiện phân cắt ngẫu nhiên các liên kết alpha-1,4 glycoside ở phía trong mạch amylose và amylopectin để dextrin hóa cơ chất; beta-amylase thủy phân từ đầu không khử tạo maltose; và gamma-amylase (glucoamylase) cắt liên tiếp các liên kết alpha-1,4 cùng alpha-1,6 ở điều kiện pH tối ưu 3.5 đến 5.5 để giải phóng đường glucose.

Bên cạnh đó, đề tài kết hợp mô hình lên men đồng thời (Simultaneous Saccharification and Fermentation - SSF). Hệ nấm mốc Mucoraceae giữ nhiệm vụ đường hóa tinh bột tạo đường khử, cung cấp cơ chất cho nấm men Saccharomyces cerevisiae chuyển hóa thành ethanol trong môi trường yếm khí. Khung lý thuyết cũng khảo sát hiện tượng ức chế dị hóa (catabolite repression) khi nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy tăng từ 0.5% đến 2.0%, cùng nguyên lý vi chiết pha rắn không gian đầu (HS-SPME) giúp làm giàu các hợp chất hữu cơ bay hơi ở ngưỡng nồng độ siêu vết từ nanogam/L đến microgam/L.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được xây dựng từ cỡ mẫu gồm 15 mẫu bánh men truyền thống thu thập ngẫu nhiên tại 8 vùng sản xuất trọng điểm. Phương pháp chọn mẫu phân tầng theo địa lý làng nghề đảm bảo tính đại diện cho hệ vi sinh vật bản địa. Quá trình phân lập được thực hiện bằng phương pháp pha loãng liên tiếp từ nồng độ 10^-1 đến 10^-6 trên môi trường thạch Malt 2°Bx ở 30°C.

Để phân loại chính xác 101 chủng vi sinh vật thu được, tác giả lựa chọn kỹ thuật PCR-fingerprinting sử dụng mồi vi vệ tinh MST2 (GAC)5. Phương pháp này khuếch đại các đoạn ADN vệ tinh có tính bảo thủ cao, giúp phân nhóm loài nhanh chóng trước khi tiến hành giải trình tự vùng gen ITS (khoảng 600 bp) đối với nấm mốc và vùng D1/D2 rDNA 26S đối với nấm men trên máy GeneAmp 9700. Hoạt lực enzyme amylase được định lượng chính xác bằng phương pháp đo quang phổ DNS ở bước sóng 540 nm sau phản ứng thủy phân 20 phút ở 50°C. Cuối cùng, 32 mẫu rượu chưng cất (gồm 26 mẫu thương phẩm và 6 mẫu lên men từ chủng thuần) được phân tích phổ hương trên hệ thống sắc ký khí khối phổ HS-SPME GC-MS sử dụng cột mao quản Rt-Wax dài 30 m và khí mang Heli với tốc độ dòng 1.2 ml/phút trong thời gian khảo sát năm 2019.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, từ 15 mẫu bánh men ban đầu, nghiên cứu đã phân lập được 101 chủng vi sinh vật bao gồm 73 chủng nấm mốc, 16 chủng nấm men và 12 chủng giả men. Kết quả phân tích trình tự rDNA khẳng định họ Mucoraceae chiếm ưu thế tuyệt đối trong hệ nấm mốc, trong đó loài Rhizopus oryzae chiếm số lượng lớn nhất với 27 trên tổng số 73 chủng (tỷ lệ 36.99%), tiếp theo là Rhizopus microsporus với 26 chủng (tỷ lệ 35.62%), Mucor indicus với 11 chủng (tỷ lệ 15.07%), Mucor circinelloides với 3 chủng và Lichtheimia ramosa với 3 chủng.

Thứ hai, các chủng thuộc loài Rhizopus oryzae thể hiện hoạt lực enzyme amylase ngoại bào vượt trội hoàn toàn. Chủng Rhizopus oryzae MQF 2.4 đạt hoạt lực lên tới 183.72 IU/ml, các chủng đại diện khác đạt từ 59.56 đến 190.01 IU/ml. Mức hoạt lực này cao gấp 5.7 đến 57 lần so với loài Rhizopus microsporus (chỉ dao động trong khoảng 3.29 đến 33.22 IU/ml) và cao hơn từ 90 đến 190 lần so với các chủng thuộc chi Mucor như Mucor indicus hay Mucor circinelloides (chỉ đạt từ 1.00 đến 2.00 IU/ml).

Thứ ba, thử nghiệm sinh lý cho thấy Rhizopus oryzae thích ứng tối ưu ở dải nhiệt độ 30°C đến 35°C và duy trì hoạt tính thủy phân tinh bột ổn định ngay cả trong môi trường có chứa 2% glucose sau 48 giờ nuôi cấy. Ngược lại, loài Rhizopus microsporus sinh trưởng mạnh ở nhiệt độ cao từ 45°C đến 50°C nhưng lại có khả năng đường hóa tinh bột rất yếu.

Thảo luận kết quả

Sự áp đảo của các chủng họ Mucoraceae thay vì Aspergillus hay Penicillium trong bánh men Việt Nam xuất phát từ điều kiện cơ chất ban đầu. Bột làm bánh men và cơm nấu đều có độ ẩm cao từ 50% đến 55%, tạo môi trường vi hiếu khí hoàn hảo cho nấm sợi không vách ngăn sinh trưởng.

Dữ liệu nghiên cứu được biểu diễn trực quan qua biểu đồ phân bố hoạt lực amylase dạng cột và sơ đồ cây phát sinh phân loại (dendrogram) từ các băng điện di DNA fingerprinting. Khi biểu diễn kết quả phân tích HS-SPME GC-MS trên biểu đồ phân cụm thứ bậc (Hierarchical Clustering) cho 32 mẫu rượu, 118 hợp chất bay hơi đã được định danh thuộc 5 nhóm chính gồm ester, alcohol, acid, aldehyde và ketone. Mẫu rượu sử dụng phối hợp chủng thuần Rhizopus oryzae và Saccharomyces cerevisiae tạo ra phổ hương cân đối với hàm lượng ester thơm tự nhiên cao tương đương rượu truyền thống, đồng thời kiểm soát tối đa các hợp chất aldehyde gây sốc nhiệt và đau đầu.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, xây dựng ngân hàng giống thuần khiết phục vụ công nghiệp hóa rượu truyền thống. Đơn vị nghiên cứu cần lựa chọn các chủng Rhizopus oryzae có hoạt lực amylase trên 180 IU/ml kết hợp với nấm men Saccharomyces cerevisiae đạt mật độ 10^7 tế bào/ml, hướng tới mục tiêu nâng hiệu suất thu hồi cồn lên trên 340 gam ethanol trên mỗi kilogam gạo trong lộ trình 12 tháng do Viện Công nghiệp Thực phẩm chủ trì.

Thứ hai, chuẩn hóa quy trình công nghệ ủ men hai giai đoạn tại các cơ sở sản xuất. Doanh nghiệp cần chủ động kiểm soát nhiệt độ phòng ủ ẩm ở mức 30°C đến 35°C trong 72 giờ đầu và duy trì độ ẩm khối hạt từ 50% đến 55%, giúp rút ngắn tổng chu kỳ lên men từ 10 ngày xuống còn 7 ngày và hạ tỷ lệ đường dư sau chưng cất xuống dưới 1.5% trước quý 4 năm 2026.

Thứ ba, triển khai quy chuẩn kiểm soát an toàn bay hơi bằng phương pháp HS-SPME GC-MS. Các Trung tâm kiểm nghiệm chất lượng cần định kỳ hàng quý phân tích định lượng 32 chỉ tiêu hợp chất bay hơi, đảm bảo hàm lượng methanol luôn dưới ngưỡng 0.05 g/lít cồn 100 độ và loại bỏ hoàn toàn nguy cơ độc tố nấm mốc trong sản phẩm rượu chưng cất.

Thứ tư, chuyển giao kỹ thuật sản xuất bánh men vi sinh cố định cho các làng nghề truyền thống. Sở Khoa học và Công nghệ các địa phương cần phối hợp với hiệp hội làng nghề tổ chức đào tạo cho trên 500 hộ nấu rượu tại Bắc Giang, Ninh Bình, Bình Định trong giai đoạn 2026 đến 2028, nhằm giảm thiểu tỷ lệ hư hỏng mẻ ủ xuống dưới 2%.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm 1: Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Vi sinh vật học và Công nghệ sinh học. Luận văn cung cấp tài liệu giá trị về quy trình phân nhóm vi nấm bằng kỹ thuật PCR-fingerprinting sử dụng mồi MST2 và giải trình tự gen ITS để phân loại nấm sợi họ Mucoraceae.

Nhóm 2: Kỹ sư công nghệ thực phẩm và chuyên viên R&D tại các nhà máy đồ uống có cồn. Đề tài đem lại giải pháp thực tế để ứng dụng tổ hợp chủng thuần Rhizopus oryzae và Saccharomyces cerevisiae vào việc tối ưu hóa hiệu suất đường hóa và lên men công nghiệp.

Nhóm 3: Hợp tác xã, nghệ nhân và chủ cơ sở sản xuất rượu tại các làng nghề truyền thống. Nội dung nghiên cứu giúp người sản xuất nắm vững các thông số kỹ thuật chuẩn về nhiệt độ ủ ẩm 30°C đến 35°C và tỷ lệ bổ sung bánh men để ổn định chất lượng từng mẻ nấu.

Nhóm 4: Cơ quan quản lý nhà nước và chuyên viên kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm. Luận văn là cơ sở dữ liệu hữu ích về phổ hợp chất bay hơi của 32 mẫu rượu gạo, phục vụ việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và phân biệt sản phẩm truyền thống đạt chuẩn.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao Rhizopus oryzae lại được khẳng định là loài nấm mốc chủ đạo trong bánh men rượu truyền thống Việt Nam? Rhizopus oryzae chiếm tỷ lệ cao nhất trong tổng số nấm mốc phân lập (27 trên 73 chủng, chiếm 36.99%) và thể hiện hoạt lực enzyme amylase cao nhất đạt 190.01 IU/ml. Loài này thích nghi tối ưu với cơ chất có độ ẩm 50% đến 55% và tiếp tục sinh enzyme đường hóa ngay cả khi môi trường có sẵn 2% glucose.

Kỹ thuật PCR-fingerprinting đóng vai trò gì trong việc phân loại hệ vi nấm của bánh men? Phương pháp PCR-fingerprinting sử dụng mồi vi vệ tinh MST2 (GAC)5 giúp phân nhóm nhanh 101 chủng vi sinh vật dựa trên sự tương đồng của các đoạn ADN lặp lại. Kỹ thuật này khắc phục hoàn toàn nhược điểm nhầm lẫn của phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc truyền thống, tạo tiền đề giải trình tự rDNA chính xác.

Nhiệt độ môi trường ảnh hưởng như thế nào đến khả năng thủy phân tinh bột của nấm mốc Mucoraceae? Nghiên cứu trên 6 dải nhiệt độ từ 25°C đến 50°C chứng minh Rhizopus oryzae sinh trưởng và tiết amylase mạnh nhất ở 30°C đến 35°C. Mặc dù loài Rhizopus microsporus chịu được nhiệt độ cao đến 50°C nhưng hoạt lực amylase của loài này rất thấp (chỉ từ 3.29 đến 33.22 IU/ml), không phù hợp cho đường hóa.

Nồng độ đường glucose tăng cao trong dịch ủ có làm ngừng quá trình tiết enzyme amylase không? Thử nghiệm với nồng độ glucose từ 0% đến 2% và nhuộm màu dung dịch Lugol 0.33% chứng minh Rhizopus oryzae không bị ức chế dị hóa hoàn toàn. Sau 24 đến 48 giờ, nấm mốc vẫn liên tục tổng hợp amylase để phân giải tinh bột, đảm bảo quá trình đường hóa và lên men diễn ra song song.

Phương pháp HS-SPME GC-MS mang lại ưu thế gì khi phân tích hương vị rượu gạo? Kỹ thuật vi chiết pha rắn không gian đầu kết hợp sắc ký khí khối phổ cho phép cô đặc và định tính hơn 118 hợp chất bay hơi ở nồng độ cực nhỏ mà không cần dung môi hữu cơ. Kết quả giúp đánh giá khách quan các nhóm ester và alcohol tạo hương của rượu chủng thuần so với 26 mẫu rượu thị trường.

Kết luận

• Luận văn đã phân lập và phân nhóm thành công 101 chủng vi sinh vật từ 15 mẫu bánh men truyền thống tại 8 tỉnh miền Bắc.
• Khẳng định Rhizopus oryzae là loài nấm mốc giữ vai trò chủ đạo với hoạt lực amylase ngoại bào đạt đỉnh 190.01 IU/ml.
• Xác định khả năng thích ứng sinh học vượt trội của Rhizopus oryzae ở nhiệt độ 30°C đến 35°C và duy trì hoạt tính thủy phân trong môi trường chứa 2% glucose.
• Thử nghiệm thành công mô hình lên men từ tổ hợp chủng thuần giúp nâng cao sản lượng thu hồi cồn lên 340 gam cồn đặc trên 1000 gam gạo.
• Thiết lập cơ sở dữ liệu phổ hương 118 hợp chất bay hơi qua hệ thống HS-SPME GC-MS trên 32 mẫu rượu chưng cất.

Đóng góp lớn nhất của công trình là cung cấp luận cứ khoa học vững chắc để hiện đại hóa nghề nấu rượu truyền thống, từng bước thay thế bánh men thủ công bằng chế phẩm vi sinh thuần khiết. Các đơn vị sản xuất và nhà nghiên cứu quan tâm đến quy trình chuyển giao công nghệ chủng giống vi sinh có thể liên hệ trực tiếp với Viện Công nghiệp Thực phẩm để nhận tài liệu hướng dẫn kỹ thuật chi tiết.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về rượu truyền thống Đồ uống có cồn như bia, rượu là những sản phẩm lên men phổ biến và đóng vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần và văn hóa của con người. Ở Việt Nam, rượu gạo đã có từ rất lâu đời, cho đến nay nó vẫn là thức uống phổ biến và chiếm 80% trong tổng số các loại đồ uống có cồn. Tùy thuộc vào từng địa phương mà thành phần và quy trình sản xuất rượu có sự khác nhau, do đó rượu được sản xuất có tên địa phương khác nhau.

như rượu Làng Vân (tỉnh Bắc Giang), rượu Kim Sơn (tỉnh Ninh Bình), rượu Kiên Lao (tỉnh Nam Định), rượu Bàu Đá (tỉnh Bình Định), rượu Gò Đen (tỉnh Long An). Tuy nhiên, phương thức sản xuất chung đều dựa vào quá trình biến đổi hóa sinh của hệ vi sinh vật trong men rượu [8]. Men rượu Việc chuẩn bị và sử dụng men rượu như là nguồn cung cấp vi sinh vật trong sản xuất rượu gạo là rất quan trọng. Thông thường, giống khởi động cho lên men rượu gồm 3 thành phần vi sinh cơ bản là: nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.

Trong đó, nhóm nấm mốc chủ yếu sinh enzyme amylase để đường hóa tinh bột thành các phân tử đường khử như glucose, maltose, hay n-dextrin dài hơn. Sau đó, lượng đường này được nấm men chuyển hóa thành ethanol vì vậy chất lượng của các sản phẩm cuối cùng phụ thuộc chủ yếu vào hoạt động của các vi sinh vật này. Một trong những cách tiếp cận để cải thiện sản xuất rượu là thiết lập các điều kiện tối ưu cho quá trình đường hóa và lên men đồng thời với nuôi cấy hỗn hợp vi sinh vật sinh enzyme thủy phân tinh bột và lên men ethanol [8]. Như được liệt kê trong Bảng 1.1, các loài mốc chính trong các loại giống khởi động truyền thống ở Châu Á là Rhizopus spp.

và Mucor spp. Nhóm nấm men phổ biến là Saccharomyces cerevisiae, Hansenula spp., và Candida spp., còn loài giả nấm men phổ biến là Saccharomycopsis fibuligera. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các loại giống khởi động để lên men đồ uống có cồn ở Châu Á Sản phẩm Đất nước Mốc và men Bakhar Ấn Độ Mucor spp., Saccharomyces cerevisiae Mucor spp., Bubud Philippines Saccharomycopsis fibuligera, Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis spp.

Aspergillus oryzae, Rhizopus spp., Saccharomyces Chu Trung Quốc cerevisiae Look- Mucor spp., Chlamydomucor oryzae, Candida spp., Thái Lan pang Saccharomyces cerevisiae Men Mucor spp., Việt Nam rượu Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis fibuligera Rhizopus spp., Saccharomyces cerevisiae, Murcha Nepal Saccharomycopsis fibuligera. Aspergillus oryzae, Rhizopus spp.niger, Penicillium Nurock Hàn Quốc spp., Hansenula anomala, Pichia anomala, Saccharom yces cerevisiae Mucor spp., Saccharom yces cerevisiae, Ragi Indonesia Saccharomycopsis fibuligera , Hansenula spp. Tapai Malaysia Rhizopus spp., Saccharomycopsis fibuligera Các thành phần để làm viên men thường là bột gạo, bột sắn hoặc kết hợp cả bột gạo và bột sắn- Các loại bột đó có thể được trộn với một số loại thảo mộc, những thành phần bổ sung này được cho là có vai trò trong việc ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật tạp nhiễm. Tỷ lệ giữa bột nghiền với các loại thảo mộc thường là 14:1 theo khối lượng.

Sau đó, nước được thêm vào để tạo độ ẩm tương đối cho khối bột là 55-60%, và trộn đều với bột men từ những mẻ trước. Những viên men được nặn hình tròn với đường kính 4 cm, dày 1 cm. Các khay bánh men được ủ trong điều kiện nhiệt 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] độ phòng 28-32 ºC trong 2-5 ngày và được hong khô bởi gió hoặc ánh sáng mặt trời [8]. Bột gạo Bột men Bột thuốc bắc Nước Khối bột với 50-60% hàm ẩm Nặn viên men tròn ủ 2-5 ngày Hong khô Hình 1.

Một quy trình truyền thống làm men rượu ở Việt Nam 1. Các giai đoạn lên men rượu Có 2 giai đoạn chính trong lên men sản xuất rượu đó là: Giai đoạn đường hóa và giai đoạn lên men rượu 1. Giai đoạn 1- Giai đoạn đường hóa Gạo sau khi được nấu chín sẽ được tãi ra khay, vải sạch để nguội đến nhiệt độ 30-35°C thì rắc bột bánh men vào với tỉ lệ bột bánh men so với gạo là 1-5% theo khối lượng. Trộn đều bột bánh men và ủ khoảng 3 ngày để vi sinh vật sinh amylase thủy phân tinh bột thành đường trong điều kiện hiếu khí [8].

Đặc điểm của enzyme amylase Amylase có thể được tổng hợp từ một số loại nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và xạ khuẩn; Tuy nhiên, nấm mốc được biết đến nhiều nhất vì tính phổ biến và ổn định 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] của enzyme này. Có 3 loại amylase là α-amylases, β-amylases và γ-amylase, (α- glucosidase) mỗi loại cắt các vị trí khác nhau. minh họa vị trí thủy phân liên kết của 3 loại enzyme này. Quá trình thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase a.

α- amylase α-amylases có khả năng cắt liên kết α,1-4 glycoside ở phía trong của mạch amylose và amylopectin. Enzyme này được tìm thấy ở rất nhiều loài vi sinh vật, nó cắt ở các vị trí ngẫu nhiên dọc chuỗi tinh bột, cuối cùng tạo ra glucose, maltose, n- dextrin. α-amylases có xu hướng hoạt động nhanh hơn β-amylase bởi nó có thể thủy phân nhiều vị trí của cơ chất. Loại enzyme này được tìm thấy nấm Ascomycetes và Basidiomycetes, vi khuẩn Bacillus, nước bọt và tuyến tụy ở người [22].

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylases là quá trình đa giai đoạn: Giai đoạn 1 (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh) [2]. Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp ở giai đoạn 1 bị thủy phân tiếp tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose [2].

6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Giai đoạn 3: Các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose và glucose. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α- amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó.

Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. β-amylase β-amylase hay exoamylase có khả năng cắt liên kết α,1-4 glycoside và α,1-6 glycoside. Chúng thủy phân glucose ở phía ngoài của mạch amylose và amylopectin [23]. β-amylase là một enzyme ngoại bào.

Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất. β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin [2]. γ-amylase γ-amylase cắt liên kết α(1-6) và α(1-4) glycoside ở đầu không khử của amylose và amylopectin, tạo ra glucose.

Đa số Enzyme này có hoạt lực cao nhất ở vùng PH 3,5-5,5 và nhiệt độ 50ºC. Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, aceton [22]. Đặc điểm của vi nấm trong giai đoạn đường hóa Quá trình đường hóa tinh bột sẽ cho ra maltose, glucose để sản xuất ethanol có nguồn gốc từ các quá trình lên men. Thủy phân tinh bột bằng phương pháp enzyme có nhiều ưu điểm so với phương pháp hóa học, như hoạt động trong điều kiện pH và nhiệt độ vừa phải, ngăn ngừa ăn mòn thiết bị và các bước trung hòa tiếp theo.

Enzyme có tính đặc hiệu cơ chất, loại bỏ sự hình thành các sản phẩm phụ không mong muốn như thường được xuất hiện trong quá trình thủy phân axit [26]. Giai đoạn 2- Giai đoạn lên men rượu. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nhóm nấm men thường phân lập được từ bánh men là Saccharomyces cerevisiae, Pichia anomala, Candida tropicalis trong đó Saccharomyces cerevisiae được cho là đóng vai trò chính, phát triển trong điều kiện ít oxy, lên men chuyển hóa đường thành ethanol. Ethanol là sản phẩm chính ở giai đoạn này, khi nồng độ cao trong dịch lên men sẽ ức chế màng sinh chất, thay đổi tính bán thấm tế bào nấm men và các vi sinh vật khác.

Thực tế sản xuất cho thấy giai đoạn ủ cho lên men phụ thuộc vào thời tiết, vào những ngày nóng, giai đoạn ủ thường ngắn. Ví dụ như ở vùng Đồng bằng Sông Cửu Long ở miền Nam Việt Nam, nhiệt độ trung bình 30-33ºC, thời gian ủ cho giai đoạn 1 là 2-3 ngày, giai đoạn 2 là 3-4 ngày [8]. + Lên men rắn là phương pháp thường được sử dụng ở các vùng núi cao. Nguyên liệu cho sản xuất rượu ở những vùng này thường là ngô và sắn.

Ngô và sắn sau quá trình đường hóa trở nên ngọt và mềm, sau đó được thêm nước. Quá trình lên men diễn ra trong 5-7 ngày và sau đó đem đi chưng cất [3]. + Lên men lỏng thường được sử dụng ở các làng nghề dưới đồng bằng. Gạo, sau quá trình đường hóa trở nên mền ngọt và được bổ sung nước theo tỉ lệ 1:1.

Lên men tiếp trong 3-5 ngày. Vào mùa hè nhiệt độ cao thì thời gian lên men thường ngắn hơn mùa đông [3]. Sản phẩm sau lên men rượu gạo. Đối với rượu không chưng cất, dịch lên men sau khi kết thúc giai đoạn 2 sẽ được lọc lấy dịch trong chứa glucose, ethanol, và các chất hòa tan khác, với những loại rượu không chưng cất độ cồn chỉ khoảng 7-10% (v/v), và rượu sẽ không bảo quản được lâu.

Để giải quyết vấn đề này, người sản xuất sẽ tăng hàm lượng cồn bằng cách hoặc bổ sung đường vào sau giai đoạn 1 hoặc bổ sung cồn vào sau giai đoạn 2, như vậy vừa đáp ứng được nhu cầu khách hang vừa kéo dài tuổi thọ cho sản phẩm [3]. Đối với rượu chưng cất, sử dụng thiết bị chưng cất có nguyên lý hoạt động như hình dưới, gồm 3 phần cơ bản là: khoang đun, hệ thống làm mát, và khoang chứa rượu chưng cất. Thông thường, mẫu rượu đầu có nồng độ cồn cao có thể lên đến 65% (v/v) sau giai đoạn chưng cất đầu tiên, và khoảng 25-30% (v/v) cho mẫu rượu sau [3]. 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Sơ đồ tóm tắt quy trình lên men rượu 1.2 Giới thiệu về họ Mucoraceae Họ Mucoraceae là họ nấm thuộc bộ Mucorales, đặc trưng bởi hệ sợi không vách ngăn. Một số chi có thể kể đến bao gồm Absidia, Apophysomyces, Mucor, Rhizomucor, và Rhizopus.