Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sản xuất rượu vang là một lĩnh vực công nghệ lên men truyền thống có quy mô toàn cầu. Trong quy trình công nghệ sản xuất rượu vang, giai đoạn lên men chính (lên men rượu) thường sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae để chuyển hóa đường thành ethanol và khí carbon dioxide ($\text{CO}_2$). Tuy nhiên, đối với các loại vang đỏ hoặc rượu vang sản xuất từ các loại trái cây có độ acid cao, quá trình lên men phụ hay còn gọi là lên men malolactic (Malolactic Fermentation - MLF) đóng vai trò đặc biệt quan trọng. Dưới tác dụng của enzyme malolactic (MLE) từ vi khuẩn lactic, acid L-malic (dicarboxylic acid có vị chua gắt) được chuyển hóa thành acid L-lactic (monocarboxylic acid có vị chua dịu hơn) và giải phóng $\text{CO}_2$, giúp làm giảm độ chua tổng, ổn định hệ vi sinh vật và hoàn thiện hương vị đặc trưng cho rượu vang thành phẩm.

Tại Việt Nam, phần lớn các quy trình sản xuất rượu vang hoa quả chỉ trải qua giai đoạn lên men rượu và lên men phụ để lắng trong, làm trong tự nhiên mà không kiểm soát quá trình lên men malolactic. Điều này dẫn đến hạn chế về chất lượng cảm quan, đặc biệt đối với dịch quả cacao – nguồn nguyên liệu chứa hàm lượng acid hữu cơ (đặc biệt là acid malic) tương đối cao. Nhằm khắc phục nhược điểm vị chua gắt và nâng cao chất lượng rượu vang cacao, đồ án tốt nghiệp "Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang cacao" được thực hiện.

Mục tiêu và các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể của đề tài bao gồm 5 nội dung:

  1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos.
  2. Khảo sát tỉ lệ giống vi khuẩn Leuconostoc oenos thích hợp bổ sung vào dịch vang non.
  3. Khảo sát thời điểm bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos.
  4. Khảo sát tỉ lệ chất làm trong bentonite.
  5. Lên men malolactic với các thông số tối ưu đã nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm: dịch quả cacao, rượu vang non cacao, chủng vi khuẩn lactic Leuconostoc oenos (được phân loại học đổi tên thành Oenococcus oeni), chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae và chất trợ lắng bentonite. Phạm vi nghiên cứu được thực hiện thực nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm tại Bộ môn Công nghệ Kĩ thuật Hóa học thuộc Khoa Hóa học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu; thời gian triển khai từ tháng 09/2013 đến tháng 07/2014.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Đồ án xây dựng trên nền tảng lý thuyết vi sinh vật học thực phẩm và hóa sinh học quá trình lên men đồ uống có cồn:

  • Cơ sở lý thuyết và vi sinh vật: Quá trình lên men malolactic là phản ứng khử carboxyl (decarboxyl hóa) chuyển acid L-malic thành acid L-lactic và $\text{CO}_2$ nhờ enzyme malolactic (malate carboxylase - MLE). Chủng vi sinh vật chủ đạo được sử dụng là Leuconostoc oenos (Oenococcus oeni) – loài liên cầu khuẩn Gram dương, không chuyển động, không sinh bào tử, có kích thước tế bào nhỏ, sinh acid D-lactic chiếm trên 95% tổng lượng acid lactic và không có khả năng tạo dextran gây nhớt dịch vang. Vi khuẩn này có khả năng thích nghi và sinh trưởng trong điều kiện khắc nghiệt của rượu vang (nồng độ ethanol > 10%V và pH < 4,2).
  • Cơ chế làm trong: Sử dụng đất khoáng hoạt tính bentonite (chứa các khoáng Mg, Ca, $\text{Al}_2\text{O}_3$ dạng liên kết cation $\text{Na}^+$ hoặc $\text{Ca}^{2+}$). Bentonite trương nở trong nước và hấp phụ các protein tích điện dương, chất keo, tiểu phần lơ lửng gây đục trong rượu vang thông qua cơ chế trao đổi ion. Khả năng hấp phụ của bentonite phụ thuộc lớn vào pH, đạt hiệu quả cao tại pH = 3,0 (gấp 3 lần so với pH = 4,5).
  • Phương pháp nghiên cứu thực tế:
    • Phương pháp khảo sát in vitro: Nuôi cấy vi khuẩn Leuconostoc oenos trong môi trường cơ bản (hoặc MRS cải tiến, MT1 bổ sung dịch vang non) ở chế độ lắc liên tục 120 vòng/phút tại nhiệt độ phòng để khảo sát động học sinh trưởng dưới ảnh hưởng của độ cồn (0%, 5%, 10%, 12%, 15%V), nguồn nitơ hữu cơ (peptone, cao thịt bò, cao nấm men, hỗn hợp), pH (3,0 đến 5,5) và thành phần đường (glucose, fructose, saccharose, hỗn hợp).
    • Phương pháp lên men malolactic hai giai đoạn: Dịch nước cacao sau khi lên men chính 7 ngày bằng Saccharomyces cerevisiae được lắng gạn tách cặn nấm men để thu "vang non". Bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos với các tỷ lệ khảo sát (5 g/L, 10 g/L, 15 g/L) và các thời điểm cấy giống (ngày 0, ngày 3, ngày 7), tiến hành lên men malolactic trong 20 ngày ở dải nhiệt độ 15 – 20 °C.
    • Phương pháp làm trong bằng bentonite: Pha huyền phù bentonite 10% trong nước, ngâm 2 ngày để trương nở hoàn toàn, sau đó bổ sung vào rượu vang cacao sau lên men malolactic với dải tỷ lệ 0 – 5 g/L để đánh giá tốc độ lắng và độ trong.
  • Nguồn dữ liệu và phương pháp phân tích:
    • Đo pH bằng máy đo điện tử Mettler.
    • Đo hàm lượng chất khô hòa tan (°Brix) bằng khúc xạ kế (Brix kế).
    • Xác định hàm lượng ethanol (%V) bằng phương pháp chưng cất theo TCVN 3786-1986 và TCVN 378-86.
    • Xác định mật độ quang (OD) tại bước sóng 600 nm bằng máy đo quang phổ.
    • Xác định độ acid toàn phần (tính theo acid citric g/L) bằng phương pháp chuẩn độ thể tích với dung dịch $\text{NaOH}$ 0,1N đến điểm chuyển màu/pH = 7 theo TCVN 1273-1986.
    • Định lượng số lượng tế bào vi khuẩn sống bằng phương pháp pha loãng thập phân và đếm khuẩn lạc (CFU/mL) trên đĩa petri thạch MRS.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các cơ sở lý luận và tài liệu khoa học liên quan đến đề tài:

  • Giới thiệu thực vật học cây cacao (Theobroma Cacao L. thuộc họ Sterculiaceae), các giống cacao phổ biến (Criollo, Forastero, Trinitario), cấu tạo vỏ, hạt, thịt quả và thành phần hóa học của dịch nước cacao.
  • Phân tích bản chất của quá trình lên men malolactic: phản ứng biến đổi hóa học, vị trí trong quy trình sản xuất vang, 3 mục đích chính gồm làm giảm độ acid (tăng pH 0,1 – 0,3 đơn vị, giảm acid tổng 0,01 – 0,03 g/L), điều chỉnh và hoàn thiện phức hệ hương vị (sinh tổng hợp diacetyl, acetoin, ethyl lactate...), và ổn định vi sinh vật thành phẩm (tiêu thụ hết acid malic, ức chế tạp khuẩn thông qua bacteriocin và sự cạn kiệt dinh dưỡng).
  • Phân loại và so sánh 3 kiểu lên men malolactic: lên men tự nhiên, lên men đồng thời một giai đoạn (cấy chung nấm men và vi khuẩn), và lên men hai giai đoạn tách riêng biệt.
  • Đặc điểm sinh học của chủng Leuconostoc oenos (Oenococcus oeni), đặc tính enzyme MLE, tương tác hai chiều giữa nấm men và vi khuẩn malolactic (hiện tượng tự phân nấm men giải phóng peptide < 1 kDa kích thích vi khuẩn, tác động ức chế bởi ethanol, $\text{SO}_2$ và acid béo mạch trung bình $\text{C}6-\text{C}{12}$).
  • Nguyên lý làm trong rượu vang và phân loại các tác nhân trợ lắng: nhóm protein (casein, albumin, isinglass, gelatin), đất hoạt tính bentonite, polyme tổng hợp (PVPP, nylon).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết phương tiện thực nghiệm và các bước tiến hành:

  • Nguyên vật liệu: dịch quả cacao tươi, rượu vang non cacao sau 7 ngày lên men chính, chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae, chủng vi khuẩn Leuconostoc oenos, các hóa chất phân tích tinh khiết, môi trường dinh dưỡng MRS và MT1.
  • Dụng cụ và thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp tiệt trùng Autoclave, tủ sấy, tủ ấm, máy lắc ngang, máy ly tâm, máy đo pH Mettler, Brix kế, máy quang phổ UV-Vis đo OD600, bộ chưng cất cồn.
  • Thiết lập sơ đồ bố trí thí nghiệm:
    • Thí nghiệm 1: Xác định đường cong sinh trưởng và mật độ tế bào của Leuconostoc oenos.
    • Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ cồn (0%, 5%, 10%, 12%, 15%V).
    • Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ (peptone 15 g/L, cao thịt bò 15 g/L, cao nấm men 15 g/L, hỗn hợp 3 loại 15 g/L).
    • Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hưởng của pH (dải pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 điều chỉnh bằng acid citric 10%).
    • Thí nghiệm 5: Đánh giá ảnh hưởng của loại đường bổ sung (saccharose 20 g/L, fructose 20 g/L, glucose 20 g/L, hỗn hợp 3 loại mỗi loại 7 g/L, đối chứng không đường).
    • Thí nghiệm 6: Khảo sát tỷ lệ giống cấy vào vang non (ĐC, 5 g/L, 10 g/L, 15 g/L) trong 20 ngày lên men malolactic.
    • Thí nghiệm 7: Khảo sát thời điểm cấy giống vi khuẩn (ĐC, cấy cùng nấm men ở ngày 0, cấy ở ngày thứ 3, cấy ở ngày thứ 7 kết thúc lên men chính).
    • Thí nghiệm 8: Khảo sát tỷ lệ chất làm trong bentonite (0 – 5 g/L).
  • Trình bày các tiêu chuẩn phương pháp phân tích vật lý, hóa học và sinh học tương ứng.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương này công bố và phân tích các số liệu thu được từ thực nghiệm:

  • Động học sinh trưởng của vi khuẩn: Leuconostoc oenos phát triển tối ưu ở nồng độ cồn < 10%V, bắt đầu bị ức chế tại 12%V và bị ức chế nặng ở 15%V. Môi trường chứa hỗn hợp 3 nguồn nitơ (peptone, cao thịt bò, cao nấm men) cho giá trị $\text{OD}_{600}$ cao nhất; trong các nguồn đơn lẻ, cao nấm men kích thích sinh trưởng tốt hơn cao thịt bò và peptone do chứa các chuỗi peptide ngắn và acid amin tự do. Giá trị pH tối ưu để thu nhận sinh khối vi khuẩn là pH = 5,0 (dưới pH 3,5 tế bào bị sốc acid). Về nguồn carbon, đường fructose (dạng cetose vòng 5) kích thích sinh trưởng mạnh hơn glucose (dạng aldose vòng 6) và saccharose (disaccharide).
Yếu tố khảo sát Điều kiện tối ưu cho sinh khối vi khuẩn
Nhiệt độ nuôi cấy 25 °C (thời gian nuôi 2 – 3 ngày)
Nồng độ cồn ethanol < 10%V
Giá trị pH 5,0
Nguồn nitơ hữu cơ Hỗn hợp Peptone (5 g/L) + Cao thịt bò (5 g/L) + Cao nấm men (5 g/L)
Nguồn đường carbon Hỗn hợp Fructose (7 g/L) + Glucose (7 g/L) + Saccharose (7 g/L)
  • Khảo sát tỷ lệ giống cấy: Tỷ lệ bổ sung 10 g/L vi khuẩn vào dịch vang non (mẫu M2) đem lại hiệu quả phân giải acid malic tối ưu, nâng cao pH nhẹ và làm dịu vị chua của vang một cách rõ rệt.
  • Khảo sát thời điểm cấy giống:
    • Mẫu M1 (bổ sung ngày 0): Quá trình lên men malolactic diễn ra nhưng vi khuẩn sử dụng một phần đường tự do tạo thêm acid lactic, làm tăng nguy cơ chua vang.
    • Mẫu M2 (bổ sung ngày 3 - pha log nấm men): Vi khuẩn bị nấm men ức chế cạnh tranh mạnh, quá trình lên men malolactic diễn ra chậm chạp.
    • Mẫu M3 (bổ sung ngày thứ 7 - kết thúc lên men cồn): Cho hiệu quả tối ưu nhất; pH tăng nhẹ từ 3,893 lên 4,001, hàm lượng chất khô hòa tan giảm nhẹ từ 8,5 xuống 7,5 °Brix, độ acid tổng giảm rõ rệt và độ cồn không bị hao hụt.
  • Khảo sát làm trong và chất lượng cảm quan: Huyền phù bentonite 10% xử lý hiệu quả các hạt keo lơ lửng và protein dư thừa, làm tăng độ trong và cải thiện chỉ tiêu cảm quan của vang cacao sau lên men malolactic.

Kết quả và đóng góp

Đồ án đã xác lập được hệ thống thông số công nghệ thực nghiệm cho quá trình lên men malolactic và làm trong rượu vang cacao:

  • Xác định được điều kiện tối ưu để nuôi cấy nhân giống thu sinh khối vi khuẩn Leuconostoc oenos ở quy mô phòng thí nghiệm: nhiệt độ 25 °C, thời gian 2 – 3 ngày, pH = 5,0, nồng độ cồn < 10%V, môi trường bổ sung 7 g/L fructose, 7 g/L glucose, 7 g/L saccharose và 5 g/L peptone, 5 g/L cao thịt bò, 5 g/L cao nấm men.
  • Xác định được phương thức và thời điểm lên men malolactic tối ưu: áp dụng quy trình lên men hai giai đoạn tách riêng, thực hiện bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos với nồng độ 10 g/L vào thời điểm ngày thứ 7 (sau khi kết thúc lên men chính và lắng gạn cặn nấm men), lên men trong 20 ngày ở 15 – 20 °C. Sau lên men malolactic, pH của vang tăng từ 3,893 lên 4,001, độ Brix giảm từ 8,5 về 7,5 °Brix, chuyển hóa lượng acid malic gắt thành acid lactic dịu.
  • Hoàn thiện công đoạn làm trong bằng bentonite (dung dịch 10% ngâm trương nở 2 ngày), giúp dịch rượu vang cacao đạt độ trong và độ ổn định hóa lý.
  • Đóng góp khoa học và thực tiễn: Đồ án là công trình thực nghiệm cung cấp các dẫn liệu công nghệ có kiểm soát về ứng dụng vi khuẩn Leuconostoc oenos trong sản xuất rượu vang từ dịch quả cacao tại Việt Nam, mở ra hướng nâng cao giá trị sử dụng phụ phẩm từ trái cacao.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của đồ án:
    • Các thí nghiệm mới chỉ thực hiện ở quy mô bình tam giác trong phòng thí nghiệm, chưa tiến hành thử nghiệm ở quy mô pilot hoặc bồn lên men công nghiệp.
    • Chưa sử dụng các phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc sắc ký khí (GC-MS) để định lượng chính xác từng loại acid hữu cơ riêng biệt (acid malic, acid lactic, acid citric, acid tartaric) cũng như các hợp chất bay hơi tạo hương (diacetyl, acetoin, ethyl lactate).
    • Chưa khảo sát so sánh hoạt tính chuyển hóa malolactic giữa chủng Leuconostoc oenos ngoại lai với các chủng vi khuẩn lactic phân lập bản địa từ quả cacao Việt Nam.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Nghiên cứu công nghệ cố định tế bào vi khuẩn Leuconostoc oenos trên chất mang nhằm tái sử dụng giống và rút ngắn thời gian lên men malolactic.
    • Phân tích chi tiết động học tạo thành các hợp chất hương bay hơi trong quá trình tàng trữ và ủ chín rượu vang cacao sau lên men malolactic.
    • Nâng quy mô thử nghiệm lên bán công nghiệp (pilot) và đánh giá hiệu quả kinh tế - kỹ thuật toàn diện.

Giá trị tham khảo

Đồ án là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho:

  • Sinh viên và học viên cao học: Thuộc các ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học, Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học và Kỹ thuật Đồ uống đang thực hiện khóa luận, đồ án môn học hoặc đề tài nghiên cứu về công nghệ lên men vang trái cây.
  • Cán bộ nghiên cứu và kỹ sư R&D: Đang nghiên cứu phát triển các sản phẩm đồ uống lên men từ nông sản nhiệt đới, đặc biệt là quy trình xử lý giảm acid tự nhiên trong nước quả bằng vi sinh vật.
  • Các nội dung có giá trị tham khảo cao nhất:
    • Phương pháp luận bố trí thí nghiệm khảo sát đa yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng vi khuẩn Leuconostoc oenos (Oenococcus oeni).
    • Quy trình và kỹ thuật lên men malolactic hai giai đoạn tách riêng.
    • Quy trình chuẩn bị và sử dụng huyền phù bentonite 10% để làm trong rượu vang.

Câu hỏi thường gặp

1. Quá trình lên men malolactic làm thay đổi thành phần acid và độ chua của rượu vang cacao như thế nào? Quá trình lên men malolactic sử dụng enzyme malate carboxylase (MLE) của vi khuẩn Leuconostoc oenos để decarboxyl hóa acid L-malic (chứa 2 nhóm -COOH, có vị chua gắt) thành acid L-lactic (chứa 1 nhóm -COOH, có vị chua dịu) và giải phóng $\text{CO}_2$. Phản ứng này làm giảm độ acid toàn phần, đồng thời nâng giá trị pH của rượu vang cacao lên khoảng 0,1 – 0,3 đơn vị (thực nghiệm đồ án ghi nhận pH tăng từ 3,893 lên 4,001), giúp vị rượu trở nên êm dịu và hài hòa.

2. Tại sao đồ án kết luận thời điểm bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos tối ưu nhất là vào ngày thứ 7 (cuối giai đoạn lên men rượu chính)? Bổ sung vào ngày thứ 7 (sau khi lên men cồn kết thúc và đã lắng gạn xác nấm men) giúp tách biệt hoàn toàn hai quá trình lên men. Phương pháp này tránh được sự cạnh tranh dinh dưỡng giữa nấm men và vi khuẩn, loại bỏ các tác nhân ức chế vi khuẩn do nấm men tiết ra ở pha phát triển mạnh (ngày thứ 3), đồng thời tận dụng được các chất dinh dưỡng và peptide do nấm men tự phân giải phóng ra ở cuối giai đoạn lên men cồn.

3. Vì sao đường fructose lại kích thích sự sinh trưởng của vi khuẩn Leuconostoc oenos mạnh hơn đường glucose và saccharose? Đường fructose có cấu trúc hóa học dạng vòng 5 cạnh (furanose), trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic dị hình sẽ bị phân giải nhanh hơn so với glucose có cấu trúc vòng 6 cạnh (pyranose) bền vững hơn. Đối với saccharose (disaccharide), vi khuẩn phải tốn năng lượng tổng hợp enzyme thủy phân thành đường đơn trước khi đồng hóa, do đó tốc độ sinh trưởng trong môi trường chứa saccharose đơn thuần là chậm nhất.

4. Enzyme malolactic (MLE) trong vi khuẩn Leuconostoc oenos có điều kiện hoạt động tối ưu ra sao? Enzyme malolactic của Leuconostoc oenos có hoạt độ tối ưu ở môi trường acid mạnh (pH = 3,0) và hoạt tính giảm dần khi pH tăng. Ngoài ra, acid malic đóng vai trò là chất cảm ứng cho sự sinh tổng hợp enzyme này; khi nồng độ acid malic trong môi trường $\ge 10\text{ g/L}$ (đối với dạng D-malic) hoặc $\ge 5\text{ g/L}$ (đối với dạng L-malic), hoạt độ của enzyme MLE đạt mức cao nhất.

5. Vì sao bentonite dạng $\text{Na}^+$ được đánh giá cao hơn dạng $\text{Ca}^{2+}$ trong quá trình làm trong rượu vang? Bentonite dạng $\text{Na}^+$ có khả năng hòa tan và trương nở trong nước tốt hơn, diện tích bề mặt tiếp xúc lớn hơn và khả năng trao đổi cation hấp phụ protein trên một đơn vị trọng lượng cặn lắng cao gấp đôi so với bentonite dạng $\text{Ca}^{2+}$.

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp "Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang cacao" đã giải quyết thành công vấn đề giảm vị chua gắt và ổn định chất lượng rượu vang cacao bằng biện pháp sinh học có kiểm soát. Nghiên cứu đã xác lập các điều kiện nuôi cấy nhân giống vi khuẩn Leuconostoc oenos tối ưu (pH 5,0; cồn < 10%V; bổ sung phối hợp đường và nitơ hữu cơ) và chứng minh hiệu quả của phương pháp lên men malolactic hai giai đoạn tách riêng với tỷ lệ cấy giống 10 g/L vào ngày thứ 7 sau lên men chính. Kết hợp với công đoạn xử lý làm trong bằng bentonite 10%, đề tài cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm hoàn chỉnh để ứng dụng vào công nghệ sản xuất rượu vang từ nguồn nguyên liệu dịch quả cacao.