Đặt vấn đề Ngành nuôi trồng thủy sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam hiện nay, trong đó nghề nuôi cá Tra đóng góp rất lớn cho kim ngạch xuất khâu cả nước. Tuy nhiên, trong những năm qua thời tiết có nhiều diễn biến phức tạp: giao mùa, mưa lũ,. Mặc khác, hình thức nuôi cá Tra ở nước ta chủ yếu là thâm canh, với diện tích mặt nước nuôi cá Tra lớn, mật độ dày và môi trường nước ngày cảng 6 nhiễm là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của dịch bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi. Trong đó, bệnh gây thiệt hại lớn nhất cho người nuôi phải kể đến bệnh gan thận mủ do vi khuan Edwardsiella ictaluri (E.
ictaluri) gây ra. Khi bệnh bùng phát có thé gây chết từ 60 — 80% cá (Crumlish và ctv, 2002). Dé điều trị bệnh gan thận mủ trên cá Tra, thông thường người nuôi vẫn sử dụng thuốc kháng sinh là biện pháp chữa bệnh phổ biến. Tuy nhiên việc sử dụng thuốc kháng sinh dé điều trị bệnh đã dé lại nhiều tác động tiêu cực như: sự kháng kháng sinh xuất hiện trên nhiều loài vi khuẩn gây bệnh, tồn lưu các chất kháng sinh trong cơ thể sinh vật, ảnh hưởng đến hệ sinh thái môi trường nước, chất lượng thành phâm cá Tra và người tiêu dùng.
Theo Cục chăn nuôi (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) từ năm 2020, Việt Nam sẽ dừng việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và thủy sản. Trước tình hình đó, khuynh hướng chung của thế giới nói chung và Việt nam nói riêng là tim ra những phương pháp phòng và trị bệnh gan thận mủ trên cá Tra an toàn, hiệu quả và giảm ảnh hưởng đến môi trường như: vaccine, chế phẩm thảo dược, probiotic. Và trong đó, vaccine được đánh gia là phương pháp phòng bệnh hiệu quả và an toàn và có tiềm năng thay thé kháng sinh trong phòng trừ bệnh gan thận mủ trên cá Tra, góp phần nâng cao chất lượng cá, bảo vệ môi trường và đặc biệt là an toàn đối với sức khỏe con người. Đề thực hiện được điều đó, trước tiên cần phải khảo sát sự đa dạng di truyền của vi khuẩn E.
Theo nghiên cứu Griffin va ctv (2016), kết qua cho thay có sự khác biệt về mặt di truyền của ba chủng E. ictaluri có nguồn gốc khác nhau bằng cách sử dụng rep-PCR, 16S, gyrB và giải trình tự plasmid. Phương pháp rep-PCR dựa trên trình tự của các đoạn lặp lại là phương pháp dé phan biét cac loai vi khuẩn phân tích sự phân bố của các trình tự lặp lại trong bộ gen của một số loài prokaryote (Versalovic và ctv,1991). Van đề đặt ra là vùng sinh thái nước ngọt và ở các tỉnh khác nhau thì có gây ảnh hưởng gi đến tính đa dạng di truyền của vi khuẩn E.
ictaluri hay không? Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Khảo sát sự đa dạng di truyền của chủng Edwardsiella ictaluri bằng kỹ thuật PCR dùng mồi thiết kế trên các chuỗi lặp (rep-PCR)”. Mục tiêu đề tài Phân tích mối quan hệ di truyền của chủng vi khuan Edwardsiella ictaluri dua trên phương pháp rep-PCR. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Chuan bị chủng Edwardsiella ictaluri, tách chiết DNA và kiểm tra VỚI Cặp mồi đặc hiệu FserC/RserC. Nội dung 2: Khảo sát mối quan hệ di truyền giữa các chủng Edwardsiella ictaluri.
TONG QUAN TAI LIEU 2. Kỹ thuật rep-PCR Repetitive PCR (rep-PCR) là một phương pháp xác định kiểu gen đơn giản thông qua việc sử dụng mồi oligonucletide bắt cặp với các vùng lặp lại nằm rải rác trên khắp bộ gen của vi khuân. Bằng cách dùng PCR, các vùng DNA với kích thước khác nhau có chứa đoạn trình tự lặp lại sẽ được khuếch đại, từ đó tạo ra các kiểu vạch (banding patterns) đặc trưng cho từng dòng vi khuẩn (Mohapatra và ctv, 2007) (Hình 2. mart ne ¬ L7 we | POR <n Repeat | —— eae — Sequence 9.
— xi=— ta414194J]_— tHuuadtt * Hình 2. Nguyên lý hoạt động của rep-PCR. Kỹ thuật PCR dùng môi thiết kế trên các chuỗi lặp (Rep-PCR, repetitive sequence primed PCR = repetitive element - based PCR) đã được ứng dụng nhiều do có ưu điểm là đơn giản (chi dựa trên PCR) và tin cậy. Kỹ thuật nguyên ban sử dung các mỗi được thiết kế dựa trên các chuỗi lặp trên bộ gen vi khuẩn như các chuỗi lặp đối song vùng không mã hóa (REP, repetitive extragenic palindromic) có kích thước 35 - 40 bp, các chuỗi lặp bảo thủ vùng liên gen (ERIC, enterobacterial repetitive intergenic consensus) có kích thước 124 - 127 bp, chuỗi BOX có kích thước 54 bp.
Phản ứng PCR sử dụng các mỗi này được goi cụ thé là REP-PCR, ERIC-PCR và BOX-PCR (Rademaker và ctv, 2004). Các đoạn trình tự bao tồn này được chia làm 4 nhóm: trình tự repetitive extragenic palindromic (REP), trình tự enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC), trình tự BOX và trình tự polytrinucleotide (GTG)s sequences (Versalovic va ctv, 1994). Nam phương pháp rep-PCR thường được dùng dé xác định kiểu gen của các chủng vi khuẩn khác nhau là REP-PCR (với mỗi Rep1R-I và Rep2-I); ERIC-PCR (với mỗi ERICIR và ERIC2); ERIC2-PCR (với mỗi ERIC2); BOX-PCR (với mỗi BOX-A1R); và (GTG)s- PCR (với mồi (GTG)s) (Mohapatra va ctv, 2007). Thành phần ERIC2-PCR bao gồm: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,1% (vol/vol) Triton X-100, 1,8 mM MgCh, dNTP 125 uM, 100 pmol mỗi, 2,5 U Taq polymerase và 4 L dung dich DNA và nước tổng thể tích cuối cùng là 20 wL.
Chu trình nhiệt: tiền biến tính 1 chu ky 95°C - 5 phút, 35 chu kỳ (biến tính 92°C - 45 giây, bat cặp 52°C - I phút, kéo dai 70°C - 10 phút), 1 chu kỳ hậu kéo dai 70°C - 20 phút. Thành phần SERE-PCR gồm: 5 mM MgC]:, 10 mM (NHa4)2SOa, 37,5 mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,005% (wt/vol) Tween 80, dNTP 125 uM, 2,5 U Taq polymerase, 50 pmol mỗi và 12 pL dung dich DNA va nước tong thé tích cuối cùng là 30 pL. Chu trình nhiệt: tiền biến tính 1 chu ky 95°C - 5 phút, 35 chu kỳ (biến tính 94°C - 1 phút, bat cặp 50°C - 1 phút, kéo dai 72°C - 2 phút), 1 chu kỳ hậu kéo dài 72°C - 15 phút. Thành phan: 1X DreamTaq Mastermix (Thermo scientific, Mỹ): 10 wL, 50 ng DNA: 1 uL, 10 uM mồi: 1 WL và nước vô trùng: 8 pL, với tổng thé tích 20 uL.
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy Mastercycler (Eppendorf, Đức) với chu trình nhiệt như sau: | chu kỳ 95°C 5 phút, 35 chu kỳ (95°C - 30 giây , 40°C - 30 giây, 72°C - 1 phút 30 giây), và 1 chu ky 72°C - 10 phút, sau đó giữ ở 10°C. Thành phan 4 phan ứng: thê tích tổng là 25 pL với Thermo Scientific Dream Taq Green PCR master mix, 0.5 uM mỗi và 50 ng DNA. Chu trình nhiệt 1 chu ky 95°C 5 phút, 30 chu ky (94°C - 30 giây , 40°C - 30 giây, 65°C - 30 giây), và 1 chu ky 65°C - 10 phút, sau đó giữ ở 4°C. Kỹ thuật PCR 2.
Phương pháp PCR Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm 1985 va Saiki hoàn thiện năm 1988. Phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thé thu nhận rất nhiều bản sao DNA. Kỹ thuật PCR có thé được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chân đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột bién định hướng, nghiên cứu sự tiễn hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,.
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tong hop DNA dựa trên mach khuôn là một trình tu dich DNA ban dau, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp moi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA nay. Primer là những đoạn DNA ngan, co kha nang bat cap bố sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dai dé hình thành mach mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng Ethidium bromide và có thé thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ dé tạo các primer bồ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thuy Dương, 2003).
Phan ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lap lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau : Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation) Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 — 95°C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách 5 thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bồ sung mới. Bước 2: (bắt cặp, annealing) Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn.
Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 - 65°C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 - 60 giây. Bước 3: (kéo dai, elongation - extension) Nhiệt độ được tăng lên 72°C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bô sung với mạch khuôn.
Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ đài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau: Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa n: Là số chu kỳ Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân ban được thành 23° đến 24° bản sao, tức là đến hang tỷ ban sao. 30 - 40 cycles of 3 steps : / 00000000000 OS’ TA NÊN 1 minut 94 °C II Step 52: annealing s c 45 seconds 54 °C ; | k | forward and reverse | mn 5's primers !!! | 3 ‘Step 3 : extension ||] `3 | a ` „œ“ _JIlJWIlI(ULLLLLUILLIHILIÍ 3!