CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. ENZYM LIPASE TỤY 1. Vai trò Phần lớn chất béo trong thức ăn nằm ở dạng triacylglycerol hay triglycerid.
Triglycerid cần phải được thuỷ phân tạo các phân tử đơn giản hơn như monoacylglycerol và các acid béo tự do để được hấp thu vào máu.10 Lipase tụy (triacylglycerol acylhydrolase EC 3.3) được tiết ra bởi tế bào ngoại tiết của tuyến tụy và xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết este trong triglycerid (Hình 1. Phản ứng thủy phân triglycerid của enzym lipase tụy10. Lipase chịu trách nhiệm thủy phân đến 50–70% lượng chất béo trong bữa ăn để tạo thành monoglycerid và các acid béo tự do. Các sản phẩm này sẽ kết hợp với cholesterol, acid mật và acid lysophosphatidic để hình thành nên hạt micell.
Sau đó, các hạt micell sẽ được hấp thu bởi tế bào biểu mô ruột để tiếp tục tiến hành quá trình tái tổng hợp tạo triglycerid và sau đó được tích trữ tại mô mỡ (Hình 1.10 Do đó, ức chế lipase tụy sẽ góp phần giảm hấp thu chất béo trong thức ăn và hỗ trợ việc điều trị béo phì. Quá trình hấp thu và dự trữ chất béo sau khi ăn. 2 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu 1. Cấu trúc lipase tụy người (Human pancreatic lipase: HPL) Cấu trúc tinh thể của enzym lipase tụy người đã được Marie–Pierre Egloff và các cộng sự xác định bằng phương pháp nhiễu xạ tia X vào năm 1994 với độ phân giải 2,46 Å.11 Lipase tụy người gồm một chuỗi đơn gồm 449 acid amin liên kết với một colipase.
Chuỗi đơn được chia thành 2 vùng:11,12 –Vùng N tận (acid amin 1–336) –Vùng C tận (acid amin 337−449) Vùng N tận Vùng C tận Colipase Hình 1. Cấu trúc enzym lipase tụy người (PDB: 1LPB). Dải màu xanh là vùng N tận, dải màu tím là vùng C tận và dải màu cam là colipase. Vùng N tận Vùng N tận chứa vị trí gắn kết với cơ chất và chịu trách nhiệm cho khả năng xúc tác của enzym.
Theo Chen và cộng sự (2012), vị trí gắn kết của HPL chứa hai vùng kỵ nước song song. Các acid amin đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành liên kết kỵ nước với cơ chất là Phe77, Ile78, Tyr114, Ile209 và Phe215. Ngoài vùng kỵ nước, His280 và Tyr131 cũng là các acid amin quan trọng trong việc hình thành liên kết hydro với các chất.13 Vùng N tận có chứa bộ ba xúc tác Ser152–His263–Asp176.14 Trong đó, acid amin serin 152 đóng vai trò then chốt cho hoạt động thủy phân liên kết este (Hình 1.15 Khi serin 152 bị thay đổi về mặt hóa học, khả năng xúc tác của enzym cũng bị giảm sút.10 3 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu a b Ser15 2 His263 Asp17 6 c Hình 1. Khoang gắn kết và cơ chế xúc tác phản ứng thuỷ phân triglycerid.(a) Vị trí khoang gắn kết và bộ ba xúc tác.
(b) Khoang gắn kết của lipase tụy người với các acid amin quan trọng. (c) Cơ chế thủy phân chất béo của bộ ba xúc tác. Vùng N tận còn chứa cấu trúc nắp. Cấu trúc này là vòng xoắn có bề mặt được tạo nên bởi cầu nối disulfid giữa Cys237 và Cys267.
Cấu trúc nắp cùng với hai vòng xoắn cuộn β5–loop (acid amin 76 đến 85) và β9–loop (acid amin 204 đến 224) bao phủ vị trí gắn kết của enzym.16 Phụ thuộc vào vị trí của cấu trúc nắp mà enzym lipase tụy người có 2 trạng thái đóng và mở. Ở trạng thái đóng, cấu trúc nắp tạo liên kết Van der Waals với hai vòng xoắn cuộn β5–loop và β9–loop, cản trở sự tiếp xúc của cơ chất với vị trí xúc tác của enzym (Hình 1. Sự hiện diện của micell hỗn hợp octylglucosidase và phospholipid sẽ làm enzym chuyển sang trạng thái mở. Lúc này, cấu trúc nắp sẽ quay một khoảng 29 Å 4 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu về phía colipase, kéo theo vòng cuộn xoắn β5–loop ra khỏi vị trí ban đầu.
Nhờ đó, vùng ái điện tử tạo bởi các nitrogen của acid amin Phe77 và Leu153 được hình thành và giúp tăng cường sự ổn định của các chất trong vị trí gắn kết. Cấu trúc nắp của enzym lipase tụy người (PDB: 1LPB). Vùng C tận Vùng C tận có cấu trúc “sandwich”, gồm hai vòng kẹp cung cấp bề mặt liên kết chính cho colipase để hoạt hóa enzym. Hai vòng kẹp của vùng C tận được tạo thành bởi acid amin 44 đến 46 và 65 đến 87.16 Colipase Colipase là phân tử có 95 acid amin, có trọng lượng phân tử 10 kDa.
Colipase là một đồng yếu tố được tiết ra bởi các tế bào tuyến tụy dưới dạng tiền chất (procolipase) và được chuyển thành colipase tại tá tràng. Colipase giữ vai trò neo enzym lipase vào muối mật để đưa đến mặt phân cách lipid–nước, tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động thủy phân chất béo của lipase tụy. Hoạt động thủy phân của lipase tụy là kết quả của tác dụng tổng hợp của lipase, colipase và muối mật.14 5 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu 1. Cấu trúc lipase tụy lợn Trong số các chế phẩm enzym lipase lấy từ các nguồn khác nhau (người, động vật, thực vật và vi sinh vật), enzym lipase tụy lợn là chế phẩm có giá thành rẻ nhất và là lipase được sử dụng rộng rãi trong các phản ứng biến đổi sinh học và thay thế lipase tụy người trong thử nghiệm in vitro ức chế lipase tụy.14 Lipase tụy lợn hoạt động tốt trong khoảng pH từ 7,3–9,0.14 Ở 30 oC, lipase sẽ duy trì được 85% hoạt tính ban đầu (hoạt tính ở 20 oC) khi sau khi ủ 1 giờ trong dung dịch đệm.17 Tuy nhiên, so với enzym tụy người, lipase tụy lợn kém tinh khiết hơn và khả năng xúc tác yếu hơn.
Cấu trúc enzym lipase tụy lợn (PDB: 1ETH). Dải màu xanh là vùng N tận, dải màu tím là vùng C tận và dải màu cam là colipase. Cấu trúc lipase tụy lợn (PDB ID: 1ETH) được xác định bằng phương pháp nhiễu xạ tia X với độ phân giải 2,8 Å bởi Hermoso và cộng sự vào năm 1996.18 Lipase tụy lợn là một protein với chuỗi đơn có 449 acid amin với trọng lượng phân tử là 50.18 Cấu trúc lipase tụy lợn được chia thành hai vùng là vùng N tận và vùng C tận với số lượng acid amin và chức năng tương tự như lipase tụy người.14 Cấu trúc colipase liên kết với lipase tụy lợn cũng không có nhiều điểm khác biệt so với lipase tụy người. Vùng N tận của lipase tụy lợn có chứa bộ ba xúc tác Ser–His–Asp ở vị trí 153, 264 và 177.
Tương tự như enzym lipase tụy người, lipase tụy lợn cũng có cấu trúc nắp (dải màu đỏ trên Hình 1.6) và vòng xoắn β5–loop (dải màu vàng trên Hình 1.6) bao phủ lấy vị trí gắn kết. Cấu trúc mở của nắp trong enzym lipase tụy lợn được ổn định 6 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu bằng các liên kết hydro giữa nắp và colipase, cho phép sự tiếp cận của cơ chất đến vị trí hoạt động của lipase.18,19 Vị trí gắn kết của lipase tụy lợn bao gồm một số acid amin quan trọng như sau: Gly77, Phe78, Ile79, Asp80, Trp86, Tyr115, His152, Ser153, Leu154, Asp177, Pro181, His264 và Leu265.20 Nhìn chung, cấu trúc tổng thể của enzym lipase tụy lợn gần giống với cấu trúc enzym lipase tụy chưa hoàn chỉnh ở người và ngựa. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GẮN KẾT IN VITRO BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẮT HUỲNH QUANG 1. Huỳnh quang và sự tắt huỳnh quang Phân tử huỳnh quang (fluorophore) là hợp chất hóa học có thể phát ra ánh sáng huỳnh quang khi bị kích thích bởi nguồn sáng.
Trong cấu trúc các hợp chất này có sự hiện diện của một số vòng thơm kết hợp với nhau hoặc các phân tử phẳng/liên hợp với một số liên kết 21 Các hợp chất này có thể hấp thụ năng lượng ánh sáng (có bước sóng nhất định) và có thể phát xạ năng lượng này dưới dạng bước sóng dài hơn. Huỳnh quang là hiện tượng quang phát quang (photoluminescence), liên quan đến quá trình hấp thụ và phát xạ ánh sáng của phân tử huỳnh quang (fluorophore).22 Hiện tượng phát huỳnh quang có thể được giải thích qua biểu đồ Jablonski (Hình 1. 7 Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu − Hấp thu ánh sáng: Khi phân tử hấp thụ photon ánh sáng trong vùng UV–Vis, electron hóa trị của phân tử sẽ chuyển từ mức năng lượng ở trạng thái cơ bản (S0) lên mức năng lượng ở trạng thái kích thích (S1 hoặc S2). Ở mỗi trạng thái, phân tử có thể tồn tại ở một số mức năng lượng dao động (0, 1, 2…).
Các phân tử có thể được kích thích lên các mức năng lượng cao hơn S1 nhưng nhanh chóng trở về S1. Quá trình này được gọi là sự chuyển nội hệ. Từ các mức năng lượng cao hơn, electron trở về mức năng lượng thấp hơn trong cùng trạng thái kích thích, giải phóng một phần năng lượng do sự tự va chạm, gọi là dao động hồi phục. − Phát huỳnh quang: Sau đó, electron từ mức năng lượng dao động thấp nhất của trạng thái kích thích S1 trở về trạng thái cơ bản S0, giải phóng năng lượng hấp thụ còn lại và phát huỳnh quang.
Bước sóng ánh sáng phát xạ phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa 2 mức năng lượng S0 và S1.22,23 Do năng lượng phát huỳnh quang thấp hơn năng lượng kích thích (một phần năng lượng mất đi do sự tự va chạm) nên bước sóng phát xạ sẽ dài hơn bước sóng kích thích. Sự tắt huỳnh quang Tắt huỳnh quang là hiện tượng liên quan đến quá trình làm giảm cường độ phát huỳnh quang của phân tử huỳnh quang. Nhiều loại tương tác phân tử có thể dẫn đến tắt quang, bao gồm: phản ứng ở trạng thái kích thích (excited–state reactions), tái sắp xếp phân tử (molecular rearrangement), chuyển dịch năng lượng (energy transfer), hình thành phức hợp ở trạng thái cơ bản (ground–state complex formation) và tắt quang do va chạm (collisional quenching).23 Sự tương tác giữa phân tử huỳnh quang (fluorophore) và chất tắt quang (quencher) có thể dẫn đến tắt quang do va chạm.23 Sự tắt quang này được áp dụng trong nghiên cứu các quá trình hoá sinh dựa trên nguyên tắc tương tác giữa các phân tử (ví dụ như protein và phối tử) có thể dẫn đến sự tắt quang. Việc xác định và đánh giá các thông số của quá trình tắt quang được dùng để phân tích tương tác hay gắn kết có thể xảy ra giữa các phân tử.