Khảo Sát Một Số Biến Thể Trên Gene LDLRAP1 và STAP1 Ở Người Việt Nam Bằng Phương Pháp PCR

Khảo sát biến thể gene ldlrap1 và stap1 ở người Việt Nam bằng phương pháp PCR và giải trình tự, cung cấp thông tin gen quan trọng.

• Tác giả: Hồ Châu Quí
• Người hướng dẫn: TS. Trương Kim Phượng
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Biến Thể Gene LDLRAP1 và STAP1 Ở Người Việt Nam
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN I: TỔNG QUAN
• 1.1. TỔNG QUAN BỆNH TĂNG CHOLESTEROL MÁU DI TRUYỀN MANG TÍNH GIA ĐÌNH (FH)
• 1.2. TỔNG QUAN GENE MỤC TIÊU
• 1.3. TÌNH HÌNH MẮC BỆNH FH Ở KHU VỰC ĐÔNG NAM Á VÀ THẾ GIỚI
• 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN CỦA GENE LDLRAP1, STAP1
• 1.5. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GENE LDLRAP1 VÀ STAP1
• 1.6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TỔNG HỢP (META – ANALYSIS)
• 2. PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Các công cụ tin sinh học
• 2.2. Mẫu bệnh phẩm
• 2.3. Các thiết bị và hoá chất
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Khai thác dữ liệu
• 2.4.2. Phân tích tổng hợp (Meta – analysis)
• 2.4.3. Khảo sát trên máy tính ở gene LDLRAP1 và STAP1
• 2.4.4. Khảo sát thực nghiệm
• 3. PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KHAI THÁC DỮ LIỆU
• 3.2. KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM
• 4. PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHẦN PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Bệnh FH Biến Thể Gene LDLRAP1 và STAP1

Bệnh tăng cholesterol máu di truyền mang tính gia đình (FH) là một rối loạn di truyền phổ biến, gây tăng nồng độ lipoprotein cholesterol mật độ thấp (LDL-C). Đa phần bệnh nhân FH chưa được chẩn đoán và điều trị sớm, đặc biệt ở các nước có thu nhập thấp và trung bình. Việc không được chẩn đoán và điều trị kịp thời làm tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch ở độ tuổi trẻ. Nghiên cứu về các biến thể gene LDLRAP1 và STAP1 ở người Việt Nam có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện chẩn đoán và điều trị bệnh FH. Theo Truong và cộng sự (2020), tỷ lệ bệnh nhân FH được chẩn đoán và điều trị sớm thường dưới 1% ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, cho thấy sự cần thiết của các nghiên cứu sâu rộng hơn về khảo sát di truyền. Phát hiện sớm các đột biến gene sẽ giúp các biện pháp phòng ngừa bệnh tim mạch được thực hiện hiệu quả hơn. Cần có những nghiên cứu sâu hơn để đánh giá đúng nguy cơ mắc bệnh và có phương pháp điều trị phù hợp.

1.1. Tăng Cholesterol Máu Di Truyền FH Khái Niệm Quan Trọng

Tăng cholesterol máu di truyền mang tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là một rối loạn di truyền trội phổ biến đơn gene, dẫn đến tăng cao nồng độ lipoprotein cholesterol mật độ thấp (LDL – C) trong máu. Việc chẩn đoán và điều trị sớm bệnh FH vẫn còn hạn chế ở nhiều quốc gia. Theo nghiên cứu của Truong et al. (2020), việc điều trị hiệu quả bệnh FH còn gặp nhiều thách thức do tỉ lệ chẩn đoán thấp. Do đó việc khảo sát di truyền nhằm xác định các biến thể gene ở người Việt Nam là vô cùng cần thiết để giúp việc chẩn đoán sớm và điều trị hiệu quả hơn.

1.2. Yếu Tố Nguy Cơ FH Ảnh Hưởng Biến Thể Gene LDLRAP1 và STAP1

Nhiều yếu tố có thể dẫn đến tăng cholesterol máu, bao gồm tuổi tác, giới tính, hút thuốc, chế độ ăn uống, ít vận động và tiền sử bệnh tim mạch của cá nhân và gia đình. Phòng ngừa bệnh FH, dù nguyên phát hay thứ phát, vẫn còn nhiều thách thức do thiếu các triệu chứng rõ ràng. Việc phát hiện, điều trị, chẩn đoán và kiểm soát lượng cholesterol cao trên toàn cầu còn nhiều hạn chế. Các biến thể gene LDLRAP1 và STAP1 có thể ảnh hưởng đến hiệu quả hấp thu và thanh thải LDL trong tế bào gan, làm tăng nồng độ cholesterol toàn phần và LDL-C. Việc hiểu rõ các yếu tố nguy cơ và cơ chế bệnh sinh của FH là rất quan trọng để phát triển các chiến lược phòng ngừa và điều trị hiệu quả.

II. Đột Biến Gene LDLRAP1 STAP1 Liên Quan Đến Bệnh FH

Bệnh FH được biết đến là một bệnh di truyền trên nhiễm sắc thể thường. Gulizia và cộng sự (2020) ghi nhận hai dạng đột biến di truyền: tăng cholesterol máu di truyền trội (ADH) và lặn (ARH). ARH liên quan đến sự chuyển hóa các thụ thể LDL trong gan, dẫn đến tăng cholesterol máu gia đình đồng hợp tử (HoFH). ADH là một trong những rối loạn di truyền thường gặp nhất, đặc trưng bởi nồng độ LDL-C cao, dẫn đến các biến chứng tim mạch. Các biến thể gene trong trường hợp bệnh liên quan đến gene trội (ADH) là gene STAP1, và gene lặn (ARH) là gene LDLRAP1. Phát hiện các đột biến này có thể giúp xác định nguy cơ mắc bệnh và có hướng điều trị phù hợp. Theo Bertolini và cộng sự (2020), gene STAP1 và gene LDLRAP1 có liên quan đến tăng cholesterol máu di truyền.

2.1. ADH và ARH Hai Dạng Đột Biến Di Truyền Gene Thường Gặp

Tăng cholesterol máu di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường (ADH) và tăng cholesterol máu di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường (ARH) là hai dạng đột biến di truyền chính liên quan đến bệnh FH. ADH liên quan đến gene STAP1, trong khi ARH liên quan đến gene LDLRAP1. ADH là một trong những rối loạn di truyền thường gặp nhất, trong khi ARH hiếm gặp hơn. Hiểu rõ cơ chế di truyền của hai dạng này có vai trò quan trọng trong chẩn đoán và điều trị.

2.2. Biến Thể Gene STAP1 và LDLRAP1 Vai Trò Trong Di Truyền FH

Các biến thể đột biến trong trường hợp bệnh liên quan đến gene trội (ADH) là gene STAP1, và gene lặn (ARH) là gene LDLRAP1. Các đột biến này ảnh hưởng đến chức năng của các protein tương ứng, gây ra rối loạn chuyển hóa lipid và tăng nồng độ cholesterol trong máu. Việc xác định các biến thể gene cụ thể ở người Việt Nam sẽ giúp cá nhân hóa điều trị và cải thiện tiên lượng bệnh.

III. Khảo Sát Gene LDLRAP1 STAP1 Phương Pháp PCR và Giải Trình Tự

Các tỷ lệ ở trường hợp mắc bệnh FH (>90%) đột biến ở thụ thể LDL (LDLR) với > 2000 biến thể gây bệnh hoặc có khả năng gây bệnh FH. Khoảng 5% - 10% trường hợp mắc bệnh FH do đột biến ở vùng liên kết với thụ thể LDL của gene APOB. Các đột biến hiếm gặp trong gene STAP1 và LDLRAP1 cũng đã được tìm thấy ở trong bệnh FH có 20 đến 40% trường hợp không phát hiện đột biến hiếm này. Phương pháp PCR và giải trình tự gene được sử dụng để xác định các biến thể gene LDLRAP1 và STAP1. Các kết quả xét nghiệm gene cho phép phát hiện sớm bệnh FH, cung cấp thông tin quan trọng cho tư vấn di truyền và quyết định điều trị. Việc triển khai rộng rãi các phương pháp xét nghiệm này có thể giúp giảm gánh nặng bệnh tật do FH.

3.1. Tầm Quan Trọng của Giải Trình Tự Gene trong Chẩn Đoán FH

Giải trình tự gene là một phương pháp mạnh mẽ để xác định các đột biến trong gene LDLRAP1 và STAP1. Bằng cách giải trình tự DNA của bệnh nhân, các nhà khoa học có thể xác định các biến thể di truyền gây ra bệnh FH. Thông tin này có thể được sử dụng để tư vấn di truyền, giúp bệnh nhân hiểu rõ hơn về nguy cơ của họ và đưa ra quyết định sáng suốt về sức khỏe của mình.

3.2. Kỹ Thuật PCR Khuếch Đại Gene Mục Tiêu Hiệu Quả

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp quan trọng để khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu, cho phép phân tích các biến thể gene một cách chính xác và hiệu quả. PCR được sử dụng để tăng số lượng các bản sao của gene LDLRAP1 và STAP1, giúp việc giải trình tự và phân tích trở nên dễ dàng hơn. Quá trình này giúp các nhà nghiên cứu tìm ra đột biến điểm, đa hình gene liên quan đến bệnh FH.

IV. Chức Năng Gene LDLRAP1 STAP1 Ảnh Hưởng Đến Lipid Máu

Gene LDLRAP1 (Low-density lipoprotein receptor adaptor protein 1) mã hóa protein LDLRAP1, một phần quan trọng của quá trình nội tiết qua trung gian clathrin ở gan đối với cholesterol máu. Các biến thể đột biến trên gene LDLRAP1 là nguyên nhân gây ra chứng tăng cholesterol máu di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường (ARH). Gene STAP1 (Signal-transducing adaptor protein 1) cũng đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa lipid máu. Sự giảm thiểu của protein LDLRAP1 và thụ thể LDL do các đột biến null gây ra khiến cho tế bào gan và tế bào lympho không sản xuất đủ protein LDLR. Do đó, việc nghiên cứu chức năng của các protein này và ảnh hưởng của các đột biến là rất quan trọng.

4.1. Vai Trò Của Protein LDLRAP1 Trong Chuyển Hóa Cholesterol

Protein LDLRAP1 là một phần quan trọng của quá trình nội tiết qua trung gian clathrin ở gan đối với cholesterol máu. Protein này có khả năng tái chế thụ thể LDL trên bề mặt tế bào gan, giúp ngăn ngừa các bệnh tim mạch. Các đột biến trên gene LDLRAP1 có thể làm giảm hiệu quả của quá trình này, dẫn đến tăng nồng độ cholesterol trong máu.

4.2. Chức Năng Của Protein STAP1 Tín Hiệu và Điều Hòa Lipid

Protein STAP1 (Signal-transducing adaptor protein 1) tham gia vào nhiều quá trình tế bào, bao gồm truyền tín hiệu và điều hòa lipid. Các đột biến trên gene STAP1 có thể ảnh hưởng đến các quá trình này, dẫn đến rối loạn chuyển hóa lipid và tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Nghiên cứu sâu hơn về chức năng của protein STAP1 có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị mới cho bệnh FH.

V. Tình Hình Nghiên Cứu Biến Thể Gene LDLRAP1 STAP1 Tại VN

Nghiên cứu về biến thể gene LDLRAP1 và STAP1 ở người Việt Nam còn hạn chế. Tuy nhiên, việc xác định các đột biến gene phổ biến trong cộng đồng có ý nghĩa quan trọng trong việc tầm soát và điều trị bệnh FH. Nghiên cứu này áp dụng phân tích tổng hợp để phản ánh mức độ đột biến trên các gene LDLRAP1 và STAP1 một số biến thể nổi trội nằm trên các nhóm bệnh nhân tăng cholesterol trong máu dạng tiên phát trên thế giới. Đồng thời, bước đầu xây dựng quy trình PCR kết hợp giải trình tự trên 2 gene mục tiêu LDLRAP1 và STAP1 ở nhóm người bệnh tăng cholesterol trong máu ở Việt Nam. Các kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho các nhà di truyền học, bác sĩ và bệnh nhân.

5.1. Phân Tích Dữ Liệu Tổng Hợp Mức Độ Đột Biến Gene

Phân tích dữ liệu tổng hợp (meta-analysis) được sử dụng để đánh giá mức độ đột biến trên các gene LDLRAP1 và STAP1 ở các nhóm bệnh nhân tăng cholesterol máu trên thế giới. Phương pháp này cho phép tổng hợp các kết quả từ nhiều nghiên cứu khác nhau, cung cấp cái nhìn tổng quan và chính xác hơn về tần suất và phân bố của các biến thể gene.

5.2. Xây Dựng Quy Trình PCR Giải Trình Tự Gene Tại Việt Nam

Việc xây dựng quy trình PCR kết hợp giải trình tự trên hai gene mục tiêu LDLRAP1 và STAP1 ở người Việt Nam là một bước quan trọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị FH hiệu quả. Quy trình này cho phép xác định các biến thể gene cụ thể ở người Việt Nam, từ đó cá nhân hóa điều trị và cải thiện tiên lượng bệnh.

VI. Kết Luận Ý Nghĩa Nghiên Cứu Gene LDLRAP1 STAP1 và FH

Nghiên cứu về biến thể gene LDLRAP1 và STAP1 ở người Việt Nam có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa bệnh FH. Việc phát hiện sớm các đột biến gene sẽ giúp triển khai các biện pháp phòng ngừa bệnh tim mạch hiệu quả hơn. Cần có những nghiên cứu sâu hơn để đánh giá đúng nguy cơ mắc bệnh và có phương pháp điều trị phù hợp. Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các chương trình tầm soát di truyền và tư vấn di truyền cho các gia đình có nguy cơ mắc bệnh FH. Ứng dụng y học cá nhân hóa trong điều trị FH là một hướng đi đầy hứa hẹn.

6.1. Tầm Quan Trọng Của Tầm Soát và Tư Vấn Di Truyền FH

Tầm soát di truyền và tư vấn di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các cá nhân và gia đình có nguy cơ mắc bệnh FH. Tầm soát di truyền giúp phát hiện sớm các biến thể gene gây bệnh, từ đó có thể triển khai các biện pháp phòng ngừa và điều trị kịp thời. Tư vấn di truyền cung cấp thông tin và hỗ trợ cho các gia đình, giúp họ hiểu rõ hơn về nguy cơ của mình và đưa ra quyết định sáng suốt về sức khỏe.

6.2. Y Học Cá Nhân Hóa Hướng Đi Mới Trong Điều Trị FH

Y học cá nhân hóa là một hướng đi đầy hứa hẹn trong điều trị bệnh FH. Bằng cách phân tích các biến thể gene cụ thể của từng bệnh nhân, các bác sĩ có thể đưa ra các phác đồ điều trị phù hợp và hiệu quả hơn. Ứng dụng y học cá nhân hóa có thể giúp giảm thiểu tác dụng phụ của thuốc và cải thiện tiên lượng bệnh cho bệnh nhân FH.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Tăng lipid máu (dyslipidaemia) là nhóm bệnh lý rối loạn chuyển hóa lipid đặc trưng bởi sự thay đổi bất thường các chỉ số mỡ trong máu. Đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu dẫn đến các bệnh lý tim mạch (CVD) nguy hiểm và đang có xu hướng trẻ hóa rõ rệt trong cộng đồng. Trong đó, tăng cholesterol máu di truyền mang tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là một rối loạn di truyền đơn gene phổ biến, làm gia tăng nghiêm trọng nồng độ cholesterol gắn với lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-C) trong tuần hoàn. Bệnh nhân FH nếu không được chẩn đoán và can thiệp hạ lipid máu kịp thời ở độ tuổi từ 20 đến 39 sẽ có nguy cơ tử vong do biến cố mạch vành tăng gấp 100 lần so với quần thể người bình thường.

Về dịch tễ học, ước tính trên thế giới có khoảng 34 đến 35 triệu người mắc bệnh FH. Tỷ lệ mắc kiểu hình dị hợp tử (HeFH) dao động trong khoảng 1:200 đến 1:250 dân số, trong khi kiểu hình đồng hợp tử (HoFH) hiếm gặp hơn với tần suất khoảng 1:1.000 đến 1:300.000 dân số. Tại Việt Nam, với quy mô dân số xấp xỉ 97 triệu người, ước tính có khoảng 500.000 bệnh nhân FH. Tuy nhiên, tỷ lệ được chẩn đoán sớm hiện dưới 10% và số bệnh nhân được điều trị hạ lipid máu tích cực chiếm chưa đến 5%. Sự gia tăng tỷ lệ thừa cân, béo phì (tăng từ 9,2% lên 21,5% trong vòng 20 năm qua) cùng với lối sống thiếu vận động và chế độ ăn nhiều đường, muối càng làm trầm trọng thêm các biến chứng tim mạch.

Phần lớn các ca bệnh FH (>90%) bắt nguồn từ đột biến trên gene thụ thể LDL (LDLR), khoảng 5–10% do đột biến gene APOB và 1–2% liên quan đến đột biến tăng chức năng gene PCSK9. Tuy nhiên, có từ 20% đến 40% các trường hợp lâm sàng không tìm thấy đột biến trên ba gene kinh điển này mà xuất phát từ các gene hiếm như LDLRAP1 (chiếm <1%) và STAP1 (chiếm khoảng 1,3%). Tại Việt Nam, các nghiên cứu thực nghiệm xác định tính chất đột biến điểm trên hai gene LDLRAP1 và STAP1 còn rất hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận:

1. Áp dụng phương pháp phân tích tổng hợp (meta-analysis) để đánh giá tỷ lệ và đặc điểm phân bố các đột biến trên gene LDLRAP1 và STAP1 ở các nhóm bệnh nhân tăng cholesterol máu trên thế giới.
2. Bước đầu xây dựng quy trình kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự nhằm khảo sát các biến thể trên hai gene mục tiêu LDLRAP1 và STAP1 ở nhóm bệnh nhân tăng cholesterol máu tại Việt Nam.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Khai thác dữ liệu y sinh và tổng quan hệ thống các công bố khoa học quốc tế về bệnh FH liên quan đến gene LDLRAP1 và STAP1 cập nhật đến tháng 05/2023.
2. Tiến hành phân tích tổng hợp chỉ số tỷ lệ (Proportion) và đánh giá độ bất đồng nhất dữ liệu ($I^2$) bằng phần mềm chuyên dụng.
3. Khảo sát tin sinh học (in silico) để đánh giá và thiết kế các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại vùng exon mục tiêu.
4. Triển khai thực nghiệm tách chiết DNA, đo mật độ quang học (OD), tối ưu hóa phản ứng PCR và điện di sản phẩm trên mẫu máu bệnh phẩm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Dữ liệu dịch tễ phân tử từ các bài báo khoa học quốc tế về gene LDLRAP1, STAP1; 12 mẫu DNA tách chiết từ máu ngoại vi (ký hiệu M1–M12) của các bệnh nhân có chỉ số LDL-C cao bất thường.
• Phạm vi không gian: Bộ mẫu bệnh phẩm được thu thập tại khu vực TP. Hồ Chí Minh (kế thừa từ đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ mã số MBS-2018-08).
• Phạm vi thời gian: Dữ liệu công bố quốc tế được thu thập và tổng hợp đến tháng 05/2023; các nội dung thực nghiệm được tiến hành trong năm 2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và gene mục tiêu

1. Gene LDLRAP1 (Low-density lipoprotein receptor adaptor protein 1):

   • Vị trí di truyền: Nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 1 (1p36.11), kích thước 25 kb, cấu trúc gồm 9 exon, mã hóa chuỗi protein dài 308 axit amin.
   • Cơ chế sinh học: Protein LDLRAP1 đóng vai trò là protein tiếp hợp liên kết với miền tế bào chất của thụ thể LDLR, clathrin và phức hợp AP-2, tham gia vào quá trình nội hóa thụ thể LDLR qua túi clathrin tại tế bào gan và lympho.
   • Tính chất di truyền: Các đột biến vô nghĩa, đột biến dịch khung dạng mất chức năng (null mutation) trên gene LDLRAP1 là nguyên nhân gây bệnh tăng cholesterol máu di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường (Autosomal Recessive Hypercholesterolemia - ARH).

2. Gene STAP1 (Signal-transducing adaptor protein 1 / BRDG1):

   • Vị trí di truyền: Nằm trên nhiễm sắc thể số 4 (4q13.2), kích thước 259 kb, gồm 10 exon, mã hóa protein 259 axit amin.
   • Cơ chế sinh học: Protein STAP1 mang miền tương đồng Pleckstrin (PH) và Src-homology 2 (SH2), liên kết với phosphoinositide tại màng tế bào và hoạt động ở hạ nguồn đường truyền tín hiệu PI3K/Akt và các kinase họ Tec (Btk).
   • Tính chất di truyền: Các đột biến trên gene STAP1 liên quan đến chứng tăng cholesterol máu di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường (Autosomal Dominant Hypercholesterolemia - ADH).

Phương pháp nghiên cứu thực tế

• Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta-analysis): Áp dụng quy trình chuẩn PRISMA để chọn lọc dữ liệu từ các cơ sở dữ liệu PubMed/Medline, NCBI, Google Scholar. Sử dụng phần mềm MedCalc® (phiên bản 19.1) để tính toán tỷ lệ tổng thể (Proportion), khoảng tin cậy 95% (95% CI) theo mô hình hiệu ứng ngẫu nhiên (Random effects model) và mô hình hiệu ứng cố định (Fixed effect model); kiểm định độ bất đồng nhất ($I^2$) và vẽ biểu đồ Forest plot, Funnel plot.
• Công cụ tin sinh học (in silico): Sử dụng BLAST (NCBI) để kiểm tra độ tương đồng và đặc hiệu của mồi; Annhyb (phiên bản 4.946) kiểm tra vị trí bắt cặp và kích thước sản phẩm; phần mềm IDT OligoAnalyzer kiểm tra nhiệt độ nóng chảy ($T_m$), tỷ lệ GC% và cấu trúc thứ cấp (hairpin, dimer); GeneCards, LOVD, Chromas, CodonCode Aligner để quản lý dữ liệu trình tự.
• Phương pháp thực nghiệm sinh học phân tử:
  • Tách chiết DNA: Sử dụng bộ kit thương mại TopPURE® BLOOD DNA EXTRACTION KIT (ABT, mã HI-132) dựa trên nguyên lý màng cột silica kết hợp proteinase K.
  • Đo mật độ quang học (OD): Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA trên máy quang phổ tại bước sóng 260 nm và 280 nm (đạt chuẩn khi tỷ lệ $A_{260}/A_{280}$ nằm trong khoảng 1,8 – 2,0).
  • Phản ứng PCR: Khuếch đại vùng exon 1 của hai gene mục tiêu bằng máy luân nhiệt theo chu kỳ nhiệt tối ưu.
  • Điện di gel agarose: Sử dụng gel agarose 1,5% trong đệm TAE 1X, chất nhuộm GelRed, điện di ở hiệu điện thế 70V trong 30 phút và chụp ảnh bản gel trên hệ thống Gel Doc XR (Bio-Rad).
  • Giải trình tự DNA: Chuẩn bị sản phẩm PCR phục vụ giải trình tự Sanger để đối soát đột biến.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Tổng quan tài liệu

Chương này trình bày toàn diện cơ sở lý luận về bệnh tăng cholesterol máu di truyền gia đình (FH), bao gồm cơ chế bệnh sinh, hai kiểu hình lâm sàng HeFH và HoFH, cùng hai cơ chế di truyền chính là di truyền trội (ADH) và di truyền lặn (ARH). Tác giả phân tích chi tiết cấu trúc phân tử, chức năng điều hòa chuyển hóa lipid và thụ thể LDL của hai gene mục tiêu LDLRAP1 và STAP1.

Bên cạnh đó, chương tổng quan phân tích sâu thực trạng dịch tễ học FH trên phạm vi toàn cầu, khu vực Đông Nam Á và Việt Nam. Điểm qua các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán đột biến phổ biến như PCR, SSCP, MLPA, giải trình tự Sanger và NGS. Cuối cùng, tác giả giới thiệu phương pháp phân tích tổng hợp (meta-analysis) theo khung PRISMA, giải thích các chỉ số thống kê $I^2$, mô hình tác động ngẫu nhiên, biểu đồ Forest plot và Funnel plot.

Phần II: Vật liệu và phương pháp

Chương này mô tả chi tiết các trang thiết bị, hóa chất, bộ mẫu và quy trình kỹ thuật được áp dụng trong đề tài:

• Vật liệu và thiết bị: Bộ mẫu máu gồm 12 mẫu (M1–M12) từ bệnh nhân tăng cholesterol máu tại TP.HCM. Hóa chất tách chiết của hãng ABT (CL buffer, WB1, WB2, EC buffer, Proteinase K), hóa chất PCR (Master Mix 2X, Taq polymerase, dNTPs, đệm Taq, $\text{MgCl}_2$), agarose, GelRed, TAE 20X. Thiết bị gồm máy ly tâm lạnh, máy đo quang phổ OD, máy luân nhiệt PCR, buồng điện di và máy đọc gel Gel Doc XR.
• Quy trình tách chiết DNA qua 9 bước: Xử lý $50\ \mu\text{l}$ mẫu máu toàn phần với $200\ \mu\text{l}$ PBS và $25\ \mu\text{l}$ Proteinase K, ủ tại $60^\circ\text{C}$ trong 1 giờ; bổ sung $200\ \mu\text{l}$ CL buffer (ủ 10 phút); thêm $200\ \mu\text{l}$ ethanol 96%; gắn cột ly tâm (13.000 vòng/phút); rửa cột lần lượt bằng $500\ \mu\text{l}$ WB1 buffer và $500\ \mu\text{l}$ WB2 buffer; ly tâm khô; hòa tan DNA bằng $50\ \mu\text{l}$ EC buffer và bảo quản ở $-20^\circ\text{C}$.
• Thông số phản ứng PCR: Tổng thể tích phản ứng $50\ \mu\text{l}$ gồm: Master Mix 2X ($25\ \mu\text{l}$), mồi xuôi ($1\ \mu\text{l}$), mồi ngược ($1\ \mu\text{l}$), DNA khuôn ($2\ \mu\text{l}$), $\text{H}_2\text{O}$ ($21\ \mu\text{l}$). Chu trình nhiệt: biến tính ban đầu $95^\circ\text{C}$ (5 phút); 35 chu kỳ gồm $95^\circ\text{C}$ (30 giây), bắt cặp $57^\circ\text{C}$ (30 giây), kéo dài $72^\circ\text{C}$ (2 phút); kéo dài kết thúc $72^\circ\text{C}$ (5 phút).

Thành phần phản ứng PCR	Thể tích ($\mu\text{l}$)
Master Mix 2X	25
Mồi xuôi ($10\ \mu\text{M}$)	1
Mồi ngược ($10\ \mu\text{M}$)	1
DNA mẫu	2
Nước cất vô trùng ($\text{H}_2\text{O}$)	21
Tổng thể tích	50

Phần III: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Nội dung chương trình bày toàn bộ kết quả phân tích dữ liệu và thực nghiệm:

1. Kết quả khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp:
   • Gene LDLRAP1: Tổng hợp 12 công trình (11 nghiên cứu đoàn hệ, 1 nghiên cứu bệnh - chứng) với tổng cộng 2.603 mẫu bệnh phẩm từ Châu Âu và Châu Á. Tỷ lệ đột biến tổng thể là 13,375% (95% CI: 8,363 – 19,346%), chỉ số bất đồng nhất $I^2 = 91,74%$ ($P < 0,0001$).
     • Dạng đột biến: Đột biến vô nghĩa (nonsense) chiếm 13,005% (95% CI: 10,741 – 15,549%), đột biến sai nghĩa (missense) chiếm 10,680% (95% CI: 9,092 – 12,440%), đột biến dịch khung (frameshift) chiếm 10,455% (95% CI: 7,756 – 13,698%).
     • Phân bố exon: Exon 1 là vùng có số lượng ca nghiên cứu tập trung nhiều nhất (395 mẫu, tỷ lệ 7,342%), ngoài ra đột biến còn phân bố ở exon 4 (23,282%), exon 7 (31,897%), exon 2 (12,162%), exon 6 (11,172%), exon 5 (12,821%) và exon 9 (6,175%).
     • Kỹ thuật xác định: Phối hợp PCR và giải trình tự đạt tỷ lệ phát hiện đột biến cao nhất là 30,097% (95% CI: 25,034 – 35,547%), vượt trội so với MLPA kết hợp giải trình tự (9,676%).
   • Gene STAP1: Tổng hợp 13 công trình với tổng số 4.609 mẫu bệnh phẩm tại Châu Âu và Châu Mỹ. Tỷ lệ đột biến tổng thể là 36,426% (95% CI: 17,758 – 57,519%), độ bất đồng nhất $I^2 = 99,4%$ ($P < 0,0001$). Vị trí đột biến tập trung tại exon 1 (tỷ lệ 35,484%, 95% CI: 25,834 – 46,086%) và exon 3 (24,000%, 95% CI: 21,858 – 26,244%).

Thông số phân tích tổng hợp	Gene LDLRAP1	Gene STAP1
Số lượng bài báo khoa học	12 bài báo	13 bài báo
Tổng số mẫu bệnh phẩm	2.603 mẫu	4.609 mẫu
Tỷ lệ đột biến tổng thể (Proportion)	13,375%	36,426%
Khoảng tin cậy 95% (95% CI)	8,363% – 19,346%	17,758% – 57,519%
Chỉ số bất đồng nhất ($I^2$)	91,74% ($P < 0,0001$)	99,4% ($P < 0,0001$)
Vị trí exon đột biến trọng tâm	Exon 1 (n = 395), Exon 4, Exon 7	Exon 1 (35,48%), Exon 3 (24,00%)

2. Khảo sát tin sinh học và thiết kế mồi:

   • Đã thẩm định độ đặc hiệu của cặp mồi ARP1_F/ARP1_R khuếch đại exon 1 gene LDLRAP1 trên trình tự tham chiếu NG_008932 (kích thước sản phẩm khuếch đại dự kiến là 577 bp).
   • Đã thẩm định cặp mồi STA1_F/STA1_R khuếch đại exon 1 gene STAP1 trên trình tự tham chiếu NG_047142 (kích thước sản phẩm khuếch đại dự kiến là 210 bp).

3. Khảo sát thực nghiệm:

   • Tách chiết thành công DNA bộ gene từ 12 mẫu máu (M1–M12), nồng độ và độ tinh sạch đạt tiêu chuẩn qua phép đo quang phổ ($A_{260}/A_{280}$ đạt 1,8 – 2,0).
   • Thực hiện thành công phản ứng PCR với nhiệt độ bắt cặp mồi $T_a = 57^\circ\text{C}$. Kết quả điện di trên gel agarose 1,5% ghi nhận các vạch khuếch đại rõ nét, đặc hiệu, đúng kích thước lý thuyết: băng 577 bp cho gene LDLRAP1 và băng 210 bp cho gene STAP1, không có hiện tượng tạo mồi dimer hay khuếch đại không đặc hiệu.

Phần IV: Kết luận và đề nghị

Chương tổng kết toàn bộ các mục tiêu đã hoàn thành của khóa luận, khẳng định tính khả thi của quy trình phân tích tổng hợp và phương pháp thực nghiệm phân tử đã thiết lập. Đồng thời, đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp nối nhằm mở rộng tập mẫu lâm sàng và khảo sát đầy đủ các exon còn lại.

---

Kết quả và đóng góp

• Hệ thống hóa dữ liệu dịch tễ phân tử quy mô lớn: Đã hoàn thành phân tích tổng hợp meta-analysis từ 25 công trình khoa học quốc tế, xác định tỷ lệ đột biến tổng thể của gene LDLRAP1 là 13,375% (trên 2.603 mẫu) và gene STAP1 là 36,426% (trên 4.609 mẫu) ở bệnh nhân FH.
• Xác định các điểm nóng đột biến: Làm rõ phân bố các dạng đột biến trên gene LDLRAP1 (đột biến vô nghĩa chiếm 13,005%, đột biến sai nghĩa chiếm 10,680%, đột biến dịch khung chiếm 10,455%) và chỉ ra exon 1 là vùng mục tiêu tập trung nhiều đột biến nổi trội trên cả hai gene LDLRAP1 (7,342%) và STAP1 (35,484%).
• Khẳng định tính hiệu quả của phương pháp sinh học phân tử: Dữ liệu phân tích chứng minh kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự cho tỷ lệ phát hiện đột biến đạt 30,097%, cao hơn hẳn so với các phương pháp khác.
• Xây dựng quy trình thực nghiệm hoàn chỉnh: Tối ưu hóa thành công quy trình tách chiết DNA từ máu bệnh nhân bằng cột silica và thiết lập chu kỳ nhiệt PCR đặc hiệu ($T_a = 57^\circ\text{C}$) với 2 cặp mồi ARP1 và STA1, cho ra sản phẩm khuếch đại đặc hiệu có kích thước chuẩn xác (577 bp và 210 bp) trên 12 mẫu bệnh phẩm lâm sàng người Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Quy mô mẫu thực nghiệm còn nhỏ, chỉ dừng lại ở 12 mẫu bệnh phẩm máu (M1–M12) từ bệnh nhân tăng cholesterol máu tại TP.HCM.
  • Về phạm vi phân tử, nghiên cứu mới chỉ thiết kế mồi và khuếch đại thực nghiệm trên vùng exon 1 của hai gene mục tiêu, chưa khảo sát toàn bộ 9 exon của LDLRAP1 và 10 exon của STAP1.
  • Dữ liệu meta-analysis có độ bất đồng nhất cao ($I^2 > 90%$) do sự khác biệt lớn về chủng tộc, quần thể nghiên cứu và tiêu chuẩn chọn mẫu giữa các bài báo quốc tế.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng thu thập số lượng mẫu máu bệnh nhân tăng lipid máu/FH tại nhiều bệnh viện và trung tâm y tế tại Việt Nam để nâng cao ý nghĩa thống kê sinh học.
  • Tiếp tục thiết kế các cặp mồi khuếch đại toàn bộ các exon còn lại (đặc biệt là exon 4, exon 7 của LDLRAP1 và exon 3 của STAP1).
  • Ứng dụng giải trình tự Sanger và mở rộng sang công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS/WES) nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu hoàn chỉnh về các biến thể di truyền gây bệnh tăng cholesterol máu ở người Việt Nam.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng: Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các ngành Công nghệ Sinh học, CNSH Y Dược, Y học phân tử, Di truyền học và Tim mạch học.
• Nội dung giá trị:
  • Cung cấp quy trình bài bản về phương pháp phân tích tổng hợp (meta-analysis) ứng dụng trong dịch tễ học phân tử di truyền, bao gồm cách tra cứu, trích xuất dữ liệu PRISMA và xử lý thống kê bằng phần mềm MedCalc.
  • Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về điều kiện tối ưu phản ứng PCR (thành phần hóa chất, chu kỳ nhiệt $T_a = 57^\circ\text{C}$, quy trình điện di) và thông số cặp mồi đặc hiệu khuếch đại exon 1 của hai gene LDLRAP1 và STAP1.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao đề tài lại lựa chọn khảo sát hai gene LDLRAP1 và STAP1 thay vì các gene phổ biến như LDLR, APOB hay PCSK9?

Trong bệnh tăng cholesterol máu di truyền gia đình (FH), đột biến trên LDLR, APOB và PCSK9 chiếm đa số nhưng vẫn còn khoảng 20% đến 40% bệnh nhân không mang đột biến trên các gene này. LDLRAP1 (di truyền lặn ARH) và STAP1 (di truyền trội ADH) là hai gene liên quan đến các thể bệnh hiếm, chưa được khảo sát thực nghiệm đầy đủ tại Việt Nam, do đó việc nghiên cứu hai gene này giúp mở rộng khả năng chẩn đoán phân tử cho các ca bệnh âm tính với các đột biến kinh điển.

2. Tỷ lệ đột biến tổng thể của gene LDLRAP1 và STAP1 theo phân tích tổng hợp trong khóa luận là bao nhiêu?

Theo kết quả phân tích tổng hợp từ phần mềm MedCalc, tỷ lệ đột biến tổng thể ở bệnh nhân FH đối với gene LDLRAP1 là 13,375% (95% CI: 8,363 – 19,346%, tổng hợp từ 2.603 mẫu trong 12 nghiên cứu) và đối với gene STAP1 là 36,426% (95% CI: 17,758 – 57,519%, tổng hợp từ 4.609 mẫu trong 13 nghiên cứu).

3. Vị trí exon nào trên hai gene mục tiêu được xác định có tỷ lệ đột biến tập trung cao nhất?

Trên gene LDLRAP1, exon 1 là vùng được khảo sát nhiều nhất với 395 mẫu ghi nhận đột biến (tỷ lệ 7,342%), cùng với các exon có tỷ lệ đột biến cao như exon 4 (23,282%) và exon 7 (31,897%). Trên gene STAP1, đột biến tập trung cao nhất tại exon 1 (tỷ lệ 35,484%) và exon 3 (tỷ lệ 24,000%). Do đó, exon 1 được lựa chọn làm đối tượng trọng tâm để thiết kế mồi thực nghiệm.

4. Kích thước sản phẩm PCR dự kiến và điều kiện luân nhiệt tối ưu cho hai cặp mồi là gì?

Cặp mồi ARP1_F/ARP1_R khuếch đại exon 1 gene LDLRAP1 tạo sản phẩm có kích thước 577 bp; cặp mồi STA1_F/STA1_R khuếch đại exon 1 gene STAP1 tạo sản phẩm có kích thước 210 bp. Điều kiện nhiệt tối ưu cho cả hai phản ứng PCR gồm: biến tính $95^\circ\text{C}$ (5 phút); 35 chu kỳ gồm $95^\circ\text{C}$ (30 giây), bắt cặp tại $57^\circ\text{C}$ (30 giây), kéo dài $72^\circ\text{C}$ (2 phút); và kéo dài kết thúc $72^\circ\text{C}$ (5 phút).

5. Bộ mẫu máu thực nghiệm của đề tài có nguồn gốc từ đâu và quy trình tách chiết sử dụng phương pháp nào?

Bộ mẫu thực nghiệm gồm 12 mẫu máu (ký hiệu M1–M12) lấy từ các bệnh nhân có nồng độ LDL-C cao bất thường tại TP.HCM, được kế thừa từ đề tài nghiên cứu cấp Bộ mã số MBS-2018-08 của TS. Trương Kim Phượng. Quy trình tách chiết sử dụng bộ kit TopPURE® BLOOD DNA EXTRACTION KIT (ABT, mã HI-132) dựa trên cột lọc silica kết hợp dung dịch đệm ly giải và Proteinase K.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Hồ Châu Quí đã hoàn thành việc tổng hợp dữ liệu dịch tễ học phân tử quy mô lớn về hai gene đột biến hiếm gặp LDLRAP1 và STAP1 ở bệnh nhân tăng cholesterol máu gia đình trên thế giới, xác định được các tỷ lệ đột biến và vị trí exon trọng điểm (đặc biệt là exon 1). Trên cơ sở đó, nghiên cứu đã thẩm định tin sinh học và xây dựng thành công quy trình thực nghiệm PCR với nhiệt độ bắt cặp $57^\circ\text{C}$, khuếch đại đặc hiệu sản phẩm 577 bp (LDLRAP1) và 210 bp (STAP1) trên 12 mẫu bệnh phẩm lâm sàng người Việt Nam. Đề tài đóng góp nền tảng dữ liệu và quy trình kỹ thuật ban đầu, mở ra hướng ứng dụng sinh học phân tử trong sàng lọc và chẩn đoán sớm các biến thể di truyền gây bệnh tim mạch tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tăng lipid máu (Dyslipidaemia) là dạng bệnh lý rối loạn di truyền biểu hiện với lượng lipid thay đổi bất thường trong máu, và thường không có triệu chứng xác định. Bệnh tăng lipid máu là nguyên nhân gây ra các bệnh về tim mạch ngày càng trẻ hoá (Hill et al. Theo dữ liệu nghiên cứu của Pang và cộng sự (2016) ghi nhận có khoảng 4 triệu trẻ em có độ tuổi dưới 15 mắc bệnh FH đa phần ở dạng đột biến dị hợp tử; dẫn đến khả năng tỷ lệ mắc bệnh FH phổ biến đạt đến mức tỷ lệ mắc bệnh FH ở kiểu hình dị hợp tử (HeFH) xuất hiện ở Châu Âu đạt gần 5 triệu ca và cả thế giới đạt con số 35 triệu ca được ước tính 1:200 ca mỗi năm; so với tỷ lệ mắc bệnh FH ở dạng đồng hợp tử (HoFH) xuất hiện ở Châu Âu và Bắc Mỹ được ước tính 1:1.000 (Foody et al., 2016; Wiegman et al. Hiện nay những bệnh nhân mắc bệnh tăng lipid máu không được chẩn đoán sớm và điều trị sớm có nguy cơ thì mắc bệnh ngày càng tăng có xu hướng trẻ hóa và những người mắc bệnh FH không được điều trị sớm từ độ tuổi 20 - 39 tuổi thì có tỷ lệ tử vong tăng gấp 100 lần so với người không có mắc bệnh và thường không sống sót qua 30 năm (Cao et al.

Các nguyên nhân chính dẫn đến tăng lipid máu (Dyslipidaemia) bao gồm nguyên nhân nguyên phát và thứ phát. Nguyên nhân nguyên phát di truyền từ gia đình bao gồm tăng cholesterol máu di truyền mang tính chất gia đình (FH), rối loạn betalipoprotein máu, APOB-100 khiếm khuyết gia đình và tăng đột biến chức năng PCSK9. Nguyên nhân thứ phát thường bắt nguồn từ sinh hoạt hằng ngày như chế độ ăn uống không lành mạnh, tiểu đường và là nguyên nhân chủ yếu gây ra các bệnh tim mạch (CVD) (Pirillo et al. Ngày nay việc phát hiện sớm bệnh lipid máu sẽ giúp cho việc điều trị và kiểm soát dễ dàng hơn, đưa ra kế hoạch sinh hoạt và ăn uống phù hợp để ngăn ngừa những biến chứng tiềm ẩn và giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và đột quỵ.

Do đó dựa vào cơ sở lý thuyết có thể xác định các biến thể đột biến ở các nhóm bệnh nhân mắc bệnh tăng 1 Khoá Luận Tốt Nghiệp cholesterol trong máu có gene mục tiêu LDLRAP1, STAP1; trong phạm vi chuyên đề khoá luận tốt nghiệp: “Khảo sát một số biến thể trên gene LDLRAP1, STAP1 ở người Việt Nam bằng phương pháp PCR và giải trình tự” với mục đích nhằm thu thập dữ liệu và xác định các dạng biến thể đột biến xuất hiện ở người bệnh tăng cholesterol trong máu ở Việt Nam. • MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: Nghiên cứu áp dụng phân tích tổng hợp để phản ảnh mức độ đột biến trên các gene LDLRAP1 và STAP1 một số biến thể nổi trội nằm trên các nhóm bệnh nhân tăng cholesterol trong máu dạng tiên phát trên thế giới. Đồng thời, bước đầu xây dựng quy trình PCR kết hợp giải trình tự trên 2 gene mục tiêu LDLRAP1 và STAP1 ở nhóm người bệnh tăng cholesterol trong máu ở Việt Nam. • NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: Khai thác dữ liệu, hệ thống tổng quan khoa học: - Khai thác dữ liệu, hệ thống tổng quan khoa học - Khảo sát trên máy tính để thiết kế bộ mồi phù hợp, đặc biệt trên vùng trình tự mục tiêu: gene LDLRAP1, STAP1.

- Sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự thu nhận trình tự gene mục tiêu. Khảo sát thực nghiệm: Khảo sát thực nghiệm với quy trình PCR và giải trình tự trên một số gene mục tiêu LDLRAP1 và STAP1. 2 PHẦN I: TỔNG QUAN Khoá Luận Tốt Nghiệp I.1 TỔNG QUAN BỆNH TĂNG CHOLESTEROL MÁU DI TRUYỀN MANG TÍNH GIA ĐÌNH (FH) I.