Đặt vấn đề Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.3) là enzyme tham gia xúc tác cho phản ứng thủy phân thuận nghịch triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) ở điều kiện bình thư ờng tạo thành glycerol và acid béo tương ứng. Bên cạnh hoạt tính thủy phân lipid, enzyme lipase còn có hoạt tính thủy phân và tổng hợp ester. Ưu điểm của lipase so với những xúc tác hoá học khác là phản ứng ôn hoà, không tốn năng lượng và không tạo ra sản phẩm phụ. Nguồn thu nhận lipase có thể từ động vật, thực vật và vi sinh vật, tuy nhiên lipase từ vi sinh vật hiện đang được quan tâm tới nhiều nhất.
Ngoài những ưu điểm khác như sản xuất nhanh, đơn giản, rẻ tiền, lipase từ một số vi sinh vật trong nhiều ứng dụng cụ thể là không thể thay thế được do có tính đặc hiệu vị trí hay đặc hiệu cơ chất. Ứng dụng của lipase đã được đề cập tới rất nhiều trong công nghiệp thực phẩm, xử lý môi trường, sản xuất chất tẩy rửa, chất dinh dưỡng, mỹ phẩm… Trong y học, lipase được bổ sung vào những chế phẩm enzyme tiêu hoá chữa bệnh suy giảm chức năng về đường tiêu hoá. Men tiêu hóa do cơ thể (chủ yếu từ ống và tuyến tiêu hóa) tiết ra để tiêu hóa thức ăn (cắt nhỏ thức ăn thành những phần tử nhỏ để được hấp thu vào máu) như: amylase, pepsin, lipase của dạ dày. Tuy nhiên men lipase của dạ dày có tác dụng rất yếu, chỉ tiêu hóa được dạng chất béo đã đư ợc nhũ tương hóa (chất béo của sữa, trứng), ở ruột non nhờ tác dụng xúc tác của các enzyme lipase và dịch mật chất béo bị thuỷ phân thành các acid béo và glycerol rồi được hấp thụ vào thành ruột.
Vì vậy hệ vi sinh đóng một vai trò rất quan trọng ở đường tiêu hóa. Ngày nay, dựa vào sự phát triển của công nghiệp dược, người ta đã sản xuất ra các chế phẩm vi sinh (men vi sinh) hỗ trợ tiêu hóa, còn gọi là probiotic, tùy thuộc vào từng loại sản phẩm mà trong thành phần sẽ có một hoặc nhiều các vi khuẩn có ích cần thiết cho hệ tiêu hóa như: Lactobacillus, Bacillus ssp… Trong các loài vi khuẩn khác nhau thuộc giống Bacillus thì Bacillus subtilis được tập trung nhiều nhất vì nó là vi khuẩn có lợi hiện rất phổ biến trong tự nhiên, chúng sống được trên nhiều loại môi trường khác nhau, có khả năng phát triển rất nhanh. Quan trọng hơn cả là Bacillus subtilis có hệ enzyme ngoại bào phong phú, nhiều enzyme trong số này có tác dụng hỗ trợ rất tốt cho tiêu hóa. Các dòng vi khuẩn của Bacillus subtilis không mang những gene gây độc cho người và thú, quá trình hình 1 thành bào tử của Bacillus subtilis được nghiên cứu một cách chi tiết, đồng thời những nghiên cứu gần đây cho thấy bào tử của Bacillus subtilis có khả năng nảy mầm được trên phần đầu của ruột non.
Điều này làm cho việc nghiên cứu Bacillus subtilis để sản xuất probiotic được đẩy mạnh. Trên thế giới đã và Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về lipase từ vi sinh vật đã đ ạt được những thành tựu đáng kể. Tuy nhiên các nghiên cứu về enzyme lipase của Bacillus subtilis còn rất ít. Mục đích của đề tài Vì vậy việc nghiên cứu lipase trên giống Bacillus của đề tài nhằm tìm kiếm nguồn giống, tìm hiểu khả năng sinh tổng hợp lipase của vi khuẩn Bacillus subtilis làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về các đặc điểm mới của lipase Bacillus và ứng dụng vào việc sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic).
Nội dung đề tài - Phân lập, tuyển chọn giống Bacillus có khả năng sinh lipase cao nhất trên qui mô thí nghiệm. - Khảo sát khả năng sinh lipase của Bacillus được chọn theo thời gian nuôi cấy. - Khảo sát yếu tố môi trường cảm ứng sinh tổng hợp lipase: nhiệt độ, pH, cơ chất cảm ứng. - Tổng hợp các điều kiện tối ưu trên để thử nghiệm nuôi cấy, thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về enzyme lipase 2. Định nghĩa Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3. Là enzyme tham gia xúc tác cho phản ứng thủy phân thuận nghịch triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) ở điều kiện bình thường tạo thành glycerin và acid béo tương ứng.
Lipase xúc tác phản ứng thuỷ phân lần lượt từng liên kết α - ester trong phân tử, không cắt đứt cả 3 liên kết ester cùng lúc. Enzyme lipase khác với các enzyme esterase ở điểm chỉ thủy phân cơ chất không tan trong nước và có hoạt tính mạnh thể hiện ở bề mặt phân chia pha cơ chất-nước (interfacial activation). Ngoài ra, không những xúc tác cho hệ nhũ tương bình thường (dầu trong nước) lipase còn hoạt động mạnh ở những hệ nhũ là nước trong dầu và dầu hòa tan trong dung môi hữu cơ. Hơn thế nữa, enzyme lipase rất linh hoạt vì có thể xúc tác cho phản ứng chuyển hóa ester và tổng hợp ester đặc hiệu về cấu hình không gian với sự đa dạng về cơ chất phản ứng.
Các nguồn thu nhận enzyme lipase Lipase được phân bố rộng trong các loài vi sinh vật, động vật và cả ở thực vật. Ở người và động vật có xương sống, nhiều lipase kiểm soát sự thuỷ phân, sự hấp thụ, sự tạo thành chất béo và chuyển hoá lipoprotein. [6] Lipase động vật chia làm 3 nhóm dựa trên vị trí và hoạt động của chúng: lipase thực phẩm, lipase mô và lipase sữa. Nguồn lipase thu từ động vật quan trọng nhất là tụy tạng của bò, lợn và cừu.
Lipase từ tụy tạng là một trong những lipase được biết sớm nhất và khá thông dụng. Enzyme này được tiết ra ở tá tràng xúc tác cho sự thủy phân triglyceride. Bản chất của loại lipase này là glycoprotein, phân tử lượng 50 kDa, được hoạt hóa ở bề mặt phân cách pha dầu – nước, nhưng lại bị ức chế bởi muối mật. Tuy nhiên, lipase từ tụy tạng một số động vật lại có thêm hoạt tính của phospholipase A.
Ở thực vật, lipase được tìm thấy ở mô dự trữ của hạt dầu, hạt ngũ cốc trong quá trình nảy mầm của hạt. Hầu hết các lipase không hoạt động trong thời kỳ ngủ đông, ngoại trừ lipase tìm thấy ở hạt đậu caston. Lượng lớn lipase trong công nghiệp được sản xuất từ các loại vi sinh vật: vi khuẩn, nấm mốc, nấm men. 3 o Vi khuẩn: Lipase từ vi khuẩn được nghiên cứu từ khá sớm và đầy đủ (Jaeger và cộng sự (1999).
Đa số lipase của vi khuẩn là lipoprotein hay còn gọi là lipase thật EC (3. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng lipase vi khuẩn được biết cho tới nay thường không đặc hiệu và chỉ có một số ít có tính bền nhiệt. Trong số các vi khuẩn thì Acromobacter sp, Alcaligense sp, Arthrobacter sp, Pseudomonas sp và Chromobacterium sp đã được đưa vào sản xuất công nghiệ p. Lipase ngoại bào của Streptomyces rimous R6554 W được tách từ dịch lọc canh trường bằng sắc ký cột.
Streptomyces là vi khuẩn đất Gram (+) thể hiện khả năng đặc biệt đối với sự tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và sử dụng lipase thuỷ phân ngoại bào để phá huỷ nguyên liệu hữu cơ trong môi trường sống tự nhiên. Tuy nhiên cho đến nay, chỉ có một vài lipase Streptomyces đã được xác định hoạt tính. Ngoài ra, người ta cũng đã tìm thấy lipase có trong một số loài vi khuẩn khác như Pseudomonas cepacia có hoạt tính ngay ở nhiệt độ cao, trong môi trường kiềm và kỵ nước. o Nấm : Lipase từ nấm đã được nghiên cứu từ những năm 1950.
Ưu điểm của lipase này: dễ thu nhận, tính ổn định theo pH và nhiệt độ, tính đặc hiệu với cơ chất và khả năng họat động trong dung môi hữu cơ. Nấm mốc: Lipase được tìm thấy ở một số loài như: Aspergillus, Rhizopus (tách từ quả dừa), Rhizopus oryzae (phân lập từ dầu dừa), Pythiumnltimum (trong dung dịch hữu cơ, không có nhũ tương), và Mucor s, humicola lamuginosa. Nấm men: Nấm men Candida rugosa là một nguồn sản xuất lipase quan trọng. Các đặc tính xúc tác cấu trúc hoá sinh của lipase trong loài nấm men Candida rugosa đã được công bố trên nhiều tài liệu.
Có ít nhất 7giống lipase từ Candida rugosa trong đó có 4 giống đã được xác định đặc tính và 3 giống đã được dùng để sản xuất enzyme thương phẩm.1 - Một số nguồn thu nhận lipase [35],[37] Nguồn Loài thu nhận Động vật Tụy tạng bò, cừu, lợn Thực vật Hạt cây thầu dầu 4 Penicillium roqueforium Rhizopus oryzae Nấm mốc Aspergillus niger Geotrichium candium Rhizopus delemar Candida rugosa Nấm men Candida cylindracea Candida parapsilosis Torulopsis spp. Chromobacterium viscosu Pseudomonas flourescens Vi khuẩn Pseudomonas fragi Bacillus thermocatenulatus Bacillus sp 2. Phân lọai enzyme lipase vi sinh vật Enzyme thủy phân lipid có nguồn gốc từ vi sinh vật được xếp làm 8 họ [8], [42]: - Họ I, được chia làm 6ọ hphụ, gọi là lipase “thật”: lipase từ Pseudomonas, từ các vi khuẩn Gram dương như Bacillus, Staphylococcus và lipase khác như lipase từ Propionibacterium và Streptomyces. - Họ II, gồm các enzyme lipase thiếu chuỗi pentapeptide kinh điển Gly – Xaa –Ser – Xaa – Gly nhưng lại có chuỗi Gly – Asp – Ser – Leu thay thế.
Trong họ này có các enzyme esterasreủac Streptomyces scabies, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Photorhabdus luminescens và Aeromonas hydrophila. - Họ III, gồm các lipase ngoại bào của Streptomyces và Moraxella. - Họ IV, gồm các enzyme tương tự như các lipase nhạy cảm hormone ở động vật có vú. - Họ V, gồm các enzyme có nguồn gốc từ các vi khuẩn chịu nhiệt trung bình ư (nh Pseudomonas oleovorans, Haemophilus influenza, Acetobacter pasteurianus), từ vi sinh vật chịu lạnh (như Moraxella sp., Psychrobacter immobilis) và những vi sinh vật chịu nóng (Sulfolobus acidocaldarius).
5 - Họ VI, gồm những esterase nhỏ nhất có khối lượng phân tử (23 – 26) kDa. - Họ VII, gồm những esterase vi khuẩn lớn có khối lượng phân tử khoảng 55 kDa. - Họ VIII, gồm những enzyme tương tự như các β-lactamase nhóm C. Các enzyme thủy phân lipid hiện nay đang thu hút được nhiều sự quan tâm vì chúng có tiềm năng trong nhiều ứng dụng.
Phần lớn lipase sử dụng trong công nghiệp là enzyme từ vi khuẩn hoặc từ nấm [8]. Các đặc tính lý hóa của lipase vi sinh vật 2. Cấu trúc và khối lượng phân tử Cấu trúc không gian (3D) của lipase từ nấm Rhizomucor miehei và lipase từ tuyến tụy của người đã được xác định vào năm 1990, từ đó đến nay có hơn 11 cấu trúc lipase nữa được xác định. Ngoại trừ lipase từ tuyến tụy của người, tất cả các lipase còn lại đều từ vi sinh vật.
Các lipase này có khối lượng phân tử (19 – 60) kDa, đều biểu hiện đặc tính xoắn cuộn như xoắn α/β-hydrolase.