MỞ ĐẦU Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) thuộc chi Nhân sâm (Panax) còn có các tên gọi khác là sâm Việt Nam, sâm Khu Năm (K5), sâm trúc (sâm đốt trúc, trúc tiết sâm), củ Ngải rọm con hay cây Thuốc giấu, là loài đặc biệt có giá trị về khoa học và kinh tế với thành phần saponin, hàm lượng các acid amin, các chất khoáng vi lượng trong củ, lá và rễ hơn nhiều những loài sâm khác. Ngoài tác dụng dược lý, sâm Ngọc Linh còn giúp chống căng thẳng, trầm cảm, oxy hóa. Do vùng phân bố hạn chế và việc khai thác quá mức đã khiến sâm Ngọc Linh trở nên khan hiếm trong tự nhiên và được đưa vào Danh lục đỏ của IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế khai thác và sử dụng vì mục đích thương mại. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các nghiên cứu về định loại bằng phương pháp hình thái kết hợp với phân tử thông qua phân tích một số vùng gen các loài thuộc chi Nhân sâm, trong đó có sâm Ngọc Linh đã được thực hiện.
Nhờ sự ra đời và phát triển của các hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới, trình tự toàn bộ hệ gen, trong đó có hệ gen biểu hiện, hệ gen lục lạp của một số loài thuộc chi Nhân sâm đã được triển khai thực hiện trong những năm gần đây. Việc phân tích và khai thác cơ sở dữ liệu của toàn bộ hệ gen đã cung cấp nguồn thông tin lớn, có giá trị và độ tin cậy cao, hỗ trợ các nghiên cứu phát sinh chủng loại, quá trình thích nghi, nhận dạng loài phục vụ giám sát thương mại và bảo tồn nguồn gen. Nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng trong nghiên cứu tiến hóa, bảo tồn, khai thác và sử dụng bền vững nguồn gen sâm Ngọc Linh quý hiếm cũng như góp phần tìm kiếm mã vạch phân tử đặc trưng định hướng ứng dụng trong giám định chất lượng sâm Ngọc Linh và các loài thuộc chi Nhân sâm ở Việt Nam, đề tài: “Giải trình tự hệ gen lục lạp của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)” đã được xây dựng và thực hiện với các nội dung chính sau: (1) Tách chiết DNA và giải trình tự hệ gen lục lạp của sâm Ngọc Linh; (2) Lắp ráp và hiệu chỉnh trình tự hệ gen lục lạp; (3) Chú giải và phân tích trình tự hệ gen lục lạp; (4) 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phân tích và tìm kiếm các chỉ thị phân tử thích hợp để phân biệt sâm Ngọc Linh với các loài thuộc chi Nhân sâm. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Chi Nhân sâm và sâm Ngọc Linh Chi Nhân sâm (Panax) thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), là một trong những chi có nhiều loài cây thuốc quan trọng nhất ở phương Đông. Thông thường, các loài thuộc chi này được trồng chủ yếu từ hạt. Cây sâm trưởng thành sau 1 năm khi gieo trực tiếp vào đất hoặc trồng ở vườn ươm. Cây con có một thân với 2 lá và rễ.
Trong năm đầu tiên, thân và lá sẽ cao khoảng 5 - 10 cm. Trọng lượng tươi của rễ nhỏ hơn 1 g. Phần khí thân của cây sâm chết đi hàng năm vào cuối vụ và thân mới tiếp tục mọc vào cuối tháng 4 hoặc tháng 5. Nụ hoa và lá của sâm Ngọc Linh xuất hiện đồng thời.
Sau 6 năm, lá cao khoảng 40 - 60 cm và trọng lượng tươi của rễ đạt khoảng 200 g. Cây sâm trưởng thành có một vài vòng lá. Mỗi vòng lá bao gồm một cuống lá và 3 đến 5 lá nhỏ. Hạt hình thành sau 2 - 4 năm và mỗi chùm có 2 hoặc 3 hạt có màu từ trắng đến vàng [75].
Có khoảng 13 loài thuộc chi này đã được miêu tả, hầu hết phân bố ở Đông Á, vùng Himalaya, Đông Dương và Bắc Mỹ. Hai loài là Panax ginseng C. Meyer (Sâm Hàn Quốc, Sâm Cao Ly, Sâm Á châu) và Panax quinquefolius L. (Sâm Mỹ) được trồng và thương mại hóa rộng rãi [16,43], các loài khác khá hiếm và bị đe dọa, thậm chí có loài có thể bị tuyệt chủng trong tương lai gần do nạn khai thác bừa bãi hoặc mất nơi sống.
Ở Việt Nam, chi Nhân sâm gồm các loài mọc tự nhiên rất có giá trị làm thuốc như Sâm Vũ diệp (P. bipinnatifidus), Tam thất hoang (P. stipuleanatus), Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus) và đặc biệt là sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.
Sâm Ngọc Linh là cây thảo, sống nhiều năm, cao khoảng 30 - 110 cm. Cây có thân rễ tạo thành các đốt, mọc b ngang, có thể phân nhánh, đường kính từ 1 - 2 cm. Phần mang lá của cây từ 1 - 5 thân, tùy theo số đầu nhánh của thân rễ. Lá kép chân vịt, mọc vòng, ở ngọn, mỗi lá kép gồm 3 - 5 lá chét.
Lá sâm Ngọc Linh là lá chét hình bầu dục, thuôn, nhọn hai đầu, 6 - 14 × 2,5 - 4 cm, mép khía răng cưa. Cây 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com có cụm hoa tán đơn hay tán kép (thêm 1 - 2 tán phụ), mọc ở ngọn, chiều dài cuống cụm hoa dài hơn cuống lá, nên thường cao vượt tán lá. Hoa của sâm Ngọc Linh có cuống ngắn, màu trắng xanh, 5 đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị. Bầu 2 ô, vòi nhụy chẻ 2 ở đầu.
Cây có quả mọng, hình cầu, đường kính 0,5 - 0,6 cm, khi chín màu đỏ và thường có một chấm đen ở đỉnh. Hạt thường 1 hoặc 2; hạt nhỏ gần tròn hoặc gần giống hình thận, vỏ hạt không nhẵn (Hình 1. Mùa hoa của sâm Ngọc Linh là tháng 4 - 5, quả tháng 6 - 9. Đây là loài gieo giống tự nhiên bằng hạt.
Phần thân rễ bị gãy còn lại vẫn có thể tái sinh. Cây thường lụi hàng năm vào mùa đông, đến đầu mùa xuân năm sau từ thân rễ sẽ mọc lên chồi thân mới. Đây là loài đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác dưới tán rừng kín thường xanh ẩm, nhất là dọc theo hành lang ven suối, ở độ cao từ 1900 - 2300 m [10]. Sâm Ngọc Linh còn có các tên gọi khác như sâm Việt Nam, sâm Khu Năm (K5), sâm trúc (sâm đốt trúc, trúc tiết sâm), củ Ngải rọm con hay cây Thuốc giấu.
Sâm Ngọc Linh được phát hiện vào năm 1973. Tuy nhiên, cho đến 1985, loài này mới được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học. Đến nay, Sâm Ngọc Linh chỉ được phát hiện ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum, Gia Lai và Lâm Đồng. Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên, chủ yếu tập trung ở địa bàn của hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam).
Tuy nhiên, do vùng phân bố hạn chế và việc khai thác quá mức đã khiến sâm Ngọc Linh trở nên rất hiếm trong tự nhiên. sâm Ngọc Linh đã được đưa vào Danh lục đỏ của IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế khai thác và sử dụng vì mục đích thương mại (Nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 31 tháng 3 năm 2006 về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm). Để bảo tồn và phát triển nguồn gen qu hiếm này, một số nhóm nghiên cứu ở nước ta đã thực hiện tái sinh, nhân vô tính sâm Ngọc Linh và phân tích hoạt chất saponin [5]. Những năm gần đây, nhóm nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt Tại Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã thành công trong nhân vô tính sâm Ngọc Linh có chất lượng cho sản xuất trong khuôn khổ các đề tài “Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong nghiên 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cứu chương trình phát sinh hình thái và bảo tồn cây sâm Ngọc Linh”; “Nghiên cứu nhân giống vô tính và sản xuất sinh khối rễ cây sâm Ngọc Linh”… [1,26,27].
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv. Các công nghệ giải trình tự DNA 1. Các hệ thống giải trình tự DNA thế hệ đầu tiên Giữa những năm 70 của thế kỷ 20, Sanger đã đưa ra khái niệm đầu tiên về phương pháp giải trình tự DNA và công bố phương pháp cho phép xác định nhanh các trình tự DNA dựa vào hoạt động của DNA polymerase [83]. Năm 1977, hai công trình nổi tiếng về giải trình tự DNA đã được công bố: Công trình của Sanger và đồng tác giả về kỹ thuật giải trình tự DNA sử dụng dideoxynucleotide để làm ngừng phản ứng tổng hợp DNA một cách ngẫu nhiên (Phương pháp dideoxy); Công trình của Maxam và Gilbert về kỹ thuật giải trình tự DNA bằng phương pháp hóa học, trong đó các đoạn DNA được đánh dấu, cắt ngẫu nhiên và điện di trên gel polyacrylamide [63].2 thể hiện nguyên lý chung của phương pháp giải trình tự này [87].
Hai phòng thí nghiệm đi tiên phong trong việc cho ra đời các thế hệ máy giải trình tự DNA tự động đầu tiên là Caltech (sau này được Applied Biosystems – ABI thương mại hóa), Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử châu Âu – 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com EMBL và Pharmacia-Amersham, sau này là General Electric Healthcare - GE. Kết quả của các nghiên cứu xây dựng và cải biến phương pháp cùng việc thương mại hóa các máy giải trình tự DNA những năm sau đó dẫn tới làn sóng ứng dụng rộng rãi các công nghệ này trong cộng đồng khoa học trên khắp thế giới [14,15,89]. Giải trình tự DNA theo phƣơng pháp Sanger Với thiết bị giải trình tự DNA tự động đầu tiên hoạt động dựa trên nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biến (đánh dấu các ddNTP bằng huỳnh quang thay vì phóng xạ), locus hoàn chỉnh của gen mã hóa hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase (HPRT) đã được xác định [30]. Năm 1996, máy giải 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com trình tự DNA thương mại đầu tiên, ABI Prism 310 sử dụng điện di trên bản gel ra đời.
Hai năm sau đó, các ống mao quản tự động đã được thay thế cho các bản gel tự đổ tốn công sức trong hệ thống ABI Prism 3700. Tuy nhiên, do giá thành cao và tốc độ xử lý chậm nên việc giải trình tự DNA chủ yếu chỉ dừng ở các gen đơn lẻ, thường phục vụ các xét nghiệm chẩn đoán phân tử trong các ph ng thí nghiệm y sinh [36,56].