Đánh Giá Độ Nhạy và Đặc Hiệu của Bộ Kit TopSPEC® PEDV RT-qPCR

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học evaluation for specificity and sensitivity of topspec® pedv rt qpcr, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Le Thi Tuyet Nga
• Người hướng dẫn: PhD Dinh Xuan Phat
• Trường học: Nong Lam University Ho Chi Minh City
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Đánh Giá Độ Nhạy và Đặc Hiệu của Bộ Kit TopSPEC® PEDV RT-qPCR trong Phát Hiện Virus Tiêu Chảy Dịch Tễ ở Lợn
• Loại tài liệu: Graduation thesis
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Thu Duc

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGMENTS
• CONFIRMATION COMMITMENT
• 1. CHAPTER 3: MATERIALS AND METHOD
• 3.1. Location and duration
• 3.2. Reverse transcription Real-time PCR
• 3.3. Evaluation of the specificity of the trial kit
• 3.4. Determine the limit of detection (LOD). Evaluating the detectability of PEDV in field samples
• 4. CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Evaluating of the specificity of the trial kit
• 4.2. Determination for the limit of detection (LOD)
• 4.3. Evaluating the ability detection PEDV in field samples
• 4.4. Evaluating the ability of detection PEDV by the trial kit and commercial kit
• 4.5. Evaluate the stability of the trial kit in detecting PEDV
• 4.6. Diagnostic sensitivity and specificity, negative and positive predictive values
• 5. CHAPTER 5: CONCLUSION AND RECOMMENDATION
• 5.1. Conclusion
• 5.2. Recommendation
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Đánh Giá Độ Nhạy và Đặc Hiệu Bộ Kit TopSPEC PEDV RT qPCR

Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit TopSPEC® PEDV RT-qPCR là một bước quan trọng trong việc phát hiện virus tiêu chảy dịch tễ ở lợn. Virus này gây ra những thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn, đặc biệt là ở Việt Nam. Việc sử dụng bộ kit này giúp nâng cao khả năng phát hiện và kiểm soát dịch bệnh, từ đó bảo vệ sức khỏe đàn lợn và giảm thiểu thiệt hại kinh tế.

1.1. Đánh Giá Độ Nhạy Của Bộ Kit TopSPEC PEDV RT qPCR

Độ nhạy của bộ kit TopSPEC® PEDV RT-qPCR được xác định thông qua khả năng phát hiện virus ở nồng độ thấp. Nghiên cứu cho thấy bộ kit có thể phát hiện virus với giới hạn phát hiện (LOD) là 50 copies/phản ứng, cho thấy hiệu quả cao trong việc phát hiện virus PEDV.

1.2. Đặc Hiệu Của Bộ Kit Trong Phát Hiện Virus

Đặc hiệu của bộ kit được đánh giá thông qua khả năng khuếch đại virus mà không có phản ứng chéo với các loại vi khuẩn và virus khác. Kết quả cho thấy bộ kit không có phản ứng không đặc hiệu với 6 loại vi khuẩn và 3 loại virus, đảm bảo tính chính xác trong chẩn đoán.

II. Thách Thức Trong Việc Phát Hiện Virus Tiêu Chảy Dịch Tễ Ở Lợn

Virus tiêu chảy dịch tễ (PEDV) gây ra nhiều thách thức cho ngành chăn nuôi lợn. Sự lây lan nhanh chóng của virus và khả năng gây bệnh cao ở lợn con là những vấn đề nghiêm trọng. Việc phát hiện sớm và chính xác virus là rất cần thiết để ngăn chặn dịch bệnh lây lan.

2.1. Tác Động Kinh Tế Của Virus PEDV

Virus PEDV gây ra thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Theo nghiên cứu, tỷ lệ tử vong ở lợn con có thể lên đến 100%, dẫn đến tổn thất nghiêm trọng cho người chăn nuôi.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Chẩn Đoán Virus

Việc chẩn đoán virus PEDV gặp nhiều khó khăn do triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu. Điều này đòi hỏi các phương pháp chẩn đoán chính xác và nhanh chóng để phát hiện virus kịp thời.

III. Phương Pháp Đánh Giá Độ Nhạy và Đặc Hiệu Của Bộ Kit

Phương pháp đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit TopSPEC® PEDV RT-qPCR bao gồm việc thử nghiệm trên các mẫu thực địa. Nghiên cứu đã sử dụng 82 mẫu để kiểm tra khả năng phát hiện virus, từ đó đưa ra kết luận về hiệu quả của bộ kit.

3.1. Quy Trình Thử Nghiệm Bộ Kit

Quy trình thử nghiệm bao gồm việc thu thập mẫu từ các trang trại và thực hiện phân tích bằng phương pháp RT-qPCR. Kết quả cho thấy bộ kit có độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100%.

3.2. Đánh Giá Kết Quả Thử Nghiệm

Kết quả thử nghiệm cho thấy bộ kit TopSPEC® PEDV RT-qPCR có khả năng phát hiện virus với độ chính xác cao. Các chỉ số như giá trị dự đoán âm tính và dương tính cũng đạt 100%, chứng tỏ tính hiệu quả của bộ kit.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Bộ Kit Trong Chẩn Đoán Virus

Bộ kit TopSPEC® PEDV RT-qPCR không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có ứng dụng thực tiễn trong chẩn đoán virus PEDV ở lợn. Việc sử dụng bộ kit này giúp các bác sĩ thú y nhanh chóng phát hiện và kiểm soát dịch bệnh, từ đó bảo vệ sức khỏe đàn lợn.

4.1. Vai Trò Của Bộ Kit Trong Ngành Chăn Nuôi

Bộ kit TopSPEC® PEDV RT-qPCR đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm virus PEDV, giúp ngăn chặn dịch bệnh lây lan trong các trang trại chăn nuôi.

4.2. Kết Quả Nghiên Cứu Được Ứng Dụng Thực Tế

Kết quả nghiên cứu cho thấy bộ kit có thể được áp dụng rộng rãi trong các cơ sở chăn nuôi, giúp nâng cao hiệu quả quản lý dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe đàn lợn.

V. Kết Luận Về Đánh Giá Độ Nhạy và Đặc Hiệu Bộ Kit TopSPEC PEDV RT qPCR

Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit TopSPEC® PEDV RT-qPCR cho thấy đây là một công cụ hiệu quả trong việc phát hiện virus PEDV. Bộ kit không chỉ có độ nhạy và độ đặc hiệu cao mà còn có khả năng ứng dụng thực tiễn trong ngành chăn nuôi lợn.

5.1. Tương Lai Của Bộ Kit Trong Chẩn Đoán Virus

Bộ kit TopSPEC® PEDV RT-qPCR hứa hẹn sẽ tiếp tục được cải tiến và phát triển, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong việc phát hiện virus PEDV.

5.2. Khuyến Nghị Đối Với Ngành Chăn Nuôi

Ngành chăn nuôi cần áp dụng bộ kit này trong quy trình chẩn đoán để nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh, từ đó bảo vệ sức khỏe đàn lợn và giảm thiểu thiệt hại kinh tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY-HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS EVALUATION FOR SPECIFICITY AND SENSITIVITY OF TopSPEC® PEDV RT-qPCR kit Majors : BIOTECHNOLOGY Student : LE THI TUYET NGA Student code : 19126252 Academic year : 2019 - 2023 Thu Duc city, 02/2024 ACKNOWLEDGMENTS I would like to express my sincere gratitude towards the Board of Nong Lam University Ho Chi Minh City and the Board of Faculty of Biological Sciences for creating the most favorable conditions for me to finish this study First, I’m grateful to my advisor, PhD Dinh Xuan Phat, whose expertise and talents were very helpful in developing the approach and research topics. His perceptive criticism helped me to improve my work and forced me to think more critically. Next, I would like to thank Mr. MiMi, and the Bio313 laboratory personnel for their assistance and companionship in helping me overcome obstacles and hurdles in order to do my responsibilities for this project.

Finally, I am grateful to my parents for their unwavering support, listening, and faith throughout the years. At my greatest and worst moments, they are there for me constantly. Finally, without the help of my friends, who participated to the debates for my graduation thesis, I could not have finished my dissertation. Even if I'm still far from perfect and haven't thanked everyone enough, I hope those who have really assisted me are doing well and have success in their careers.

CONFIRMATION COMMITMENT My name is Le Thi Tuyet Nga, Student ID: 19126252, Class: DH19SHC, Faculty of Biological Sciences, Nong Lam University Ho Chi Minh City. I guarantee that this research was conducted by myself and that the results presented are utterly truthful and Thu Duc City, February 2024 Student’s signature ABSTRACT The topic research "Evaluation for specificity and sensitivity of TopSPEC® PEDV RI-qPCR KIT for detection the presence of PEDV in pigs” was conducted to test the effectiveness detection of the JopSPEC® PEDV RT-qPCR KIT to Porcine Epidemic Diarrhea virus (PEDV) through evaluating the specificity and sensitivity of the the trial kit on field samples. In this study, the limit of detection (LOD) of the the trial kit was 50 copies/reaction and specificity amplification to PEDV and there was no non-amplification to 6 types of bacteria and 3 types of virus. The standard curve of this kit was conducted with parameters of a slope of -3.6223, a linear correlation (R’) of 0.

In the same study, the test kit was able to detect PEDV presence on the background of high-precision in 82 field samples with diagnostic sensitivity and specificity reached 100%, negative and positive predictive values also reached 100%; at the same time, the the trial kit also had stability in detecting PEDV when there was a coefficient of fluctuation (CV%) of 3 repetitions using positive samples from 0% to 13% in FAM signal (Pathogen) and 0% to 14% in HEX signal (IC). Therefore, the trial kit could be used to detect the presence of PEDV and routine diagnosis in veterinary fields. Keywords: /imit of detection, PEDV, real-time PCR (qPCR), specificity, the trial kit. TÓM TẮT Đề tài “Đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của bộ kit thử nghiệm TopSPEC® PEDV RT-qPCR KIT” được tiến hành nhằm kiểm tra hiệu quả khuếch dai của bộ kit thử nghiệm TopSPEC® PEDV RT-qPCR KIT trong việc phát hiện Porcine Epidemic Diarrhea virus (PEDV) dựa trên đánh giá độ đặc hiệu, độ nhạy của bộ kit thử nghiệm.

Trong nghiên cứu này đã xác định thành công được giới han phát hiện (LOD) của bộ kit thử nghiệm là 50 copies/phản ứng và khuếch đại đặc hiệu đối với PEDV và không có phản ứng không đặc hiệu nào đối với 6 chủng vi khuan và 3 chủng virus. Đường chuẩn của bộ kit thử nghiệm được xây dựng với các thông số: hệ số đốc (Slope) -3,6223, hệ sỐ tương quan R? = 0,9947 và hiệu quả khuếch đại (E%) 89%. Cũng trong nghiên cứu này, bộ kit thử nghiệm có khả năng phát hiện sự hiện diện PEDV trên 82 mẫu thực địa có độ chính xác cao với độ nhạy và độ đặc hiệu chân đoán đạt đến 100%, giá trị đự đoán âm tính và dương tính cũng đạt 100%; đồng thời, bộ kit thử nghiệm còn có độ ôn định trong việc phát hiện PEDV khi có hệ số dao động (CV%) giữa 3 lần lặp lại mẫu đương tính từ 0% đến 13% ở kênh mau FAM (mam bệnh) và 0% đến 14% ở kênh màu HEX (IC). Tom lại, nghiên cứu này cho thấy bộ kit thử nghiệm này có thé sử dụng trong việc chan đoán thường qui phát hiện sự hiện diện của PEDV.

Từ khóa: độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, kit thử nghiệm, PEDV, real-time PCR (qPCR). TABLE OF CONTENTS ACKNOWLEDGMENTS00157575. 1 CONFIRMATION COMMITMENT se szesszseoseesseeoseisoeodbgadinlb34olxSg4bg01450010i600 40g00. 1 FBS TRIAG I ennsstnorsnidtnirtSEtGS0S0S0G03815G003GG9NS10Ợ3N90NSEĐ11N0NGDRGSSWGUUEHHGIGIGIMSSRIGGGHHEDI5SGI30MG000030810030101 11 ¡0v -.

iv LIST OF ABBREVIATIONS 1157. vil LIST OE ABLES cnzseststibuiototscbsitbsEitblenst2sgtabtvsdiibt3dgdssiutstbsgpsbbiSugihdtBtdiasaltbspapbsiiesgssee Vill EIST OF FIGURESvecoseneresyoseynecneap ee casas san nenseouusre-anatantanesdeyenmcun eve mdeoeaneanumxemm veratns: 1X lu E2 To M5] oi Vi Ms 919) 816M L6 ốc. 1 DOD CCN Sac .r aa 2 sre oscilSee ee ee ee eee ee ee ee 2 2a MOOUCHON 16. PE D VÌ ce ssenocsseursassmwonenneseneenmn cucu seeeatan sutcee sueseeunenensswonnsentsnemvenamnomnerucets 2.

Dl Dra, FUMIO MSO) eccrine WN SAS RE RSE 4 2A 2 ls |LPBfISTHIISSLOTssesesstabseesesoesdlanoliediiplispifoyGiobfgpllbsiBeiClaenlioleleEipriadlpsayagtgsaeboisaitmei 4 25129100: PatO B61 C918 sesercerisater raters tone ieee amare area ce aOR EERE 5 2.RSESRBEISEREEIGESSEDISIRSEHESRSSEESSHBIESSRSSEEEGS8SEAB 7 252; Real-time POR technique icceceerusnennesennumevne urn aeerenereeenaan 8 H58 lonINA BATT BOY 6 tos ect secon cites ces areata wteasetiarel aceasta sce ina ian sneer TEES 9 2. PHASES) soizsxz1530163953515G435283168046SE3SESSESÀABESHEASSBSEESMBSASEESSEHHESEESESEESSSEASS4SEE43GEESSESSSS84084E 11 2. Baseline, threshold cycle and standard curve.-- ------++s++ss++s£+zs+zessess 12 D.23:3), ,TUIIEEINAL,GGTIREGI (UC) wees. scannre kgGihgno8t1S12ESĐ1SS8083358828'0588/1x38EB4SESBISE8G3238000388028.

- -- - + 2222211551111 1111111 115555351 1111111 KHE n5 11 111k kcẻ 14 CHAPTER 3. MATERIALS AND METHOID. Location and duration na. 15 Sed, Matetia lS TESGHTGHHsseieoeassssidobietDApitieDVEESIELISESSVETDRE-SNOAREEIANASSĐ0RS5Đ93390010i03330/AE91008 15 uất, 0V PHOAO (01:4) ae a en en ee ee 16 Si: La WHE RIN AVERTE CHO puauasaesinboooitiiinhsitintàiaiS00900.

Reverse transcription Real-time PCT. Evaluation of the specificity and sensitivity of TopSPEC® PEDV RT-qPCR kit ee 17 3. Evaluation of the specificity of the trial KIẨ.- --- 5-55 +++ss+ss+eesrsreesreess 17 3. Determine the limit of detection (LOÏD).

Evaluating the detectability of PEDV in field samples.-- --- 55-5 5<+ 18 24:9› 124188118 lý Š eee ene ee ee ee ee 19 CHAPTER 4. RESULTS AND DISCUSSION. I5, ARE SULES: stsemesscesscsteraustiecttatetrs seman natal rine ta mie ini oe Sa 20 4. Evaluating of the specificity of the trial KIt.2 Determination for the limit of detection (LOID).

Evaluating the ability detection PEDV in field samples. Evaluating the ability of detection PEDV by the trial kit and commercial kit. Evaluate the stability of the the trial kit in detecting PEDV.3 Diagnostic sensitivity and specificity, negative and positive predictive values25 K5) 1SGIRETTTszssssc2128x06222805Sb:cd103i28g53048G5ggo6:tieRgsStlliBstGostibgsgadgcBggtujtgBielqdlgaszsggbgaiosacbitsse 26 CHAPTER 5. CONCLUSION AND RECOMMENDA TION.

29 5a, CUOI G LUIS OT esse ores ear reinetaemeae a oe oa menses Soerarsie ees E eae 29 5.22 RECOMMMEHIST ON sesiisiissisiiitiL1680460356840636036430.88 29 LIST OF ABBREVIATIONS Ct : Cycle threshold DNA : Deoxyribonucleic acid : Ribonucleic Acid IC : Internal control ORF : Open reading frame PCR : Polymerase Chain Reaction RT-PCR : Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction RT-qPCR : Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction PCV2 : Porcine Circovirus type 2 PRRSV : Porcine reproductive and respiratory syndrome virus ASFV : African swine fever virus PEDV : Porcine Epidemic Diarrhea Virus LIST OF TABLES Table 3. Evaluating of results qPCR to detect PEDV. Determination of TP, TN, FP, and FN of the trial kit. Ct values of diluted PEDV RNA plasmid concentrations of 3 repetitions.21 LIST OF FIGURES Page Figure 2.

Genome and virion structure of PEIDV. Several transmission routes of PEDV Infection. Four-day-old pig from farm 1 with acute porcine epidemic diarrhea. SYBR Green during PCR amplificat1on.- --- 5-5 s++ss++s=+s>+eczzss+ 10 Figure 2.

Principlewt Tag Matt a8 Say ecsccccere sce ce cmeee cama some raeme eeu raaeuee: 11 Figure 2. The general PCR amplification CUTV€. Specific evaluation of the qPCR test for PEDV detection. Determine the PEDV RT-qPCR kit's LOI.

Standard curve of PEDV RT-qPCR kit at 7 point concentrations. The result to detect PEDV in field samples of two PEDV RT-qPCR kit. Result of PEDV detection test on negative samples of PEDV RT-qPCR kit. Introduction The pig industry is an important agricultural sector in Vietnam, providing food for the population.

The pig industry is not only an essential source of food for the people, but it has additionally been an important part in economic development. Pig farming assists people in increasing their income and resolving job issues. Nevertheless, our country's farm animals company confronts several challenges, including degradation of the environment, dropping pricing, the usage of prohibited drugs, antibiotic oversupply, and a variety of other issues and and among them we can mention: “epidemic”. Porcine Epidemic Diarrhea (PED) is a non-zoonotic viral illness that affects pigs and is characterized by watery diarrhea and weight loss.

According to OIE TECHNICAL FACTSHEET (OIE) in 2014, it affected pigs of all ages, but most severely the neonatal piglets, with morbidity and mortality exceeding 100% and decreasing with age. PEDV is belonging to the family Coronaviridae, the genus Alphacoronavirus. The PED epidemic has resulted in significant economic losses for the worldwide pig sector, particularly Vietnam (Tien ef a/. Dang ef al., 2016 found that PEDV infection usually spread among pigs of different ages in the following sequence: fattening/replacement pigs were first infected, then the virus accumulated and infected pregnant sows, bringing the virus to the delivery room; the subclinical infected sows then transmitted PEDV to the suckling piglets, resulting in an eventual epidemic among the piglets (Zhang ef a/.

As aresult, PEDV’s detection is important for controlling the spread of viruses on pig farms. Today, there are many methods used to develop pathogens, including real- time PCR. The Real-time PCR technology for diagnosing and identifying infections provide speedy, accurate, and cost-effective findings that are appropriate for our country's research and application requirements. The topic " Evaluation for specificity and sensitivity of TopSPEC® PEDV RT-qPCR KIT for detection the presence of PEDV in pigs " was performed.

Objective Successfully evaluating the specificity and sensitivity of TopSPEC® PEDV RT- qPCR kit to detect the presence of PEDV in pigs. Contents Content 1: Evaluate the sensitivity and specificity of the TopSPEC® PEDV RT- qPCR kit. Content 2: Use two experimental and controlled Realtime PCR_ kits (commercially available) to survey the presence of PEDV. Introduction to PEDV 2.

Structure of PEDV Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is a single-stranded RNA virus with an envelope that belongs to the genus A/phacoronavirus in the family Coronaviridae of the order Nidovirales. S protein, which dominates the surface of virus particles and promotes direct attachment to cell receptors, is a significant target to produce neutralizing antibodies among the four PEDV structural proteins, including spike protein (S), envelope protein (E), membrane protein (M), and nucleocapsid protein (N) (Chang ef al., 2002; Wicht ef al. Pun Lee TT+ pptab Lol I Pu I Jed 7 ee eT 3 4 5 $6 79910 12 13 14 +5 +16 E (7 kDa) ⁄ SSS > aA) 4 M (27-32 kDa) ‹{ ———=Kkeeeneekee oe A) 5 c> ae, =. Genome and virion structure of PEDV (Lee, 2015).

The PEDV genome is approximately long of 28 kb, with a 5' cap and a 3' polyadenylated tail, and it contains a 5' UTR, at least 7 open reading frames (ORF la, ORF 1b, and ORF 2 - 6), and a 3' UTR. The two major ORFs 1a and 1b, which code for nonstructural proteins (nsps), occupy the 5'-proximal two-thirds of the genome (Figure 2. A single N protein encapsulates the PEDV genome, generating a long and helical coil shape that is enveloped in a lipid envelope comprising three surface-associated structural proteins, S, M, and E (Figure 2.