## Tổng quan nghiên cứu

Dịch tả lợn Châu Phi (ASF) là một dịch bệnh nguy hiểm với tỷ lệ tử vong gần như 100% ở lợn nhiễm bệnh, gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế và an ninh thực phẩm toàn cầu. Từ khi dịch bùng phát tại tỉnh Liêu Ninh, Trung Quốc vào tháng 8 năm 2018, ASF đã lan rộng ra toàn bộ 63 tỉnh thành của Việt Nam, khiến hơn 6 triệu con lợn bị tiêu hủy. Việc phân biệt ASF với bệnh dịch tả lợn cổ điển (CSF) qua triệu chứng lâm sàng và mổ tử thi là rất khó khăn, trong khi hiện chưa có vắc xin hay thuốc điều trị đặc hiệu. Do đó, phát triển phương pháp xét nghiệm real-time PCR với độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện sớm ASFV được xem là công cụ quan trọng trong công tác phòng chống dịch bệnh.

Mục tiêu nghiên cứu bao gồm hoàn thiện quy trình phát hiện ASFV trên đa dạng nền mẫu sử dụng kỹ thuật real-time PCR, xác định tỷ lệ lưu hành dịch bệnh trong khu vực và đánh giá các yếu tố nguy cơ lây nhiễm từ môi trường chăn nuôi. Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 9/2019 đến tháng 3/2022 tại phòng xét nghiệm Công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa, với tổng số 7.713 mẫu thử gồm mẫu máu, nội tạng, dịch cơ thể và mẫu môi trường.

Kết quả nghiên cứu không chỉ cung cấp dữ liệu dịch tễ quan trọng mà còn góp phần xây dựng bộ kit xét nghiệm real-time PCR sẵn sàng sử dụng, hỗ trợ công tác giám sát và kiểm soát ASF tại Việt Nam, góp phần giảm thiểu thiệt hại kinh tế và bảo vệ nguồn cung thực phẩm quốc gia.

## Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

### Khung lý thuyết áp dụng

- **Virus ASFV và đặc điểm cấu trúc:** ASFV là virus DNA sợi kép có cấu trúc phức tạp, bao gồm lớp vỏ capsid protein p72 đặc trưng, có khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường và các sản phẩm thịt lợn.
- **Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của ASFV:** Virus xâm nhập tế bào chủ qua cơ chế nhập bào, nhân lên trong vùng ngoại nhân tế bào, sử dụng các enzym phiên mã riêng biệt, tạo ra các virion mới và giải phóng ra ngoài.
- **Các con đường lây nhiễm:** Bao gồm chu trình hoang dại (lợn hoang và ve mềm), chu trình ve-lợn và chu trình lợn nuôi, với khả năng lây lan qua tiếp xúc trực tiếp, môi trường và vật trung gian.
- **Kỹ thuật real-time PCR:** Phương pháp khuếch đại gen VP72 của ASFV được OIE khuyến cáo, sử dụng primer và probe đặc hiệu, cho phép phát hiện nhanh, nhạy và đặc hiệu virus trong các mẫu thử đa dạng.
- **Khái niệm về độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD), và kiểm soát chất lượng:** Các thông số kỹ thuật quan trọng để đánh giá hiệu quả của bộ kit xét nghiệm.

### Phương pháp nghiên cứu

- **Nguồn dữ liệu:** Tổng cộng 7.713 mẫu thử, trong đó 6.665 mẫu máu, nội tạng, dịch cơ thể trực tiếp từ lợn nuôi và 1.068 mẫu môi trường, nước, bề mặt chuồng trại, đất và véc-tơ trung gian truyền bệnh (ruồi, chuột, muỗi).
- **Phương pháp chọn mẫu:** Mẫu được thu thập ngẫu nhiên từ các trang trại quy mô lớn, vừa và nhỏ tại khu vực Đông Nam Bộ Việt Nam.
- **Phương pháp phân tích:** Xây dựng và hoàn thiện bộ kit real-time PCR (NK ASFVquant PCR kit) sử dụng primer và probe theo khuyến cáo của OIE, đánh giá các thông số kỹ thuật như độ nhạy (LOD 1.854 bản sao/phản ứng), độ đặc hiệu (100%), độ lặp lại và tái lập (CV ≤ 10%), khả năng chống ức chế PCR và độ ổn định sử dụng.
- **Timeline nghiên cứu:** Từ tháng 9/2019 đến tháng 3/2022, bao gồm các giai đoạn tổng hợp primer-probe, xây dựng master mix, thẩm định kỹ thuật, thu thập và xử lý mẫu, thực hiện xét nghiệm, giải trình tự gen VP72 và phân tích dữ liệu.
- **Phân tích thống kê:** Sử dụng phần mềm chuyên dụng để tính toán tỷ lệ dương tính, so sánh tỷ lệ lưu hành giữa các nhóm mẫu và các quy mô trang trại, xác định yếu tố nguy cơ lây nhiễm.

## Kết quả nghiên cứu và thảo luận

### Những phát hiện chính

- **Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit:** Bộ kit real-time PCR phát hiện ASFV có giới hạn phát hiện là 1.854 bản sao/phản ứng (95% CI: 1.073 - 3.205), độ đặc hiệu đạt 100%, độ lặp lại và tái lập rất tốt với hệ số biến thiên (CV) ≤ 10%, và có khả năng chống ức chế PCR hiệu quả.
- **Tỷ lệ lưu hành ASFV:** Trong tổng số 7.713 mẫu, tỷ lệ dương tính với ASFV là 7%. Tỷ lệ lưu hành trên mẫu máu, nội tạng hoặc dịch cơ thể trực tiếp từ lợn tại các trang trại vừa và nhỏ lên đến 23,93%, trong khi tại các trang trại lớn chỉ khoảng 6%.
- **Yếu tố nguy cơ môi trường:** Tỷ lệ phát hiện ASFV trên các mẫu quệt môi trường, nền chuồng, bề mặt chuồng, đất, nước sinh hoạt và nước thải tại trang trại vừa và nhỏ là 7,37%, trong khi tại trang trại lớn chỉ là 1%.
- **Phân tích genotype:** Giải trình tự gen VP72 của 13 mẫu dương tính cho thấy tất cả đều thuộc genotype II, phù hợp với các chủng ASFV lưu hành tại khu vực Đông Nam Bộ Việt Nam.

### Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy bộ kit real-time PCR phát hiện ASFV có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp để ứng dụng trong xét nghiệm thường quy, giúp phát hiện sớm và chính xác dịch bệnh. Tỷ lệ lưu hành cao ở các trang trại vừa và nhỏ phản ánh nguy cơ lây lan dịch bệnh lớn do điều kiện an toàn sinh học kém hơn so với trang trại lớn. Yếu tố môi trường như nền chuồng, nước và bề mặt chuồng cũng đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì và lây lan virus, cần được kiểm soát chặt chẽ.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả tương đồng với các báo cáo về genotype II là chủng phổ biến tại châu Á và châu Âu. Việc xác định genotype giúp hiểu rõ hơn về nguồn gốc và cơ chế lây lan của virus, hỗ trợ xây dựng chiến lược phòng chống hiệu quả.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tỷ lệ dương tính theo quy mô trang trại và loại mẫu, bảng so sánh các thông số kỹ thuật của bộ kit, cũng như cây phát sinh phân tử thể hiện mối quan hệ giữa các mẫu genotype II.

## Đề xuất và khuyến nghị

- **Triển khai rộng rãi bộ kit real-time PCR:** Áp dụng bộ kit NK ASFVquant PCR kit trong các phòng xét nghiệm thú y trên toàn quốc để nâng cao năng lực phát hiện sớm ASFV, giảm thiểu thiệt hại kinh tế.
- **Tăng cường kiểm soát an toàn sinh học tại trang trại vừa và nhỏ:** Thực hiện các biện pháp vệ sinh, khử trùng môi trường chăn nuôi, kiểm soát nguồn nước và bề mặt chuồng nhằm giảm tỷ lệ lây nhiễm ASFV, mục tiêu giảm tỷ lệ dương tính xuống dưới 5% trong vòng 12 tháng.
- **Đào tạo và nâng cao nhận thức cho người chăn nuôi:** Tổ chức các khóa tập huấn về phòng chống ASF, cách sử dụng bộ kit xét nghiệm và quản lý yếu tố nguy cơ, nhằm nâng cao hiệu quả phòng dịch.
- **Khảo nghiệm và cấp phép bộ kit:** Thực hiện khảo nghiệm bộ kit tại các đơn vị có thẩm quyền và hoàn thiện thủ tục cấp phép lưu hành bởi Cục Thú y để đảm bảo tính pháp lý và độ tin cậy khi sử dụng rộng rãi.
- **Xây dựng quy trình kiểm soát yếu tố nguy cơ:** Phát triển hướng dẫn chi tiết về kiểm soát các yếu tố nguy cơ lây nhiễm ASFV trong môi trường chăn nuôi, áp dụng trong vòng 6 tháng tới tại các trang trại trọng điểm.

## Đối tượng nên tham khảo luận văn

- **Cơ quan quản lý thú y và chính sách:** Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách phòng chống ASF, cấp phép bộ kit xét nghiệm và giám sát dịch bệnh hiệu quả.
- **Phòng xét nghiệm thú y:** Áp dụng quy trình real-time PCR và bộ kit NK ASFVquant PCR kit để nâng cao năng lực chẩn đoán, phát hiện sớm ASFV trên đa dạng mẫu thử.
- **Người chăn nuôi và doanh nghiệp chăn nuôi:** Nắm bắt thông tin về tỷ lệ lưu hành và yếu tố nguy cơ để cải thiện điều kiện chăn nuôi, áp dụng biện pháp an toàn sinh học phù hợp.
- **Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, thú y:** Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật real-time PCR và dữ liệu dịch tễ để phát triển các nghiên cứu tiếp theo về ASF và các bệnh truyền nhiễm khác.

## Câu hỏi thường gặp

1. **Real-time PCR có ưu điểm gì trong phát hiện ASFV?**  
Real-time PCR cho phép phát hiện nhanh, nhạy và đặc hiệu virus ASFV trên đa dạng mẫu thử, giúp phát hiện sớm dịch bệnh trước khi có triệu chứng lâm sàng rõ ràng.

2. **Tỷ lệ lưu hành ASFV tại các trang trại khác nhau như thế nào?**  
Trang trại vừa và nhỏ có tỷ lệ dương tính lên đến 23,93% trong khi trang trại lớn chỉ khoảng 6%, phản ánh sự khác biệt về điều kiện an toàn sinh học.

3. **Genotype II của ASFV có ý nghĩa gì?**  
Genotype II là chủng phổ biến tại Việt Nam và nhiều quốc gia châu Á, giúp xác định nguồn gốc và hướng phòng chống dịch bệnh phù hợp.

4. **Bộ kit NK ASFVquant PCR kit có thể sử dụng ở đâu?**  
Bộ kit được thiết kế để sử dụng trong các phòng xét nghiệm thú y, cần được cấp phép lưu hành bởi Cục Thú y trước khi sử dụng rộng rãi.

5. **Yếu tố môi trường nào ảnh hưởng đến sự lây lan ASFV?**  
Nền chuồng, bề mặt chuồng, đất, nước sinh hoạt và nước thải là các yếu tố môi trường có thể chứa virus và đóng vai trò quan trọng trong việc lây lan ASFV.

## Kết luận

- Đã xây dựng thành công bộ kit real-time PCR với độ nhạy 1.854 bản sao/phản ứng và độ đặc hiệu 100% để phát hiện ASFV trên đa dạng nền mẫu.  
- Xác định tỷ lệ lưu hành ASFV là 7% trên tổng số 7.713 mẫu, với tỷ lệ cao ở trang trại vừa và nhỏ.  
- Phân tích genotype cho thấy tất cả mẫu dương tính thuộc genotype II, phù hợp với tình hình dịch tễ khu vực.  
- Đề xuất các giải pháp kiểm soát an toàn sinh học và triển khai bộ kit xét nghiệm nhằm giảm thiểu nguy cơ lây lan dịch bệnh.  
- Khuyến nghị khảo nghiệm và cấp phép bộ kit để sử dụng rộng rãi trong công tác phòng chống ASF tại Việt Nam.

Hành động tiếp theo là hoàn thiện thủ tục cấp phép bộ kit, triển khai đào tạo sử dụng và áp dụng quy trình kiểm soát yếu tố nguy cơ tại các trang trại trọng điểm nhằm nâng cao hiệu quả phòng chống dịch bệnh.