Đặt vấn đề Dịch tả lợn Châu Phi (ASF) là dịch ệnh nguy hiểm gây chết trên lợn, có sức tàn phá to lớn đối với nền kinh tế và an ninh thực phẩm, kể từ khi dịch tái ùng phát gần đây ở tỉnh Liêu Ninh, Trung Quốc vào tháng 8 n m 2018; dịch đã lan rộng ra toàn đ t nƣớc và lây lan các quốc gia lân cận, 50% tổng đàn của toàn thế giới đã ị thiệt hại, ASF đƣợc OIE cảnh áo về dịch ệnh xuyên ên giới và có tác động toàn cầu. Dịch tả lợn Châu Phi gây ra ởi vi rút ASFV lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Kenya vào n m 1921 [1], trong suốt giai đoạn đầu ệnh chỉ lƣu hành ở Châu Phi. N m 2007 dịch ắt đầu lây lan ra khỏi Châu Phi xâm nhập vào vùng Kavkaz, tiêu iểu là Georgia vào n m 2014, nó đã lan đến lãnh thổ phía đông của Liên minh Châu Âu. Sự phức tạp về mặt dịch tễ học của ASF đã đƣợc chứng minh rõ ràng ở miền đông và miền nam Châu Phi, nơi đặc điểm di truyền của ASFV dựa trên những iến đổi trình tự trong vùng kết thúc đầu C của gen B646L mã hóa protein capsid p72, cho th y sự hiện diện của 22 kiểu gen [2, 3].
Ở Việt Nam, ca nhiễm vi rút ASF lần đầu tiên đƣợc áo cáo vào tháng 2 n m 2019. Sau đó ệnh nhanh chóng lan rộng ra t t cả 63/63 tỉnh thành. Hơn 6 triệu con lợn đã ị tiêu huỷ ở các trại, gây ra thiệt hại lớn về kinh tế và nguồn cung thực phẩm. Theo khuyến cáo tổ chức thú y thế giới (OIE), các kỹ thuật chẩn đoán ASFV trong phòng thí nghiệm đƣợc phân loại thành i) thử nghiệm vi rút học ao gồm phân lập kết hợp HAD, phát hiện hệ gen vi rút nhƣ PCR hay real – time PCR, … và ii) thử nghiệm huyết thanh học tiêu iểu là ELISA, lai miễn dịch (IB), lai huỳnh quang (IFA).
Trong đó HAD đƣợc xem là ―tiêu chuẩn vàng‖ và là thử nghiệm khẳng định dƣơng tính với ASFV, tuy nhiên điểm hạn chế của kỹ thuật là yêu cầu chuyên môn của nhân viên thực hiện, trang thiết ị và cơ sở đảm ảo an toàn sinh học động vật cũng nhƣ thời gian phát hiện đến hơn 2 tuần [4, 5]. Cho đến nay vẫn chƣa có vắc xin và thuốc điều trị ASF, trong khi các ác s thú y chƣa thể phân iệt chính xác ệnh 1 dịch tả lợn Châu Phi (ASF) với ệnh dịch tả lợn cổ điển (CSF) thông qua th m khám các iểu hiện lâm sàng và mổ tử thi [6]. Chính vì vậy, việc phát triển ộ xét nghiệm sử dụng kỹ thuật real-time PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện sớm ệnh đƣợc xem là công cụ chính hỗ trợ trong nhiệm vụ phòng chống dịch của quốc gia. Từ các v n đề trên, tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) trên đa dạng các nền mẫu sử dụng kỹ thuật real-time PCR”.
Mục tiêu nghiên cứu Hoàn thiện quy trình phát hiện ASFV có khả n ng triển khai trong xét nghiệm thƣờng quy. Xác định mức độ lƣu hành của dịch ệnh trong khu vực từ các mẫu thử là dịch cơ thể của vật nuôi hay các đối tƣợng mẫu thử là môi trƣờng ch n nuôi. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tƣợng mẫu: Cặp mồi và đoạn dò, hoá ch t real-time PCR Khảo sát tình hình dịch ệnh: tổng cộng thu nhận 6665 mẫu máu, nội tạng hoặc dịch cơ thể trực tiếp từ lợn nuôi đƣợc thu thập tại Phòng xét nghiệm thuộc Công ty TNHH Dịch vụ và Thƣơng mại Nam Khoa. Khảo sát tình hình vi rút tồn tại trong môi trƣờng ch n nuôi: tổng cộng thu nhận 1068 mẫu kiểm soát môi trƣờng, nƣớc, ề mặt chuồng trại, đ t và mẫu véc-tơ trung gian truyền ệnh (ruồi, chuột, muỗi) đƣợc thu thập tại Phòng xét nghiệm thuộc Công ty TNHH Dịch vụ và Thƣơng mại Nam Khoa.
Thời gian thực hiện đề tài: từ 09/2019 đến 03/2022 Địa điểm nghiên cứu: Phòng xét nghiệm thuộc Công ty TNHH Dịch vụ và Thƣơng mại Nam Khoa 2 4. Cách tiếp cận và phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Hoàn thiện real-time PCR mix phát hiện ASFV Kiểm tra các thiết kế primer – pro e đƣợc OIE khuyến cáo in silico Tổng hợp hoá học trình tự primer – pro e phát hiện ASFV Tổng hợp hoá học trình tự primer – pro e cho chứng nội tại ổ sung vào phản ứng real-time PCR. Giới hạn phát hiện (LOD). Độ đặc hiệu phân tích.
Khả n ng chóng ức chế. Độ ổn định sử dụng.2 Xác định tỷ lệ lƣu hành của bệnh trong khu vực Xử lý mẫu tiền ly trích Thu nhận DNA tổng số từ mẫu thử Thực hiện phản ứng real – time PCR định tính ASFV Thống kê tỷ lệ dƣơng tính trong quần thể 4.3 Xác định yếu tố nguy cơ lây nhiễm trên nền mẫu môi trƣờng, bề mặt Xử lý mẫu tiền ly trích Thu nhận DNA tổng số từ mẫu thử Thực hiện phản ứng real – time PCR định tính ASFV Thống kê tỷ lệ dƣơng tính trên các yếu tố nguy cơ và môi trƣờng ch n nuôi.4 Xác định genotype ASFV Khuếch đại trình tự 478 p trên vùng ảo tồn của gen mã hoá VP72 Giải trình tự gen ảo tồn đƣợc khuếch đại 4.5 Xây dựng quy trình kiểm soát yếu tố nguy cơ Mô tả các đối tƣợng liên quan đến quá trình nuôi nhốt trong chuỗi thực hành cần yêu cầu tầm soát ASFV 3 5. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Hình thành real – time PCR mix ở dạng ―ready – to – use‖ phục vụ xét nghiệm thƣờng quy. Xác định tỷ lệ lƣu hành của vi rút nhằm cung c p thông tin về dịch tễ, đặc điểm quần thể lợn đƣợc nuôi.
Xác định các nguy cơ lây nhiễm thực tế từ các yếu tố trung gian tiềm ẩn từ đó khuyến cáo hộ ch n nuôi trong thực hành an toàn sinh học phù hợp. Xác định genotype ASFV lƣu hành chủ yếu ở miền Đông Nam Bộ Việt Nam. 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 African Swine Fever Virus (ASFV) Bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) là một ệnh xu t huyết do vi rút gây ra với khả n ng gây chết đặc iệt cao ở lợn nhà và lợn rừng Âu Á. Mặc dù phạm vi ký chủ hạn chế và không có tiềm n ng lây nhiễm từ động vật sang ngƣời, tác động kinh tế xã hội của ệnh là r t lớn.
Cũng chính vì lý do này, Dịch tả lợn Châu Phi đã đƣợc Tổ chức Thú Y Thế giới (OIE) cảnh áo toàn cầu. Trong hầu hết các trƣờng hợp, ệnh ảnh hƣởng đến lợn nuôi, vật chủ hoang dã nhƣ là lợn rừng hoặc lợn hoang khác; vi rút gây ệnh có khả n ng tồn lƣu trên các yếu tố trung gian truyền ệnh (ví dụ: xác lợn, môi trƣờng xung quanh ị ô nhiễm, dụng cụ, các véc-tơ cơ học khác) và các véc-tơ động vật chân đốt (ve mềm). Điều đáng ngại là các iện pháp kiểm soát chủ yếu dựa vào các iện pháp vệ sinh nghiêm ngặt do hiện tại không có vắc xin phòng ệnh hoặc t kỳ phƣơng pháp điều trị nào.1 Phân loài ASFV Tác nhân gây ệnh ASF là vi rút dịch tả lợn Châu Phi (ASFV), một loại vi rút có vật liệu di truyền là DNA sợi kép kích thƣớc lớn thuộc chi Asfivirus trong họ Asfarviridae [7]. Theo công ố phân loại n m 2019 của Ủy an quốc tế về phân loại vi rút (EC 51, Berlin, Đức, tháng 7 n m 2019), họ Asfarviridae đã đƣợc đƣa vào ộ Asfuvirales và lớp Pokkesviricetes.
Ngoài danh pháp chính thức này, có một số tranh cãi khi ASFV hiện cũng đƣợc đƣa vào một ộ dự kiến Megavirales chứa đơn nhánh gồm nhóm vi rút có DNA nhân và tế ào ch t lớn (NCLDV) [8]. Bộ dự kiến này cũng sẽ ao gồm Poxviridae (hiện thuộc ộ mới của Chitovirales), Iridoviridae (hiện thuộc thứ tự Pimascovirales), Asfarviridae, Phycodnaviridae (hiện thuộc ộ Algavirales), Mimiviridae (thuộc ộ Imitervirales), Ascoviridae (hiện nay là Marseilleviridae (nay là Pimascovirales) [9]. Do liên tục phát hiện ra các loại vi rút kích thƣớc ―khổng lồ‖ mới nhƣ Pandoravirus [10, 11], Faustovirus [12], Mollivirus [13], Kaumaoebavirus [14], Cedratvirus [15], và Pacmanvirus [15], nhóm này có 5 thể sẽ phát triển trong tƣơng lai gần và danh pháp sẽ vẫn đang đƣợc thảo luận để hoàn thiện.2 Cấu trúc ASFV 1.1 Hình thể và cấu trúc phân tử của ASFV Phân tử vi rút ASF có c u trúc r t phức tạp với đƣờng kính tổng thể là 175–215 nm. Cho đến nay, ngƣời ta đã ghi nhận rằng phân tử vi rút ao gồm một lõi nucleoprotein (đƣờng kính 70-100 nm), lõi đƣợc ao quanh ởi một lớp màng trong lipid, một capsid hình tứ diện với 1892–2172 capsomers và một vỏ ngoài lipid [7].
Kết quả phân tích a chiều phân tử vi rút trƣởng thành ằng cryo-EM đơn hạt cho th y virion có đƣờng kính xuyên tâm là ∼2.080 Å, một nucleoid chứa ộ gen đƣợc ao quanh ởi hai capsid protein hình tứ diện và hai màng lipoprotein. Capsid ên ngoài tạo thành một mạng lục giác (T = 277) ao gồm 8.280 tiểu đơn vị của protein capsid chính là p72 dạng cuộn kép (MCP), đƣợc sắp xếp thành các ộ a tạo thành hình thái lục giác giả với 60 protein penton ở các đỉnh (Hình 1. Lớp protein ên trong, đƣợc tổ chức nhƣ một capsid T = 19, ao ọc lớp vỏ lõi đƣợc tạo thành từ các sản phẩm polyprotein ASFV pp220 và pp62. Hơn nữa, có một màng tứ diện nằm giữa hai lớp protein, trong khi một lớp vỏ đa hình ao ọc ên ngoài toàn ộ capsid.
C u tạo c p cao này tạo nên một kiến trúc độc đáo cho ASFV giữa các NCLDV, điều này phần nào phản ánh sự phức tạp trong quá trình lây nhiễm của vi rút và có thể giúp giải thích những thách thức hiện tại trong việc kiểm soát nó.1 C u trúc tổng thể ASFV. A, ảnh chụp cryo của phân tử vi rút. B, hình ảnh giả lập ề mặt vi rút. C, hình ảnh giả lập cắt lớp nửa dƣới vi rút cùng mô phỏng tái tạo ảng đồ 3D các thành phần c u trúc.
D, giản đồ vị trí sắp xếp các lớp của vi rút ASFV [8] 1.2 Cấu trúc hệ gen của ASFV Bộ gen ASFV ao gồm một phân tử DNA sợi kép 170–190 k p chứa từ 151 đến 167 khung đọc mở (ORF), tùy thuộc vào chủng vi rút [16]. Các đầu kết thúc của ộ gen hình thành c u trúc kẹp tóc (hairpin loops) tạo ởi việc lặp lại các trình tự đảo ngƣợc [17].