Luận văn: Nghiên cứu đặc tính sinh học Canine Parvovirus tại Bắc Việt Nam

Phân tích toàn diện Đặc tính sinh học Canine Parvovirus tại Bắc Việt Nam góp phần nâng cao kiến thức chuyên ngành và ứng dụng hỗ trợ đào tạo hiệu quả

• Tác giả: Kham Ning Bun Pha Xay
• Người hướng dẫn: Gs. Nguyễn Thị Lan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu đặc tính sinh học của Canine Parvovirus phân lập được ở phía Bắc Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cam đoan
• Danh mục chữ viết tắt
• Danh mục bảng
• Danh mục hình
• Danh mục biểu đồ
• Trích yếu luận văn
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
• 1.2.1. Mục tiêu chung
• 1.2.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. Tổng quan tài liệu
• 2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh do parvovirus gây ra trên thế giới và Việt Nam
• 2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh do Parvovirus gây ra trên thế giới
• 2.1.2. Tình hình dịch bệnh do Parvovirus gây ra tại Việt Nam
• 2.2. Đặc điểm sinh học của parvovirus
• 2.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen của Parvovirus
• 2.2.2. Phân loại và phân bố các type Parvovirus
• 2.2.3. Sức đề kháng của Parvovirus
• 2.2.4. Đặc tính nuôi cấy
• 2.2.5. Đặc tính kháng nguyên
• 2.2.6. Khả năng miễn dịch
• 2.2.7. Đường xâm nhập và cách truyền bệnh
• 2.2.8. Các phương pháp chẩn đoán
• 2.3. Tổng quan về nuôi cấy tế bào
• 2.3.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật
• 2.3.2. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào
• 2.3.3. Điều kiện nuôi cấy
• 2.3.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế
• 2.4. Phân lập virus
• 2.4.1. Khái quát về phân lập virus
• 2.4.2. Phân lập Parvovirus phục vụ nghiên cứu sản xuất vacxin vô hoạt
• 3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 3.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.3. Đối tượng/vật liệu nghiên cứu
• 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.4.1. Thu thập mẫu chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus
• 3.4.2. Nghiên cứu phân lập Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK
• 3.4.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của những chủng parvovirus phân lập được
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp mổ khám
• 3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA
• 3.5.3. Phương pháp PCR
• 3.5.4. Phương pháp phân lập Parvovirus
• 3.5.5. Phương pháp xác định hiệu giá virus
• 3.5.6. Xử lý số liệu
• 3.5.7. Phương pháp test kit xét nghiệm nhanh bệnh parvovirus trên chó
• 4. Kết quả và thảo luận
• 4.1. Kết quả thu thập mẫu chó mắc parvovirus
• 4.2. Kết quả phân lập virus trên môi trường tế bào CRFK
• 4.2.1. Kết quả phân lập Parvovirus
• 4.2.2. Kết quả kiểm tra sự có mặt của virus trong mẫu phân lập bằng phương pháp PCR
• 4.3. Xác định một số đặc tính sinh học của parvovirus
• 4.3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào của Parvovirus
• 4.3.2. Kết quả xác định hiệu giá của các chủng Parvovirus nghiên cứu
• 4.3.3. Xác định quy luật nhân lên của virus Parvo trên môi trường tế bào CRFK
• 5. Kết luận và kiến nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng quan về Canine Parvovirus tại Bắc Việt Nam hiện nay

Canine Parvovirus (CPV) là một trong những tác nhân gây bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất ở chó, đặc biệt là chó con. Tại Việt Nam, bệnh viêm ruột do Parvovirus đã được ghi nhận từ những năm 1990 và nhanh chóng trở thành mối đe dọa lớn đối với ngành chăn nuôi thú cưng. Virus này gây ra tình trạng viêm dạ dày - ruột xuất huyết cấp tính, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao, có thể lên tới 90% nếu không được điều trị kịp thời. Sự nguy hiểm của CPV không chỉ nằm ở độc lực cao mà còn ở khả năng tồn tại bền bỉ trong môi trường và sự tiến hóa liên tục. Ban đầu, CPV-2 là chủng gốc, nhưng sau đó đã tiến hóa thành các biến thể Canine Parvovirus mới như CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c, với khả năng lây nhiễm và gây bệnh khác nhau. Các biến thể này hiện đang lưu hành rộng rãi trên toàn thế giới, bao gồm cả Việt Nam. Nghiên cứu của Kham Ning Bun Pha Xay (2019) cho thấy tình hình dịch tễ tại miền Bắc Việt Nam rất phức tạp, đòi hỏi các nghiên cứu chuyên sâu để xác định đặc điểm của các chủng virus địa phương. Việc hiểu rõ đặc tính sinh học, cấu trúc di truyền và sự phân bố của các chủng CPV đang lưu hành là vô cùng cấp thiết. Những thông tin này không chỉ hỗ trợ công tác chẩn đoán chính xác mà còn là cơ sở khoa học quan trọng để phát triển các loại vắc-xin và phác đồ điều trị hiệu quả, phù hợp với bối cảnh dịch tễ tại Việt Nam. Các nghiên cứu về virus Parvo ở chó tại khu vực này giúp xây dựng một bức tranh toàn cảnh về sự tiến hóa của virus Parvo và đưa ra các chiến lược phòng chống dịch bệnh một cách chủ động và bền vững.

1.1. Lịch sử và sự bùng phát của bệnh Parvovirus ở chó

Canine Parvovirus được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1978. Chỉ trong vòng hai năm, virus đã lan rộng khắp thế giới, gây ra một đại dịch toàn cầu ở loài chó. Tại Việt Nam, bệnh được công bố chính thức vào năm 1994, mặc dù các ca bệnh lẻ tẻ đã được ghi nhận từ trước đó. Sự lây lan nhanh chóng của virus được cho là do khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường và lây truyền dễ dàng qua phân của chó bị nhiễm bệnh. Các giống chó ngoại nhập như Berger, Rottweiler, Doberman thường có tính cảm thụ cao hơn so với các giống chó nội. Sự gia tăng số lượng và chủng loại chó cảnh tại Việt Nam cũng góp phần làm cho dịch bệnh trở nên phức tạp hơn.

1.2. Các biến thể virus Parvo đang lưu hành phổ biến

Từ chủng gốc CPV-2, virus đã liên tục biến đổi, tạo ra các biến thể kháng nguyên mới. CPV-2a và CPV-2b xuất hiện vào những năm 1980, nhanh chóng thay thế chủng gốc. Đến năm 2000, biến thể CPV-2c được phát hiện tại Ý và sau đó lan ra nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Theo Nakamura và cộng sự, kiểu gen CPV-2c ở Việt Nam đã được ghi nhận, cho thấy sự đa dạng và phức tạp của các chủng virus tại đây. Mỗi biến thể có những thay đổi nhỏ trong cấu trúc protein capsid VP2, ảnh hưởng đến tính kháng nguyên của virus Parvo và khả năng né tránh hệ miễn dịch của vật chủ. Điều này đặt ra thách thức lớn cho việc sản xuất vắc-xin có khả năng bảo hộ chéo hiệu quả.

II. Thách thức trong việc kiểm soát dịch bệnh Parvovirus ở chó

Việc kiểm soát bệnh viêm ruột do Parvovirus tại Việt Nam đối mặt với nhiều thách thức đáng kể. Đầu tiên, sự biến đổi di truyền liên tục của virus, đặc biệt là sự xuất hiện của các biến thể mới như CPV-2c, làm giảm hiệu quả của các loại vắc-xin hiện hành vốn được sản xuất từ các chủng cũ. Điều này dẫn đến các trường hợp "vỡ vắc-xin", khi chó đã được tiêm phòng đầy đủ nhưng vẫn mắc bệnh. Thứ hai, khả năng chẩn đoán sớm và chính xác còn hạn chế ở nhiều cơ sở thú y. Mặc dù các bộ test nhanh khá phổ biến, chúng có thể cho kết quả âm tính giả trong giai đoạn đầu của bệnh. Các phương pháp chẩn đoán phân tử như PCR tuy có độ chính xác cao nhưng lại đòi hỏi trang thiết bị và chi phí lớn, chưa được áp dụng rộng rãi. Thách thức thứ ba đến từ sức đề kháng mạnh của virus trong môi trường. CPV có thể tồn tại nhiều tháng, thậm chí cả năm, trên các bề mặt, trong đất, và chống chịu được nhiều loại thuốc sát trùng thông thường. Điều này khiến việc tiêu độc, khử trùng chuồng trại và khu vực nuôi nhốt trở nên vô cùng khó khăn, tạo ra nguồn lây nhiễm tiềm tàng. Cuối cùng, nhận thức của người nuôi chó về tầm quan trọng của việc tiêm phòng, cách ly và vệ sinh phòng dịch chưa cao cũng là một rào cản lớn. Việc thiếu một chương trình giám sát dịch tễ học phân tử Parvovirus quốc gia khiến việc theo dõi sự lưu hành của CPV-2 tại miền Bắc và các khu vực khác gặp nhiều khó khăn, làm chậm quá trình cập nhật và cải tiến chiến lược phòng bệnh.

2.1. Sự tiến hóa của virus và nguy cơ thất bại của vắc xin

Sự biến đổi kháng nguyên là thách thức lớn nhất trong việc kiểm soát Parvovirus. Các đột biến điểm trên gen mã hóa protein VP2 có thể làm thay đổi cấu trúc bề mặt của virus, khiến các kháng thể do vắc-xin tạo ra không còn nhận diện và trung hòa hiệu quả. Sự tiến hóa của virus Parvo là một quá trình tự nhiên, nhưng nó đòi hỏi các nhà sản xuất vắc-xin phải liên tục cập nhật chủng giống để đảm bảo khả năng bảo hộ. Việc thiếu các nghiên cứu về virus Parvo ở chó tại địa phương làm cho việc lựa chọn chủng vắc-xin phù hợp trở nên khó khăn.

2.2. Khó khăn trong chẩn đoán và phân biệt các chủng CPV

Chẩn đoán lâm sàng dựa trên triệu chứng như tiêu chảy ra máu, nôn mửa có thể nhầm lẫn với các bệnh đường ruột khác. Các test nhanh hiện nay chủ yếu phát hiện kháng nguyên chung của CPV mà không phân biệt được các biến thể (CPV-2a, 2b, hay 2c). Để xác định chính xác kiểu gen, cần đến các kỹ thuật phân tích di truyền CPV-2 như giải trình tự gen. Việc này rất quan trọng để theo dõi dịch tễ và đánh giá độc lực của các chủng CPV-2 khác nhau, nhưng hiện tại vẫn chưa được thực hiện một cách hệ thống tại Việt Nam.

2.3. Sức đề kháng cao của virus trong môi trường tự nhiên

Parvovirus là loại virus không có vỏ bọc, giúp chúng có sức đề kháng vượt trội với các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH và nhiều chất sát trùng. Virus có thể tồn tại trên quần áo, giày dép, dụng cụ chăn nuôi và trong phân đến hơn 6 tháng. Điều này giải thích tại sao bệnh có thể bùng phát ngay cả ở những nơi không có sự tiếp xúc trực tiếp giữa các cá thể chó. Việc kiểm soát lây nhiễm đòi hỏi các biện pháp vệ sinh nghiêm ngặt và sử dụng các chất sát trùng chuyên dụng có khả năng tiêu diệt Parvovirus.

III. Phương pháp phân lập virus Parvo từ mẫu bệnh phẩm thực địa

Để nghiên cứu sâu về đặc tính sinh học của các chủng Parvovirus đang lưu hành, bước đầu tiên và quan trọng nhất là phân lập virus Parvo từ mẫu bệnh phẩm. Quy trình này đòi hỏi sự tỉ mỉ và tuân thủ các điều kiện vô trùng nghiêm ngặt. Nghiên cứu của Kham Ning Bun Pha Xay (2019) đã thực hiện một quy trình chuẩn hóa để phân lập thành công các chủng CPV tại miền Bắc Việt Nam. Đầu tiên, các mẫu bệnh phẩm, chủ yếu là mẫu phân từ những con chó có triệu chứng lâm sàng điển hình (tiêu chảy cấp, nôn mửa) và có kết quả dương tính với test nhanh CPV, được thu thập. Các mẫu này sau đó được xử lý để tạo thành huyễn dịch. Huyễn dịch này được ly tâm và lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,22 μm để loại bỏ vi khuẩn và các tạp chất khác. Virus tinh sạch sau đó được gây nhiễm lên môi trường nuôi cấy tế bào. Dòng tế bào được lựa chọn là CRFK (Crandell Rees Feline Kidney), một dòng tế bào thận mèo rất nhạy cảm và thích hợp cho sự nhân lên của Parvovirus. Quá trình gây nhiễm được theo dõi hàng ngày dưới kính hiển vi đảo ngược để quan sát hiệu ứng bệnh lý tế bào (CPE - Cyto Pathogenic Effect), là dấu hiệu cho thấy virus đang nhân lên và phá hủy tế bào. Các dấu hiệu CPE đặc trưng bao gồm tế bào co tròn, bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy và chết đi. Quá trình cấy chuyền (passage) được thực hiện nhiều lần để tăng hàm lượng virus và thích nghi chúng với môi trường tế bào, từ đó thu được lượng virus đủ lớn cho các phân tích sâu hơn.

3.1. Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm từ chó nghi nhiễm

Việc thu thập mẫu bệnh phẩm đóng vai trò quyết định đến sự thành công của quá trình phân lập. Mẫu lý tưởng là phân tươi của chó đang trong giai đoạn cấp tính của bệnh, khi nồng độ virus thải ra ngoài là cao nhất. Các mẫu được thu thập tại các phòng khám thú y ở Hà Nội, Bắc Ninh, và Hải Dương. Sau khi thu thập, mẫu được bảo quản lạnh và vận chuyển về phòng thí nghiệm. Tại đây, mẫu được đồng nhất trong dung dịch đệm PBS có chứa kháng sinh để ức chế sự phát triển của vi khuẩn, sau đó tiến hành các bước xử lý như đã mô tả để chuẩn bị cho việc gây nhiễm tế bào.

3.2. Kỹ thuật nuôi cấy và gây nhiễm virus trên dòng tế bào CRFK

Tế bào CRFK được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) có bổ sung huyết thanh thai bò (FBS) và kháng sinh. Khi tế bào phát triển tạo thành một lớp đơn (monolayer) phủ kín bề mặt bình nuôi cấy, chúng sẵn sàng cho việc gây nhiễm. Huyễn dịch virus đã qua xử lý được nhỏ vào bình nuôi cấy và ủ trong điều kiện nhiệt độ 37°C, 5% CO2. Sau một thời gian hấp phụ, môi trường cũ được thay thế bằng môi trường duy trì có nồng độ FBS thấp hơn (2%) để thúc đẩy sự nhân lên của virus. Việc quan sát bệnh tích tế bào là chỉ số quan trọng để đánh giá sự thành công của việc phân lập.

IV. Cách xác định các đặc điểm phân tử của virus Parvo phân lập

Sau khi phân lập thành công, việc xác định đặc điểm phân tử của virus Parvo là bước tiếp theo để hiểu rõ bản chất của các chủng virus này. Phương pháp chính được sử dụng là Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) và giải trình tự gen. Đầu tiên, DNA của virus được tách chiết từ dịch nuôi cấy tế bào đã có dấu hiệu CPE. Kỹ thuật PCR được thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu nhắm vào vùng gen mã hóa protein vỏ VP2. Gen VP2 được lựa chọn vì đây là vùng gen chứa các vị trí quyết định kháng nguyên chính và là nơi xảy ra các đột biến quan trọng tạo ra các biến thể mới. Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose để kiểm tra kích thước và độ tinh sạch. Kết quả điện di cho thấy một vạch sáng ở kích thước mong muốn (khoảng 550 bp trong nghiên cứu của Kham Ning Bun Pha Xay) khẳng định sự hiện diện của gen CPV. Để đi sâu hơn vào phân tích di truyền CPV-2, các sản phẩm PCR này được gửi đi giải trình tự. Kết quả trình tự nucleotide thu được sẽ được so sánh với các trình tự tham chiếu của các chủng CPV-2, CPV-2a, 2b, và 2c đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế (GenBank). Dựa trên sự khác biệt về axit amin tại các vị trí quan trọng, như vị trí 426 của protein VP2, có thể xác định chính xác biến thể của chủng virus phân lập. Ngoài ra, từ dữ liệu trình tự, có thể xây dựng cây phả hệ di truyền CPV-2 để xác định mối quan hệ tiến hóa giữa chủng virus Việt Nam và các chủng khác trên thế giới.

4.1. Ứng dụng PCR để khuếch đại gen mã hóa protein capsid VP2

PCR là một công cụ không thể thiếu trong nghiên cứu virus học phân tử. Bằng cách sử dụng cặp mồi đặc hiệu 555forc/555revc, nghiên cứu đã khuếch đại thành công một đoạn gen VP2. Phản ứng này không chỉ dùng để xác nhận sự có mặt của virus trong mẫu phân lập mà còn là bước chuẩn bị DNA cho việc giải trình tự. Độ nhạy và độ đặc hiệu cao của PCR cho phép phát hiện virus ngay cả khi nồng độ của chúng rất thấp, giúp khẳng định kết quả phân lập một cách chắc chắn.

4.2. Giải trình tự gen và xây dựng cây phả hệ di truyền

Giải trình tự gen là "tiêu chuẩn vàng" để định danh và phân loại virus. Dữ liệu trình tự cho phép xác định các đột biến điểm, từ đó phân loại chủng virus là 2a, 2b hay 2c. Xây dựng cây phả hệ di truyền CPV-2 bằng các phần mềm tin sinh học (như MEGA) giúp hình dung mối quan hệ di truyền giữa các chủng. Phân tích này có thể tiết lộ nguồn gốc, đường lây truyền và tốc độ tiến hóa của virus trong một khu vực địa lý nhất định, cung cấp thông tin quý giá cho công tác dịch tễ học phân tử Parvovirus.

V. Kết quả về đặc tính sinh học của Parvovirus tại miền Bắc

Nghiên cứu của Kham Ning Bun Pha Xay (2019) đã cung cấp những kết quả quan trọng về đặc tính sinh học của các chủng Parvovirus đang lưu hành tại miền Bắc Việt Nam. Từ 40 mẫu bệnh phẩm dương tính ban đầu, nghiên cứu đã phân lập virus Parvo từ mẫu bệnh phẩm thành công 4 chủng, được đặt tên là VNUA-C17, VNUA-C31, VNUA-C32 và VNUA-C35. Tất cả 4 chủng này đều cho thấy khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) rõ rệt trên dòng tế bào CRFK sau 2 đến 3 đời cấy chuyền. Bệnh tích đặc trưng là tế bào co lại, tròn và bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy, quá trình này diễn ra mạnh mẽ nhất trong khoảng 60-72 giờ sau khi gây nhiễm. Việc xác định đường cong tăng trưởng cho thấy virus nhân lên rất nhanh trong tế bào chủ, đạt hiệu giá cao nhất ở thời điểm 72 giờ. Cụ thể, hiệu giá virus (đo bằng TCID50/ml) của chủng VNUA-C32 đạt mức cao nhất (log TCID50 là 4,16), cho thấy độc lực của các chủng CPV-2 này khá cao. Các chủng còn lại cũng đạt hiệu giá đáng kể, dao động từ 3,5 đến 3,83. Những kết quả này không chỉ khẳng định sự lưu hành của CPV-2 tại miền Bắc mà còn cung cấp những chủng virus thực địa có tiềm năng lớn. Các chủng này có thể được sử dụng làm giống gốc để sản xuất vắc-xin thế hệ mới, chế tạo bộ kit chẩn đoán nhạy hơn hoặc làm kháng nguyên chuẩn trong các xét nghiệm huyết thanh học. Đây là một bước tiến quan trọng, tạo tiền đề cho việc tự chủ sản xuất các sản phẩm sinh học phòng chống bệnh Parvovirus tại Việt Nam.

5.1. Khả năng gây bệnh tích tế bào CPE trên dòng CRFK

Khả năng gây CPE là một đặc tính sinh học cơ bản của virus. Cả 4 chủng phân lập được đều gây ra bệnh tích điển hình trên tế bào CRFK. Sự phá hủy tế bào bắt đầu xuất hiện sau khoảng 48 giờ và đạt đỉnh điểm sau 72 giờ. Mức độ phá hủy tế bào tương quan với hiệu giá virus, cho thấy đây là những chủng virus có khả năng nhân lên mạnh mẽ trong điều kiện in vitro. Đặc tính này rất quan trọng đối với việc sản xuất vắc-xin, vì nó cho phép tạo ra một lượng lớn kháng nguyên virus trong thời gian ngắn.

5.2. Đường cong tăng trưởng và hiệu giá của các chủng virus

Đường cong tăng trưởng mô tả động học nhân lên của virus theo thời gian. Kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng Parvovirus phân lập tại miền Bắc có chu kỳ nhân lên nhanh. Virus xâm nhập vào tế bào và bắt đầu sao chép, đạt nồng độ tối đa trong tế bào vào khoảng 60-72 giờ sau khi nhiễm. Sau thời điểm này, virus được giải phóng ồ ạt ra môi trường, gây phá hủy tế bào và nồng độ virus trong tế bào bắt đầu giảm dần. Việc xác định được thời điểm thu hoạch virus tối ưu này có ý nghĩa thực tiễn rất lớn trong quy trình sản xuất kháng nguyên.

VI. Hướng đi tương lai trong phòng chống bệnh Parvovirus ở chó

Dựa trên các kết quả nghiên cứu về đặc tính sinh học và phân tử của Canine Parvovirus tại Bắc Việt Nam, có thể vạch ra một số hướng đi chiến lược cho tương lai. Trước hết, cần tiếp tục và mở rộng các chương trình giám sát dịch tễ học phân tử Parvovirus trên quy mô toàn quốc. Việc này sẽ giúp theo dõi liên tục sự tiến hóa của virus Parvo, phát hiện sớm sự xuất hiện của các biến thể mới và đánh giá sự phù hợp của các chủng vắc-xin đang được sử dụng. Thứ hai, các chủng virus thực địa đã được phân lập như VNUA-C17, VNUA-C31, C32 và C35 cần được nghiên cứu sâu hơn về tính kháng nguyên của virus Parvo và khả năng gây đáp ứng miễn dịch bảo hộ. Đây là những ứng cử viên sáng giá để phát triển vắc-xin "made in Vietnam", đảm bảo hiệu quả bảo hộ cao trước các chủng virus đang thực sự lưu hành tại địa phương. Việc tự chủ sản xuất vắc-xin không chỉ giúp giảm giá thành mà còn tăng tính chủ động trong công tác phòng chống dịch bệnh. Bên cạnh đó, cần phát triển và phổ biến các phương pháp chẩn đoán phân tử nhanh, chính xác và giá thành hợp lý, có khả năng phân biệt các biến thể CPV. Điều này sẽ hỗ trợ các bác sĩ thú y đưa ra chẩn đoán sớm và chính xác, từ đó có phác đồ điều trị kịp thời và hiệu quả. Cuối cùng, việc nâng cao nhận thức cho cộng đồng người nuôi chó về lịch trình tiêm phòng, các biện pháp an toàn sinh học và vệ sinh chuồng trại là yếu tố không thể thiếu để giảm thiểu sự lây lan của virus trong cộng đồng.

6.1. Phát triển vắc xin thế hệ mới từ các chủng virus địa phương

Sử dụng các chủng virus phân lập tại địa phương để sản xuất vắc-xin là hướng đi đã được chứng minh hiệu quả trên thế giới. Các chủng này mang đặc điểm kháng nguyên tương đồng nhất với các chủng đang gây bệnh, do đó vắc-xin tạo ra sẽ có khả năng trung hòa virus tốt hơn. Quá trình này bao gồm việc đánh giá độc lực, tính ổn định di truyền và khả năng sinh miễn dịch của các chủng virus ứng viên trên động vật thí nghiệm trước khi đưa vào sản xuất hàng loạt.

6.2. Xây dựng hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử quốc gia

Một hệ thống giám sát quốc gia sẽ thu thập mẫu bệnh phẩm từ nhiều vùng miền khác nhau, tiến hành phân tích di truyền CPV-2 một cách có hệ thống. Dữ liệu thu được sẽ tạo thành một bản đồ dịch tễ chi tiết, giúp dự báo các đợt bùng phát dịch, theo dõi sự lan truyền của các biến thể nguy hiểm và đưa ra các khuyến cáo kịp thời về việc sử dụng vắc-xin và các biện pháp kiểm soát. Đây là nền tảng cho một chiến lược phòng chống dịch bệnh chủ động và dựa trên bằng chứng khoa học.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh viêm ruột truyền nhiễm do Canine Parvovirus gây ra là một trong những nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tình trạng tử vong ở loài chó, đặc biệt là chó non dưới một năm tuổi với tỷ lệ chết ghi nhận trong thực tế dao động từ 50% đến 100%. Mặc dù virus này đã xuất hiện và lưu hành trên toàn cầu từ năm 1978, tình hình biến dị kháng nguyên liên tục của các phân tuýp mới đòi hỏi các nghiên cứu dịch tễ và sinh học phải được cập nhật thường xuyên. Tại Việt Nam, nguồn dữ liệu về đặc tính sinh học hoàn chỉnh của các chủng virus thực địa phục vụ cho công tác phòng và điều trị bệnh vẫn còn tương đối hạn chế.

Đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Thú y của tác giả Kham Ning Bun Pha Xay, dưới sự hướng dẫn khoa học của Giáo sư Nguyễn Thị Lan tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, được triển khai nhằm giải quyết trực tiếp vấn đề cấp bách này. Mục tiêu nghiên cứu cụ thể bao gồm việc thu thập bệnh phẩm lâm sàng, phân lập thành công các chủng Canine Parvovirus đang lưu hành trên môi trường nuôi cấy tế bào thận mèo liên tục và xác định toàn diện các đặc tính sinh học cốt lõi như khả năng gây bệnh tích tế bào, hiệu giá virus và đường cong sinh trưởng.

Nghiên cứu được thực hiện trong khung thời gian từ tháng 9 năm 2018 đến tháng 9 năm 2019 với quy mô khảo sát trên 40 cá thể chó nghi nhiễm tại ba địa bàn trọng điểm phía Bắc gồm Hà Nội, Bắc Ninh và Hải Dương. Kết quả của công trình mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, cung cấp nguồn giống virus gốc đã được định danh chính xác để làm tiền đề cho việc sản xuất vắc-xin vô hoạt nội địa, chế tạo kháng nguyên chẩn đoán và hoàn thiện ngân hàng gen vi sinh vật thú y quốc gia.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng của hai khung lý thuyết chuyên ngành chính: lý thuyết chu kỳ nhân lên của virus đơn sợi DNA không vỏ bọc trong tế bào động vật và lý thuyết cơ chế sinh bệnh học đường tiêu hóa - miễn dịch học thú y.

Về mặt cấu trúc, Canine Parvovirus thuộc họ Parvoviridae, sở hữu hệ gen DNA chuỗi đơn kích thước khoảng 5.323 nucleotide, mã hóa cho hai protein cấu trúc chính là VP1 và VP2 cùng hai protein phi cấu trúc là NS1 và NS2. Trong đó, protein capsid VP2 chiếm tới 90% thành phần vỏ và quyết định tính kháng nguyên đặc hiệu của virus qua các biến thể dịch tễ như CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c. Theo nguyên lý bệnh học, virus có ái lực đặc biệt với các tế bào đang phân chia nhanh, trực tiếp tấn công vào hệ thống hạch lympho, tủy xương và các tế bào biểu mô nếp nhung mao ruột non. Quá trình này dẫn đến hiện tượng suy giảm bạch cầu nghiêm trọng, hoại tử niêm mạc ruột non và gây hội chứng viêm ruột xuất huyết cấp tính kết hợp viêm cơ tim ở chó non.

Bên cạnh đó, đề tài vận dụng các khái niệm kỹ thuật cốt lõi trong vi sinh vật học bao gồm hiệu ứng bệnh tích tế bào, đơn vị liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy và phản ứng chuỗi polymerase khuếch đại gen.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu nghiên cứu được thu thập từ 40 mẫu bệnh phẩm phân và dịch trực tràng của chó có biểu hiện viêm ruột tiêu chảy tại các phòng khám thú y trên địa bàn Hà Nội (14 mẫu), Bắc Ninh (15 mẫu) và Hải Dương (11 mẫu) theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện có chủ đích. Cỡ mẫu 40 ca bệnh bảo đảm tính đại diện cho các ổ dịch thực địa tại miền Bắc.

Quy trình phân tích trong phòng thí nghiệm được thực hiện theo các bước chuẩn hóa nghiêm ngặt:

• Bước đầu, toàn bộ 40 mẫu được sàng lọc nhanh bằng kit kháng nguyên sắc ký miễn dịch có độ nhạy trên 99% và độ đặc hiệu trên 98%.
• Tách chiết DNA tổng số bằng bộ hóa chất chuyên dụng và tiến hành phản ứng khuếch đại gen PCR với cặp mồi đặc hiệu phân đoạn gen VP2 kích thước 550 cặp base.
• Tiến hành mổ khám 10 ca bệnh tử vong để ghi nhận bệnh tích đại thể ở các cơ quan nội tạng.
• Toàn bộ mẫu dương tính được xử lý đồng nhất và gây nhiễm qua 3 đời cấy truyền trên dòng tế bào thận mèo liên tục CRFK nuôi trong môi trường dinh dưỡng bổ sung huyết thanh thai bò từ 2% đến 10%. Dòng tế bào này được lựa chọn vì tính cảm nhiễm cao và khả năng biểu hiện bệnh tích tế bào rõ nét nhất đối với Parvovirus.
• Hiệu giá virus được xác định theo phương pháp tính toán chuẩn của Reed-Muench trên đĩa nuôi cấy 96 giếng.
• Toàn bộ số liệu thực nghiệm được thu thập trong giai đoạn từ tháng 9 năm 2018 đến tháng 9 năm 2019 và xử lý bằng các công cụ thống kê sinh học trên phần mềm vi tính.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận những kết quả thực nghiệm nổi bật với hệ thống số liệu định lượng chi tiết:

Thứ nhất, kết quả kiểm tra lâm sàng và cận lâm sàng cho thấy 100% mẫu khảo sát (40/40 mẫu) dương tính đồng thời với cả xét nghiệm nhanh kháng nguyên và phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen VP2 đặc trưng 550 cặp base. Khảo sát triệu chứng lâm sàng ghi nhận trạng thái ủ rũ mệt mỏi xuất hiện ở 100% số chó bệnh (40/40 con), hiện tượng ỉa chảy phân lẫn máu có mùi tanh khắm đặc trưng chiếm tỷ lệ 90,0% (36/40 con), sốt cao trên 39 độ C chiếm 80,0% (32/40 con) với nhiệt độ thân nhiệt trung bình đo được là 39,75 độ C (cao hơn 1,35 độ C so với mức sinh lý bình thường), triệu chứng nôn mửa chiếm 80,0% và bỏ ăn chiếm 75,0%.

Thứ hai, kết quả mổ khám bệnh tích đại thể trên 10 ca bệnh cho thấy tỷ lệ tổn thương tập trung cao nhất tại đường tiêu hóa và hệ lympho. Cụ thể, 100% số ca (10/10 con) bị xuất huyết, sung huyết và đầy hơi ở ruột, sung huyết dạ dày và sưng to xuất huyết hạch màng treo ruột. Tổn thương biến dạng và hoại tử vùng rìa lách chiếm 80,0% (8/10 con), gan sưng vàng và ứ mật chiếm 80,0%, trong khi bệnh tích giãn tim và xuất huyết cơ tim chiếm 60,0% (6/10 con).

Thứ ba, hiệu quả phân lập virus trên tế bào CRFK qua 3 đời cấy truyền đã thu nhận được 4 chủng virus thực địa có khả năng gây bệnh tích tế bào rõ rệt (chiếm tỷ lệ 10,0% tổng số mẫu), bao gồm: VNUA-C17 (phân lập từ chó Becgie Bỉ 5 tháng tuổi tại Hà Nội), VNUA-C31 (từ chó Bắc Kinh lai Nhật 4 tháng tuổi tại Hải Dương), VNUA-C32 (từ chó nội 4 tháng tuổi tại Hải Dương) và VNUA-C35 (từ chó Poodle 9 tháng tuổi tại Bắc Ninh). Ở đời cấy truyền thứ nhất, tế bào chưa xuất hiện bệnh tích, nhưng từ đời thứ hai và thứ ba, các chủng virus này đã phá hủy mạnh mẽ lớp tế bào nuôi cấy, làm tế bào teo tròn, co cụm và bong tróc hoàn toàn khỏi đáy bình nuôi.

Thứ tư, xác định quy luật sinh trưởng cho thấy cả 4 chủng virus đều nhân lên rất nhanh bên trong tế bào và đạt đỉnh sinh trưởng cao nhất trong khoảng thời gian từ 60 đến 72 giờ sau khi gây nhiễm. Tại thời điểm cực đại, hiệu giá virus nội bào đạt giá trị rất cao: chủng VNUA-C32 đạt 4,16 log TCID50/ml; hai chủng VNUA-C17 và VNUA-C35 đạt 3,83 log TCID50/ml; chủng VNUA-C31 đạt 3,50 log TCID50/ml. Sau mốc 72 giờ, hàm lượng virus nội bào giảm dần và giải phóng ra môi trường ngoài, đến thời điểm 96 giờ hiệu giá nội bào chỉ còn dao động trong khoảng từ 2,50 đến 3,83 log TCID50/ml.

Thảo luận kết quả

Các kết quả thực nghiệm giải thích rõ cơ chế xâm nhập và hủy hoại tế bào của Canine Parvovirus tại các mô có tốc độ phân bào cao. Việc nhiệt độ cơ thể chó bệnh tăng trung bình thêm 1,35 độ C là phản ứng miễn dịch tự nhiên của cơ thể nhằm ức chế sự nhân lên của mầm bệnh, song độc tố và phản ứng viêm toàn thân đã gây rối loạn trung khu điều nhiệt. Bệnh tích đại thể ghi nhận tỷ lệ xuất huyết ruột 100% hoàn toàn phù hợp với cơ chế virus phá hủy tế bào biểu mô liên kết, khiến niêm mạc ruột bị bong tróc, tạo cửa ngõ cho vi khuẩn kế phát xâm nhập gây nhiễm trùng huyết.

Hiện tượng tế bào CRFK không xuất hiện bệnh tích ở đời cấy truyền thứ nhất nhưng lại biểu hiện hoại tử mạnh ở đời thứ hai và thứ ba minh chứng cho quá trình thích ứng dần của virus thực địa với môi trường ống nghiệm. Diễn biến động thái phát triển của virus theo thời gian có thể được mô tả trực quan qua biểu đồ đường cong sinh trưởng: trục hoành thể hiện các mốc thời gian từ 0 đến 96 giờ, trục tung biểu thị giá trị hiệu giá log TCID50/ml. Biểu đồ này phản ánh rõ nét hai giai đoạn: pha tăng trưởng lũy thừa từ 24 đến 72 giờ với đỉnh cực đại ở 60-72 giờ, sau đó chuyển sang pha suy giảm do cạn kiệt tế bào cảm thụ. Dữ liệu này tương đồng với các nghiên cứu vi sinh thú y quốc tế và cung cấp bằng chứng thực nghiệm quan trọng để xác định chính xác thời điểm thu hoạch kháng nguyên tối ưu trong sản xuất.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả nghiên cứu sinh học đạt được, tác giả đưa ra 4 nhóm giải pháp hành động cụ thể nhằm nâng cao hiệu quả phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh:

1. Tuyển chọn và lưu trữ nguồn giống gốc chuẩn: Đề nghị Học viện Nông nghiệp Việt Nam cùng các viện nghiên cứu chuyên ngành lựa chọn chủng virus thực địa VNUA-C32 (sở hữu hiệu giá cao nhất đạt 4,16 log TCID50/ml) làm chủng giống virus chuẩn phục vụ cho các nghiên cứu sản xuất vắc-xin vô hoạt phòng bệnh trong nước. Hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu trữ chủng giống vào ngân hàng gen vi sinh vật quốc gia trong vòng 6 tháng tới.

2. Chuẩn hóa quy trình thu hoạch kháng nguyên: Các đơn vị nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học thú y cần áp dụng quy trình nuôi cấy trên dòng tế bào CRFK và ấn định mốc thời gian thu hoạch virus tối ưu tại thời điểm 60 đến 72 giờ sau gây nhiễm. Giải pháp này giúp đảm bảo hiệu giá sinh học đạt trên 3,80 log TCID50/ml và tối ưu hóa năng suất sản xuất kháng nguyên.

3. Ứng dụng kháng nguyên nội địa vào chế tạo sinh phẩm chẩn đoán: Khuyến nghị các doanh nghiệp công nghệ sinh học thú y phối hợp với phòng thí nghiệm chuyên sâu sử dụng nguồn kháng nguyên từ 4 chủng phân lập để sản xuất các bộ kit chẩn đoán nhanh và kit ELISA đạt độ nhạy trên 98%, triển khai thương mại hóa cho các cơ sở điều trị thú y trong giai đoạn 2020-2022.

4. Tăng cường kiểm soát an toàn sinh học tại các phòng khám thú y: Đề nghị Chi cục Thú y các địa phương và hệ thống bệnh viện thú y tư nhân thiết lập quy trình khử trùng khu vực cách ly bằng hóa chất chuyên dụng định kỳ 2 lần mỗi ngày, đồng thời thực hiện xét nghiệm kép (kit thử nhanh kết hợp PCR) cho 100% chó có biểu hiện tiêu chảy xuất huyết nhằm giảm thiểu tỷ lệ lây nhiễm chéo tại cơ sở điều trị xuống dưới 5%.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu này mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Bác sĩ thú y lâm sàng tại các bệnh viện và phòng khám thú cưng: Tài liệu cung cấp cơ sở dữ liệu chi tiết về 90% triệu chứng phân lẫn máu và 100% bệnh tích đường tiêu hóa, hỗ trợ bác sĩ chẩn đoán phân biệt chính xác bệnh do Parvovirus với các bệnh truyền nhiễm khác như Care hay Coronavirus để đưa ra phác đồ điều trị kịp thời.

2. Các nhà khoa học và nghiên cứu viên chuyên ngành Vi sinh vật học - Bệnh lý thú y: Luận văn cung cấp quy trình phân lập chi tiết qua 3 đời cấy truyền trên tế bào CRFK, kỹ thuật chạy PCR nhân đoạn gen VP2 kích thước 550 cặp base và phương pháp chuẩn hóa xác định hiệu giá sinh học theo Reed-Muench.

3. Doanh nghiệp và chuyên gia phát triển vắc-xin sinh phẩm thú y: Đơn vị sản xuất có thể tham khảo quy luật sinh trưởng đạt đỉnh ở 60-72 giờ và đặc tính sinh học của 4 chủng virus phân lập để làm nguồn nguyên liệu đầu vào cho việc sản xuất vắc-xin vô hoạt tương thích với các chủng virus đang lưu hành thực địa.

4. Giảng viên, học viên cao học và sinh viên ngành Thú y: Đây là tài liệu tham khảo chuẩn mực trong việc xây dựng đề cương nghiên cứu, thiết kế thí nghiệm mổ khám bệnh tích đại thể và phân tích số liệu dịch tễ học thú y.

Câu hỏi thường gặp

1. Tỷ lệ nhiễm Canine Parvovirus và mức độ nguy hiểm của bệnh trên đàn chó hiện nay ra sao? Bệnh do Canine Parvovirus là bệnh truyền nhiễm cấp tính cực kỳ nguy hiểm, có tỷ lệ mắc bệnh thực địa khoảng 40% đến 50% và tỷ lệ tử vong ở chó non chưa tiêm phòng lên tới 80% - 100%. Trong nghiên cứu này, 100% mẫu khảo sát đều cho kết quả dương tính với các triệu chứng lâm sàng trầm trọng như ỉa chảy lẫn máu (90%) và sốt cao trên 39 độ C (80%).

2. Tại sao dòng tế bào CRFK lại được lựa chọn để phân lập Canine Parvovirus? Dòng tế bào thận mèo liên tục CRFK là môi trường nuôi cấy nhân tạo thích hợp nhất đối với Canine Parvovirus nhờ khả năng phân chia nhanh và mức độ cảm nhiễm cao. Tế bào CRFK cho phép virus nhân lên mạnh mẽ và thể hiện rõ hiệu ứng bệnh tích tế bào như co tròn, tạo hạt và bong tróc bề mặt nuôi cấy sau 2 đến 3 đời cấy truyền.

3. Thời điểm nào thích hợp nhất để thu hoạch virus Parvo đạt nồng độ kháng nguyên cao nhất? Theo kết quả xác định đường cong sinh trưởng, nồng độ virus bên trong tế bào CRFK đạt mức cực đại vào thời điểm từ 60 đến 72 giờ sau khi gây nhiễm. Tại thời điểm này, hiệu giá sinh học của chủng VNUA-C32 đạt tới 4,16 log TCID50/ml trước khi tế bào bị hoại tử hoàn toàn và hàm lượng virus bắt đầu suy giảm.

4. Kỹ thuật PCR sử dụng trong nghiên cứu này có đặc điểm gì nổi bật? Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu hướng tới vùng gen VP2 của virus, khuếch đại thành công phân đoạn DNA kích thước chính xác 550 cặp base. Phương pháp này có độ nhạy trên 99% và độ đặc hiệu trên 98%, giúp chẩn đoán khẳng định sự hiện diện của virus nhanh chóng và chuẩn xác hơn so với phương pháp nuôi cấy truyền thống.

5. Đóng góp thực tiễn lớn nhất của 4 chủng virus phân lập được trong đề tài là gì? Bốn chủng virus phân lập được (VNUA-C17, VNUA-C31, VNUA-C32, VNUA-C35) đóng vai trò là nguồn vật liệu sinh học gốc quý giá. Chúng cung cấp nguồn kháng nguyên thực địa tương thích hoàn toàn với dịch tễ Việt Nam, phục vụ trực tiếp cho việc chế tạo bộ kit xét nghiệm chẩn đoán và nghiên cứu sản xuất vắc-xin vô hoạt phòng bệnh hiệu quả.

Kết luận

• Công trình đã thu thập 40 mẫu bệnh phẩm tại Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Dương và xác định tỷ lệ dương tính với Canine Parvovirus đạt 100% qua xét nghiệm nhanh và kỹ thuật PCR đoạn gen 550 cặp base.
• Ghi nhận đầy đủ đặc điểm bệnh lý với 90,0% ca bệnh ỉa chảy lẫn máu, thân nhiệt trung bình sốt 39,75 độ C và 100% ca mổ khám có tổn thương xuất huyết đường ruột và hạch màng treo.
• Phân lập thành công 4 chủng virus thực địa có khả năng gây bệnh tích tế bào đặc trưng trên dòng tế bào CRFK ở đời cấy truyền thứ hai và thứ ba.
• Xác định quy luật động thái sinh trưởng của virus đạt đỉnh cực đại tại thời điểm 60 đến 72 giờ sau gây nhiễm với hiệu giá cao nhất đạt 4,16 log TCID50/ml ở chủng VNUA-C32.
• Đóng góp nguồn dữ liệu khoa học nền tảng và bộ giống virus gốc phục vụ việc thiết lập ngân hàng nguồn gen vi sinh vật thú y và phát triển vắc-xin trong nước.

Trong giai đoạn tiếp theo, các đơn vị nghiên cứu cần tiến hành giải trình tự toàn bộ gen vỏ VP2 của các chủng phân lập trong vòng 6 tháng và bước vào giai đoạn thử nghiệm vô hoạt sản xuất vắc-xin trong 12 tháng tới. Các viện nghiên cứu, doanh nghiệp dược thú y và cơ sở lâm sàng hãy cùng tăng cường hợp tác chuyển giao công nghệ để sớm đưa các chế phẩm sinh học phòng trị bệnh Parvovirus vào ứng dụng thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

đặt vấn đề thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học canine parvovirus (CPV) phân lập được ở phía bắc Việt Nam”. Nhằm nghiên cứu quy trình phân lập Parvovirus; làm rõ đặc tính gây bệnh tích tế bào, thời gian sinh trưởng của các chủng Parvovirus phân lập từ thực địa trên môi trường tế bào thích hợp. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần làm cơ sở cho việc chọn chủng Parvovirus có đặc tính sinh học phù hợp dùng để chế tạo kit chẩn đoán, chế tạo kháng nguyên dùng trong chẩn đoán, chế phẩm sinh học ứng dụng trong điều trị và phát triển vacxin phòng bệnh hiệu quả. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1.

Mục tiêu chung - Phân lập được các chủng Parvovirus gây bệnh cho chó tại một số tỉnh phía Bắc trên môi trường tế bào, xác định được các đặc tính sinh học của các chủng Parvovirus. Mục tiêu cụ thể - Phân lập được các chủng Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK. - Xác định được đặc tính sinh học (khả năng gây bệnh tích tế bào, hiệu giá virus và đường cong sinh trưởng) của các chủng Parvovirus gây bệnh cho chó. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.

Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong nghiên cứu về bệnh do Parvovirus ở chó trong viện nghiên cứu, các trường có chuyên ngành thú y. Đây cũng là tư liệu khoa học cần thiết cho những người làm công tác thú y cơ sở về bệnh do Parvovirus. Đồng thời, thông tin chi tiết của các chủng giống Parvo virus phân lập được có ý nghĩa trong việc xây dựng ngân hàng hồ sơ chủng giống gốc, phục vụ cho các bước đăng ký chủng giống với ngân hàng bảo tồn nguồn gen quốc gia. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đã thu thập, sàng lọc và đánh giá các đặc tính sinh học của chủng 2 Parvovirus đang gây bệnh tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam.

Chủng Parvovirus phân lập được có tiềm năng cho chọn giống để sản xuất vacxin hoặc chế tạo Kit, làm kháng nguyên cho chẩn đoán hoặc làm giống để công cường độc đánh giá hiệu quả bảo hộ và kiểm nghiệm vacxin. Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề giúp thúc đẩy các nghiên cứu phát triển sản xuất vacxin trong nước từ chính các chủng virus đang lưu hành tại thực địa, từ đó nâng cao hiệu quả phòng bệnh. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PARVOVIRUS GÂY RA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM Bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus (Canine Parvovirus type 2 - CPV 2) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của loài chó có tỉ lệ chết cao.

Biểu hiện lâm sàng đặc trưng là hiện tượng viêm dạ dày ruột có xuất huyết. Bệnh xảy ra khắp nơi trên thế giới trong đó có Việt Nam. Bệnh hay xảy ra với các giống chó: Bergie, Labrador, Rottweiler, Dorberman, Yorshire terriers,. Tình hình nghiên cứu bệnh do Parvovirus gây ra trên thế giới Đầu năm 1970, CPV 2 được phát hiện trên chó con với các triệu chứng bệnh tích như sốt cao, nôn mửa, tiêu chảy, phân lỏng lẫn máu, viêm dạ dày, viêm cơ tim,.

Bệnh thường xảy ra ở dạng dịch địa phương hoặc nhiều ổ dịch xảy ra cùng một lúc. Bệnh xuất hiện vào mùa thu năm 1977 ở Texas và đến mùa hè năm 1978 đã xảy ra nhiều vùng khác nhau ở Hoa Kỳ và Canada. Đầu năm 1979, bệnh đã xuất hiện ở Úc, Bỉ, Hà Lan, Anh và Pháp. Theo các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả, tỷ lệ chó nhiễm CPV 2 là khác nhau ở các quốc gia, như báo cáo về tình hình chó bị nhiễm Parvovirus tại Nigeria là 40,00% (Chollom et al., 2013), tại Hungary là 84,00% (Csagola et al.

Kết quả nghiên cứu gần đây của Kaur et al. (2015) về tỷ lệ nhiễm CPV 2 theo lứa tuổi chó, khi sử dụng kỹ thuật Nested PCR (Polymerase Chain Reaction) chẩn đoán bệnh CPV 2 cho thấy, tỷ lệ nhiễm CPV 2 trên chó từ 0 đến 3 tháng tuổi là 60,00%, 3 đến 6 tháng tuổi là 30,00%, 6 đến 9 tháng tuổi là 24,00%, trên 9 tháng tuổi là 6,00%. Theo các nghiên cứu cho thấy CPV-2 là một virus sợi đơn DNA, không có vỏ bọc, kích thước khoảng 5.2kp, bao gồm 2 khung đọc mở chính, một khung là mã hóa 2 capsid protein [VP1] và [VP2] và một khung là mã hóa 2 protein không cấu trúc [NS1] và [NS2]. Sau đó, một loại Parvovirus mới đã được phân lập trong nuôi cấy tế bào (Burtonboy et al.,1979; Johnson and Spradbrow, 1979;Kelly, 1978).

Loại virus này được đặt tên là Canine Parvovirus loại 2 (CPV-2), để phân biệt nó với mô tả trước Parvovirus Canine Munite Virus (CMV hoặc CPV-1), đó là kháng nguyên không liên quan đến CPV-2 (Carmichael and 4 Binn, 1981). Trong năm 1979 và 1980, một biến thể kháng nguyên của CPV được xác định ở một vài quốc gia khác bằng việc sử dụng Monoclonal antibodies (MAbs) và biến thể được cho là CPV loại 2a (Parrish, 1991). Giữa năm 1980, virus thêm một biến đổi kháng nguyên, và biến thể mới này được gọi là CPV loại 2b (Parrish, 1991). Hiện nay, biến thể kháng nguyên của CPV đã thay thế hoàn toàn CPV-2 trước đó và được phân bố đa dạng ở khắp các loài chó trên toàn thế giới (Allen and 1998; D.

Buonavoglia et al., 2000; Mochizuki Harasawa, andNakatani, 1993; Steinel et al. Hai biến thể kháng nguyên, CPV-2a và CPV-2b, hiện đang được phân phối trên toàn thế giới (Truyen U. Biến thể CPV thứ ba, có vị trí axit amin Glu-426 đột biến và sau đó được đặt tên thành CPV-2c, đã được phát hiện tại Ý năm 2000 (C. Buonavoglia et al., 2001) và hiện đang lưu hành tại nước đó cùng với các loại 2a và 2b (Decaro et al., 2007; Martella et al.) Các biến thể mới 2c cũng đã được báo cáo trong Việt Nam bởi Nakamura et al.

Tình hình dịch bệnh do Parvovirus gây ra tại Việt Nam Bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus đã được ghi nhận lần đầu tiên ở nước ta vào năm 1990 trên chó nghiệp vụ (Trần Ngọc Bích và cs. Ở Việt Nam, cũng như ở các quốc gia khác ở châu Á, các chủng CPV-2a và CPV-2b khá phổ biến từ những đợt bùng phát dịch đầu tiên. Bệnh được công bố lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1994. Chó ở mọi lứa tuổi đều nhạy cảm với bệnh, thông thường hầu hết các con trưởng thành đều có kháng thể, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong trên chó con từ 6- 12 tuần tuổi rất đáng kể do có sự huỷ bỏ kháng thể mẹ truyền.

Bệnh có khả năng lây lan nhanh. Tỷ lệ mắc bệnh có thể lên đến 50%, tỷ lệ tử vong trên chó con từ 50-100% (Trần Ngọc Bích và cs. Theo kết quả nghiên cứu gần đây nhất của Nguyễn Thị Yến Mai và cs. (2018) cho thấy tỷ lệ chó tiêu chảy phân lẫn máu do Parvovirus ở Tiền Giang, Đồng Tháp và Thành phố Cần Thơ là 30,00%; 34,00% và 30,00%.

Chó từ ở độ tuổi từ 1 đến 3 tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm bệnh cao ở cả ba tỉnh với tỷ lệ lần lượt là (60,00%; 58,82%; 60,00%) và khác biệt có ý nghĩa thống kê với chó ở độ tuổi >6 tháng tuổi ở cả 3 tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp và Thành phố Cần Thơ (6,67%; 5,88%; 0,00%). Chó được tiêm ngừa vacxin phòng bệnh thì tỷ lệ bệnh thấp hơn 5 so với chó không được tiêm ngừa vacxin ở 3 tỉnh là (6,67% so với 93,33%; 5,88% so với 94,12%; 13,33% so với 86,67%;). Hiệu quả điều trị bệnh Parvovirus trên chó ở tỉnh Tiền Giang và Thành phố Cần Thơ là tương đương nhau với tỷ lệ là 86,67% và 58,82%. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS 2.

Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen của Parvovirus Parvovirus thuộc họ Parvoviridae, giống Parvovirus, loài Canine Parvovirus. Cấu tạo của Parvovirus  Hình thái và cấu trúc: + Theo Phạm Sỹ Lăng và cs. Parvovirus ở mỗi loài động vật khác nhau là khác nhau. Chúng có kích thước 18– 24nm, nhân chứa DNA sợi đơn, không có vỏ bọc, bộ gen 5323 nucleotide.

+ Capsid có kích thước rất nhỏ (20nm), dạng khối đa diện, gồm 32 capsome với 60 tiểu đơn vị VP (viral protein) là VP1, VP2 (chiếm 90% tiểu đơn vị protein) (Reed, Jones, & Miller, 1988) + Lõi: DNA đơn, dạng thẳng. Hầu hết là DNA (-), ở hai đầu có đoạn palindrom (đoạn DNA mạch kép có trình tự nucleotide trên mỗi sợi giống nhau nhưng 6 trái chiều nhau) tạo thành các nút kẹp tóc, có một đầu 3’-OH thay cho mồi. Phân loại và phân bố các type Parvovirus Hình 2.2 Sự phân bố của CPV-2a\2b\2c trên thế giới https://www.gov/pmc/articles/PMC5376324/ Từ bản đồ sự phân bố của các chủng CPV-2a/2b/2c trên toàn thế giới ta có thể nhận thấy Parvovirus phân bố trên khắp thế giới với các chủng khác nhau. Cụ thể, chủng CPV-2a phân bố nhiều ở khu vực Châu Á và Nam Phi một phần ở vùng Nam Mỹ, chủng CPV-2b có thể thấy xuất hiện ở hầu hết các châu lục, riêng chủng CPV-2c thì tập trung nhiều ở châu Mỹ Latinh và Châu Âu.

7 Đến năm 1984 trở đi thì có thêm sự xuất hiện của chủng CPV-2b. Trong khoảng thời gian 1986-1996 thì chủng CPV-2a lưu hành phổ biến. Từ sau năm 1996 có thêm sự xuất hiện của chủng CPV-2c, chủng CPV-2b có xu hướng giảm, các chủng CPV-2a và CPV-2c đang thịnh hành trên thế giới (Zhou P. Tỷ lệ phần trăm và sự xuất hiện của các chủng CPV-2/CPV-2-like, CPV-2a, CPV-2b, và CPV-2c https://www.gov/pmc/articles/PMC5376324/ 2.

Sức đề kháng của Parvovirus Parvovirus đề kháng mạnh với môi trường bên ngoài. Trong phân thì virus có 8 thể tồn tại hơn 6 tháng ở nhiệt độ phòng. Nó đề kháng với tác động của ete, chloruaform, axit và nhiệt độ (56oC trong 30 phút). Dễ bị tiêu diệt bởi ánh sáng mặt trời, tồn tại kéo dài vào mùa đông (ôn đới).

Theo Tô Du và cs. (2006), virus có thể tồn tại 1 – 2 tuần ở nhiệt độ 15 – 25oC. Đặc tính nuôi cấy Virus chỉ nhân lên trong nhân tế bào và gây bệnh tích tế bào trên tế bào tim chó con còn bú hay trên tế bào ruột. Theo Tô Du và cs.

(2006), virus phát triển tốt trên môi trường tế bào thận chó, thận khỉ, chúng gây bệnh tích tế bào nên người ta thường phân lập virus từ nuôi cấy trên các môi trường này. Đặc tính kháng nguyên Sự nhân lên của Parvovirus ở chó làm xuất hiện kháng thể gây ức chế phản ứng ngưng kết hồng cầu và phản ứng trung hoà huyết thanh. Kháng thể ức chế phản ứng ngưng kết hồng cầu xuất hiện vào ngày thứ hai hoặc ngày thứ ba sau khi nhiễm. Phản ứng này được sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh học.

Phản ứng trung hoà huyết thanh rất khó thực hiện trong phòng thí nghiệm (Nguyễn Như Pho, 2003).