Luận văn chuẩn hoá phương pháp xác định hàm lượng vitamin d d2 và d3 trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc

Luận văn chuẩn hoá phương pháp xác định hàm lượng vitamin D2 và D3 trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, đảm bảo độ chính xác và hiệu quả.

• Tác giả: Ks. Đoàn Thị Hương
• Trường học: Viện Dinh Dưỡng Trung tâm Kiểm nghiệm VSATTP
• Chuyên ngành: Dinh dưỡng và Thực phẩm
• Đề tài: Chuẩn hóa phương pháp xác định hàm lượng vitamin D (D2 và D3) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
• Loại tài liệu: báo cáo kết quả nghiên cứu
• Năm xuất bản: 2007
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Danh mục các chữ viết tắt
• Danh mục các bảng
• Danh mục các hình
• 1. Phần 1: Mở đầu
• 2. Phần 2: Tổng quan
• 2.1. Nguồn gốc và tính chất của vitamin D
• 2.2. Tác dụng của vitamin D
• 2.3. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới
• 3. Phần 3: Mục tiêu, đối tượng và phương pháp nghiên cứu
• 3.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 3.4. Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao áp
• 3.5. Các phương pháp định lượng bằng HPLC
• 3.6. Quy trình phân tích thử nghiệm
• 4. Phần 4: Kết quả nghiên cứu
• 4.1. Khảo sát điều kiện chạy sắc ký
• 4.2. Xác định khoảng tuyến tính
• 4.5. Xác định độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên
• 4.6. Một số sắc đồ chạy sắc ký của mẫu phân tích
• 5. Phần 5: Nhận xét và bàn luận kết quả
• 6. Phần 6: Quy trình phân tích xác định hàm lượng vitamin D trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC
• Phần 7: Tài liệu tham khảo
• Phần phụ lục: Các sắc đồ của dung dịch chuẩn vitamin D2 và D3 xây dựng khoảng tuyến tính

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Vitamin D và tầm quan trọng trong thực phẩm

Vitamin D là một nhóm các chất dinh dưỡng thiết yếu, bao gồm Vitamin D2 và Vitamin D3, đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sức khỏe xương và hệ miễn dịch. Vitamin D2 (Ergocalciferol) thường có nguồn gốc từ thực vật, trong khi Vitamin D3 (Cholecalciferol) được tổng hợp từ ánh sáng mặt trời và có trong thực phẩm động vật. Việc xác định vitamin D trong thực phẩm là cần thiết để đảm bảo chất lượng thực phẩm và dinh dưỡng cho người tiêu dùng. Phương pháp HPLC (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) được coi là công cụ hiệu quả để phân tích hàm lượng vitamin trong thực phẩm.

1.1. Nguồn gốc và tính chất của Vitamin D

Vitamin D là chất tinh thể không màu, không mùi, không tan trong nước nhưng tan trong dầu mỡ và dung môi hữu cơ. Vitamin D2 và Vitamin D3 là hai dạng hoạt tính mạnh nhất, với cấu trúc hóa học khác nhau nhưng có hoạt tính sinh học tương tự. Vitamin D3 được tổng hợp từ 7-dehydrocholesterol dưới da khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, trong khi Vitamin D2 được tổng hợp từ ergosterol trong nấm và men bia.

1.2. Vai trò của Vitamin D trong dinh dưỡng

Vitamin D tham gia vào quá trình hấp thụ canxi và phốt pho, giúp duy trì sức khỏe xương và ngăn ngừa bệnh còi xương ở trẻ em và loãng xương ở người lớn. Thiếu Vitamin D có thể dẫn đến các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng như suy giảm miễn dịch và tăng nguy cơ mắc bệnh mãn tính. Việc bổ sung Vitamin D vào thực phẩm là một giải pháp hiệu quả để cải thiện dinh dưỡng và sức khỏe cộng đồng.

II. Phương pháp HPLC trong phân tích Vitamin D

HPLC là phương pháp phân tích hiện đại, được sử dụng rộng rãi để xác định vitamin D trong thực phẩm. Phương pháp này dựa trên nguyên lý tách các chất trong mẫu nhờ sự tương tác giữa pha tĩnh và pha động dưới áp suất cao. HPLC cho phép phân tích chính xác hàm lượng Vitamin D2 và Vitamin D3 với độ nhạy và độ lặp lại cao.

2.1. Nguyên lý và quy trình phân tích bằng HPLC

Phương pháp HPLC sử dụng cột sắc ký chứa pha tĩnh và pha động để tách các chất trong mẫu. Vitamin D được phát hiện bằng detector UV hoặc PDA, với bước sóng phù hợp để đo độ hấp thụ. Quy trình phân tích bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, chạy sắc ký và phân tích kết quả. Điều kiện chạy sắc ký như pha động, tốc độ dòng và nhiệt độ được tối ưu hóa để đạt hiệu quả phân tích cao nhất.

2.2. Ưu điểm của phương pháp HPLC

HPLC có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, khả năng phân tích đồng thời nhiều chất, và độ lặp lại tốt. Phương pháp này phù hợp để phân tích vitamin trong thực phẩm với hàm lượng thấp, đảm bảo chất lượng thực phẩm và tuân thủ các tiêu chuẩn quốc tế. Kết quả phân tích bằng HPLC cung cấp dữ liệu chính xác để đánh giá giá trị dinh dưỡng của sản phẩm.

III. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã chuẩn hóa phương pháp xác định Vitamin D2 và D3 trong thực phẩm bằng HPLC, với các kết quả đáng tin cậy về độ chính xác và độ lặp lại. Phương pháp này được áp dụng để phân tích hàm lượng Vitamin D trong các sản phẩm như sữa bột, sữa chua và bánh quy, đóng góp vào việc kiểm soát chất lượng thực phẩm và đảm bảo dinh dưỡng cho người tiêu dùng.

3.1. Kết quả phân tích hàm lượng Vitamin D

Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng Vitamin D2 và Vitamin D3 trong các mẫu thực phẩm với độ chính xác cao. Kết quả cho thấy sự khác biệt về hàm lượng Vitamin D giữa các sản phẩm, phản ánh sự đa dạng trong thành phần dinh dưỡng. Phương pháp HPLC đã chứng minh hiệu quả trong việc phân tích các mẫu phức tạp với độ thu hồi cao và hệ số biến thiên thấp.

3.2. Ứng dụng trong kiểm soát chất lượng thực phẩm

Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm để đánh giá chất lượng thực phẩm. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng quy trình phân tích chuẩn, đáp ứng yêu cầu của các tiêu chuẩn quốc tế như AOAC và TCVN. Việc áp dụng phương pháp này giúp nâng cao độ tin cậy trong việc kiểm soát vitamin trong thực phẩm, đảm bảo an toàn và giá trị dinh dưỡng cho người tiêu dùng.

Nội dung chính

Chuẩn Hóa Phương Pháp Xác Định Vitamin D2 và D3 Trong Thực Phẩm Bằng Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao (HPLC-DAD)

---

Tóm tắt nghiên cứu (200–250 từ)

• Vấn đề nghiên cứu chính: Làm thế nào để xây dựng và thẩm định một quy trình phân tích chuẩn xác, tin cậy và có tính ứng dụng cao nhằm định lượng đồng thời hai dạng vi chất sinh học quan trọng là Vitamin D2 (Ergocalciferol) và Vitamin D3 (Cholecalciferol) trong các ma trận thực phẩm phức tạp tại Việt Nam?
• Tổng quan phương pháp: Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) kết hợp đầu dò mảng đi-ốt quang phổ (DAD) ở bước sóng 265 nm. Quy trình xử lý mẫu kết hợp xà phòng hóa với dung dịch KOH trong môi trường ethanol cùng chất chống oxy hóa TBHQ, chiết bằng ete dầu hỏa và làm sạch qua cột chiết pha rắn (SPE Silica). Hệ pha động tối ưu hóa gồm Methanol : Tetrahydrofuran : Nước ($92:3:5$, $v/v/v$) trên cột tách Inertsil ODS-3 ($5,\mu\text{m}, 4.6 \times 250,\text{mm}$) với tốc độ dòng $1.5,\text{ml/phút}$.
• Phát hiện cốt lõi: Phương pháp đạt độ nhạy ở cấp độ vết với giới hạn phát hiện (LOD) đạt $2.2,\text{ppb}$ (D2) và $3.4,\text{ppb}$ (D3); giới hạn định lượng (LOQ) tương ứng là $7,\text{ppb}$ và $11,\text{ppb}$. Khoảng tuyến tính mở rộng từ $0.002$ đến $0.55,\text{ppm}$ ($R^2 > 0.99$). Độ lặp lại có hệ số biến thiên ($Cv%$) dao động từ $5.4%$ đến $7.3%$ và độ thu hồi ($R%$) đạt $75% - 90%$.
• Ý nghĩa thực tiễn: Quy trình cung cấp công cụ kiểm nghiệm tiêu chuẩn hóa phục vụ giám định chất lượng thực phẩm bổ sung, sữa và thực phẩm chức năng, hỗ trợ công tác quản lý an toàn thực phẩm và phòng chống thiếu hụt vi chất.

---

Bối cảnh và tầm quan trọng (300–350 từ)

Vitamin D (chủ yếu là D2 và D3) đóng vai trò sống còn trong việc chuyển hóa canxi, phospho, khoáng hóa sụn xương, ngăn ngừa còi xương ở trẻ nhỏ, chống loãng xương ở người lớn tuổi và điều hòa miễn dịch. Trong bối cảnh gánh nặng kép về dinh dưỡng tại các quốc gia đang phát triển—vừa đối mặt với suy dinh dưỡng vừa kiểm soát các bệnh mạn tính không lây—nhu cầu tăng cường vi chất dinh dưỡng vào khẩu phần ăn thông qua thực phẩm chức năng, sữa bột, sữa công thức và chế phẩm dinh dưỡng ngày càng bùng nổ.

Tuy nhiên, việc kiểm soát chất lượng gặp nhiều thách thức:

1. Hàm lượng cực thấp: Vitamin D trong thực phẩm thường tồn tại ở nồng độ vết ($\mu\text{g}/100,\text{g}$ hoặc $\text{ppb}$).
2. Nền mẫu phức tạp: Sữa, bột dinh dưỡng và bánh kẹo chứa lượng lớn chất béo, protein và các chất chống oxy hóa tự nhiên dễ gây nhiễu phổ.
3. Khoảng trống kỹ thuật tại thời điểm nghiên cứu: Bảng thành phần thức ăn Việt Nam và hệ thống Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) giai đoạn này chưa có một quy trình chuẩn hóa chính thức sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao cho đồng thời cả Vitamin D2 và D3.

Nghiên cứu do Viện Dinh Dưỡng thực hiện giải quyết khoảng trống kỹ thuật này bằng cách thiết lập một quy trình phân tích sắc ký hiện đại, kinh tế, phù hợp với trang thiết bị phòng kiểm nghiệm trong nước, tạo cơ sở khoa học để đánh giá đúng nhãn dinh dưỡng và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

---

Methodology và approach (350–400 từ)

Nghiên cứu được thiết kế theo quy trình thực nghiệm phân tích chuẩn hóa phân tích hóa lý, bao gồm các công đoạn:

1. Chuẩn bị và xử lý mẫu

• Xà phòng hóa bảo vệ: Mẫu được xà phòng hóa với $\text{KOH } 80%$ trong môi trường ethanol khan, có bổ sung Tert-butylhydroquinone (TBHQ) nhằm ngăn ngừa sự oxy hóa phân hủy Vitamin D ở nhiệt độ $75^\circ\text{C}$ trong 1 giờ hoặc ở nhiệt độ phòng qua đêm.
• Chiết xuất và làm sạch: Chiết phân đoạn không xà phòng hóa bằng ete dầu hỏa ($30–60^\circ\text{C}$), rửa dịch chiết bằng dung dịch $\text{NaCl } 5%$ đến trung tính, sau đó làm sạch chọn lọc qua cột chiết pha rắn SPE-Silica ($6,\text{ml}$) bằng hệ dung môi Ethyl acetat : n-Hexan ($7:73$).

2. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký (HPLC-DAD)

• Pha tĩnh: So sánh cột Waters RP-18 ($5,\mu\text{m}, 4.6 \times 150,\text{mm}$) và Inertsil ODS-3 ($5,\mu\text{m}, 4.6 \times 250,\text{mm}$). Cột Inertsil ODS-3 được lựa chọn do đem lại hiệu quả tách đỉnh vượt trội, pic đối xứng và loại bỏ hiện tượng chồng phổ giữa D2 và D3.
• Pha động: Khảo sát các hệ dung môi $\text{ACN}:\text{MeOH}$, $\text{ACN}:\text{H}_2\text{O}$ và $\text{MeOH}:\text{THF}:\text{H}_2\text{O}$ ở các tỷ lệ và tốc độ dòng khác nhau ($1.0$, $1.2$, $1.5,\text{ml/phút}$). Hệ $\text{MeOH}:\text{THF}:\text{H}_2\text{O}$ ($92:3:5$, $v/v/v$) ở tốc độ $1.5,\text{ml/phút}$ được chọn vì vừa tối ưu hóa thời gian lưu ($t_R \approx 12.4,\text{phút}$ cho D2 và $13.4,\text{phút}$ cho D3), vừa tiết kiệm chi phí hóa chất so với dung môi Acetonitril.
• Đầu dò: DAD đo tại bước sóng cực đại $\lambda = 265,\text{nm}$, thể tích tiêm mẫu $50,\mu\text{L}$.

3. Đánh giá giá trị sử dụng (Method Validation)

Phương pháp được thẩm định toàn diện dựa trên các chỉ số: độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ nhạy (LOD, LOQ), độ lặp lại ($Cv%$) và độ đúng/độ thu hồi ($R%$) trên cả mẫu chuẩn đối chứng (CRM DDP4) và mẫu thực tế thêm chuẩn.

---

Phát hiện chính (400–450 từ)

Quá trình khảo nghiệm và phân tích thực tế đem lại các kết quả định lượng chuẩn xác với độ tin cậy thống kê cao:

1. Phân tách sắc ký tối ưu giữa Vitamin D2 và D3

Việc sử dụng cột Inertsil ODS-3 cùng pha động $\text{MeOH}:\text{THF}:\text{H}_2\text{O}$ ($92:3:5$) giải quyết được bài toán tách hai đồng phân cấu trúc có tính chất tương đồng. Thời gian lưu được rút ngắn còn $12.45,\text{phút}$ (Vitamin D2) và $13.41,\text{phút}$ (Vitamin D3), pic sắc ký sắc nét, không bị kéo đuôi và đạt độ phân giải cao.

2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) vượt trội

• Vitamin D2: $\text{LOD} = 2.2,\text{ppb}$ ($0.0022,\mu\text{g/ml}$), $\text{LOQ} = 7.0,\text{ppb}$.
• Vitamin D3: $\text{LOD} = 3.4,\text{ppb}$ ($0.0034,\mu\text{g/ml}$), $\text{LOQ} = 11.0,\text{ppb}$. Kết quả này cho phép định lượng chính xác vi chất ngay cả trong các nền mẫu có hàm lượng bổ sung rất thấp.

3. Độ tuyến tính và độ lặp lại hoàn hảo

Đường chuẩn xây dựng trên dải nồng độ $0.002 - 0.55,\text{ppm}$ đối với D2 và $0.0034 - 0.50,\text{ppm}$ đối với D3 đều đạt hệ số tương quan tuyến tính $R^2 = 0.9948$ và $R^2 > 0.99$. Thử nghiệm lặp lại 5 lần trên các ma trận sữa bột và sữa tươi cho thấy hệ số biến thiên ($Cv%$) dao động từ $5.4%$ đến $7.3%$, hoàn toàn đáp ứng tiêu chuẩn phân tích vi lượng quốc tế theo AOAC.

4. Độ đúng và độ thu hồi tin cậy

Độ thu hồi trên các nền mẫu sữa bột và sữa chua nạp chuẩn đạt $75% - 81%$ đối với D2 và $75% - 90%$ đối với D3. Khi phân tích mẫu bột sữa vật liệu chuẩn (DDP4, giá trị công bố $5,\mu\text{g}/100,\text{g}$), kết quả thực nghiệm đạt $4.0,\mu\text{g}/100,\text{g}$ (tương ứng độ thu hồi $80%$).

5. Kết quả khảo sát trên các sản phẩm thị trường

Phương pháp đã định lượng thành công hàm lượng Vitamin D trên nhiều dòng sản phẩm:

• Sữa bột Sunny Grow Baby: $6.9,\mu\text{g}/100,\text{g}$ (D3).
• Sữa bột XO: $2.2,\mu\text{g}/100,\text{g}$ (D2).
• Siro trẻ em: $11.1,\mu\text{g}/100,\text{ml}$.
• Thực phẩm chức năng Dưỡng Cốt Tinh Hoa: $49.0,\mu\text{g}/100,\text{g}$.
• Một số mẫu bánh quy, sữa tách béo cho kết quả dưới ngưỡng phát hiện (KPH), phản ánh đúng công bố thành phần.

---

Đóng góp khoa học (250–300 từ)

1. Đóng góp phương pháp luận: Nghiên cứu đã chuẩn hóa thành công quy trình phân tích đồng thời Vitamin D2 và D3 trên hệ thống RP-HPLC-DAD, khắc phục nhược điểm của các phương pháp so màu hoặc đo quang cổ điển vốn kém đặc hiệu và dễ bị sai số do nền mẫu.
2. Tối ưu hóa kinh tế - kỹ thuật: Việc lựa chọn hệ dung môi gốc Methanol/THF thay thế cho Acetonitril đắt tiền giúp giảm thiểu đáng kể chi phí phân tích cho mỗi mẻ mẫu mà vẫn đảm bảo độ phân giải sắc ký và độ bền của cột tách.
3. Ứng dụng thực tiễn: Thiết lập một quy trình thao tác chuẩn (SOP) hoàn chỉnh từ khâu tiền xử lý (xà phòng hóa có bảo vệ chất chống oxy hóa, chiết pha rắn SPE) đến phân tích định lượng, sẵn sàng chuyển giao cho các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm trên cả nước.
4. Hỗ trợ chính sách và quản lý: Cung cấp cơ sở thực nghiệm vững chắc phục vụ việc xây dựng Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN), bổ sung dữ liệu vi chất cho Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam, đồng thời hỗ trợ cơ quan quản lý kiểm tra nhãn dinh dưỡng và công bố hợp chuẩn của doanh nghiệp.

---

Đối tượng quan tâm (200–250 từ)

• Chuyên viên kiểm nghiệm & Viện nghiên cứu: Các phân tích viên tại các phòng thử nghiệm ISO/IEC 17025 có thể ứng dụng ngay quy trình tiền xử lý mẫu và cài đặt thông số HPLC để phân tích thường quy các vitamin tan trong dầu.
• Doanh nghiệp sản xuất sữa & Thực phẩm chức năng: Đội ngũ R&D và QC/QA có công cụ chính xác để kiểm soát chất lượng nguyên liệu đầu vào, đánh giá độ ổn định của vi chất trong hạn sử dụng và chuẩn hóa thông tin dinh dưỡng trên bao bì.
• Cơ quan quản lý chất lượng & ATTP: Cục An toàn thực phẩm và các Trung tâm Y tế dự phòng có căn cứ khoa học để thanh tra, giám định tính trung thực của các sản phẩm sữa dinh dưỡng và thực phẩm chức năng lưu thông trên thị trường.

---

FAQ – Các câu hỏi thường gặp (250–300 từ)

1. Phương pháp này có ưu điểm gì nổi bật so với các phương pháp thử nghiệm trước đây?

Quy trình HPLC-DAD kết hợp làm sạch SPE giúp tách biệt hoàn toàn hai pic Vitamin D2 và D3 trong một lần chạy ($25,\text{phút}$), độ nhạy cao tới cấp độ $\text{ppb}$, loại bỏ được sai số do các hợp chất béo và chất màu gây ra trong phương pháp so màu truyền thống.

2. Vai trò của việc bổ sung chất chống oxy hóa TBHQ trong bước xà phòng hóa là gì?

Vitamin D rất nhạy cảm với nhiệt độ và ánh sáng, dễ bị oxy hóa phân hủy trong môi trường kiềm nóng. TBHQ (Tert-butylhydroquinone) đóng vai trò là chất ức chế oxy hóa, giúp bảo toàn hàm lượng vi chất trong suốt quá trình xà phòng hóa ở $75^\circ\text{C}$.

3. Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp có đáp ứng được kiểm nghiệm thực phẩm thông thường không?

Hoàn toàn đáp ứng. Với LOQ đạt $7,\text{ppb}$ (D2) và $11,\text{ppb}$ (D3), phương pháp dễ dàng phát hiện và định lượng chính xác lượng Vitamin D bổ sung trong sữa công thức và thực phẩm chức năng (thường nằm trong dải từ $0.5$ đến hàng chục $\mu\text{g}/100,\text{g}$).

4. Tại sao lại chọn pha động gốc Methanol thay vì Acetonitril (ACN)?

Mặc dù ACN cho độ nhớt thấp hơn, nhưng nghiên cứu chứng minh hệ dung môi $\text{MeOH}:\text{THF}:\text{H}_2\text{O}$ ($92:3:5$) trên cột Inertsil ODS-3 mang lại khả năng phân tách tốt hơn, dạng pic đối xứng hơn và đặc biệt giúp tiết kiệm đáng kể chi phí vận hành cho phòng kiểm nghiệm.

5. Điểm nào trong quy trình có thể tiếp tục cải tiến trong tương lai?

Nghiên cứu chỉ ra rằng bước làm sạch qua SPE Silica vẫn còn để lại một số tạp chất nền trên sắc đồ. Các nghiên cứu tiếp theo có thể sử dụng cột SPE pha đảo (C18), chiết pha rắn liên hợp hoặc sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) để tăng cường độ tinh sạch và độ chọn lọc.

---

Kết luận (150 từ)

Nghiên cứu của Viện Dinh Dưỡng đã chuẩn hóa thành công quy trình phân tích định lượng Vitamin D2 và D3 trong thực phẩm bằng kỹ thuật RP-HPLC-DAD với độ chính xác cao, độ lặp lại ổn định ($Cv% < 7.3%$) và chi phí vận hành tối ưu. Công trình không chỉ lấp đầy khoảng trống kỹ thuật trong kiểm nghiệm vi chất tại Việt Nam mà còn là nền tảng quan trọng phục vụ quản lý chất lượng thực phẩm và nâng cao sức khỏe cộng đồng. Các đơn vị kiểm nghiệm và nhà sản xuất được khuyến khích áp dụng quy trình chuẩn này vào hệ thống kiểm soát chất lượng nội bộ để đảm bảo tính minh bạch và an toàn dinh dưỡng cho người tiêu dùng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ViÖn Dinh D−ìng Trung t©m kiÓm nghiÖm vsATTP ***************** B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu ChuÈn hãa ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D (D2 vµ D3) trong thùc phÈm b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC) Chñ nhiÖm ®Ò tµi : Ks. §oµn ThÞ H−êng 6544 20/9/2007 Hµ néi, 2007 ViÖn Dinh D−ìng Trung t©m kiÓm nghiÖm vsATTP ***************** B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu ChuÈn hãa ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D (D2 vµ D3) trong thùc phÈm b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC) Chñ nhiÖm ®Ò tµi: Ks. §oµn ThÞ H−êng C¸c c¸n bé tham gia: C n. NguyÔn Thu H»ng C¬ quan chñ tr×: Trung t©m kiÓm nghiÖm VSATTP C¬ quan chñ qu¶n: ViÖn dinh d−ìng Kinh phÝ: 20 triÖu ®ång (Nguån NNS) Hµ n«i, 2007 Môc lôc TT Néi dung Trang 1 Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t 2 Danh môc c¸c b¶ng 3 Danh môc c¸c h×nh 4 PhÇn 1: Më ®Çu 1 5 PhÇn 2: Tæng quan 3 6 PhÇn 3: Môc tiªu, ®èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 8 1.

Néi dung vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 8 4. Kü thuËt ph©n tÝch s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ¸p 9 5. C¸c ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng b»ng HPLC 11 6. Quy tr×nh ph©n tÝch thö nghiÖm 13 7 PhÇn 4: KÕt qu¶ nghiªn cøu 17 1.

Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn ch¹y s¾c ký 17 2. X¸c ®Þnh kho¶ng tuyÕn tÝnh 29 5. X¸c ®Þnh ®é lÖch chuÈn vµ hÖ sè biÕn thiªn 32 6. Mét sè s¾c ®å ch¹y s¾c ký cña mÉu ph©n tÝch 37 8 PhÇn 5: NhËn xÐt vµ bµn luËn kÕt qu¶ 39 9 PhÇn 6: Quy tr×nh ph©n tÝch x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D 41 trong thùc phÈm b»ng ph−¬ng ph¸p HPLC 10 PhÇn 7: Tµi liÖu tham kh¶o 45 11 PhÇn phô lôc: C¸c s¾c ®å cña dung dÞch chuÈn vitamin D2 vµ D3 x©y dùng kho¶ng tuyÕn tÝnh c¸c ch÷ viÕt t¾t TT C¸c ch÷ viÕt t¾t NghÜa tiÕng ViÖt 1 HPLC S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao 2 DAD Detector m¶ng di«t 3 UV-VIS Quang phæ tö ngo¹i - kh¶ kiÕn 4 RDA Nhu cÇu ¨n khuyÕn c¸o 5 TCVN Tiªu chuÈn ViÖt nam 6 AOAC HiÖp héi ph©n tÝch ho¸ häc 7 LOD Giíi h¹n ph¸t hiÖn 8 LOQ Giíi h¹n ®Þnh l−îng 9 SD §é lÖch chuÈn 10 Cv HÖ sè biÕn thiªn 11 MeOH Methanol 12 THF Tetra hydrofuran 13 ACN Acetonitril 14 SPE Cét chiÕt pha r¾n 15 TBHQ Tert butyl hydroquinol Danh môc c¸c b¶ng TT Néi dung b¶ng B¶ng 1 Thêi gian l−u cña vitamin D2 vµ D3 ®èi víi ®iÒu kiÖn ch¹y cét Waters RP- 18, detector DAD, b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: H2O = 98: 2, tèc ®é dßng 1ml/phót B¶ng 2 Thêi gian l−u cña vitamin D2 ch¹y cét Inertsil ODS 3 vµ cét Waters RP18, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN : MeOH =75:25, tèc ®é dßng 1ml/phót.

B¶ng 3 NhËn xÐt c¸c s¾c ®å cña hai chÊt chuÈn ®èi víi cét Inertsil ODS 3 detector DAD b−íc sãng 265nm, Pha ®éng ACN : H2O =75:25, tèc ®é dßng 1ml/phót B¶ng 4 NhËn xÐt kÕt qu¶ ch¹y s¾c ký hai chuÈn trªn cét Inertsil ODS 3 pha ®éng ACN : MeOH = 50: 50, detector DAD b−íc sãng 265nm, tèc ®é dßng 1ml/phót.