Biến Đổi Của Gen MT-CO1 Trong Bệnh Nhân Ung Thư Đại Trực Tràng

Nghiên cứu biến đổi gen mt co1 ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, cung cấp cái nhìn sâu sắc về cơ chế bệnh lý và tiềm năng điều trị.

• Tác giả: Lê Thị Quỳnh Thơ
• Người hướng dẫn: PGS. Trịnh Hồng Thái
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Biến Đổi Của Gen MT-CO1 Ty Thể Ở Bệnh Nhân Ung Thư Đại Trực Tràng
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
• 1.1. Tình trạng ung thư đại trực tràng ở trên thế giới và Việt Nam
• 1.2. Ung thư đại trực tràng
• 1.3. Các yếu tố nguy cơ ung thư đại trực tràng
• 1.4. Triệu chứng của bệnh
• 1.5. Phân loại ung thư đại trực tràng theo mô học
• 1.6. Các chỉ thị sinh học của ung thư đại trực tràng
• 1.7. Tổng quan về ty thể ở người
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Các hóa chất sử dụng
• 2.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Khuếch đại đoạn gen MT-CO1 ty thể bằng phương pháp PCR
• 2.4.2. Tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.4.3. Giải trình tự trực tiếp
• 2.4.4. Phân tích PCR-RFLP
• 2.4.5. Điện di sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn
• 2.4.6. Xác định mức độ dị tế bào chất bằng phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả sàng lọc biến đổi gen MT-CO1 bằng giải trình tự trực tiếp
• 3.2. Kết quả PCR từ cặp mồi 5851F-7595R
• 3.3. Các biến đổi trên gen MT-CO1 được xác định bằng giải trình tự trực tiếp
• 3.4. Kết quả sàng lọc biến đổi C6340T, T6253C bằng phương pháp PCR-RFLP
• 3.5. Kết quả thiết kế mồi và lựa chọn enzyme cắt giới hạn
• 3.6. Kết quả PCR-RFLP
• 3.7. Kết quả định lượng mức độ đột biến bằng phần mềm ImageJ
• 3.8. Kết quả sàng lọc biến đổi C6340T trên mẫu máu của người bình thường và một vài mẫu máu của người bệnh
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG

Tóm tắt

I. Tổng quan về Biến Đổi Gen MT CO1 Ở Bệnh Nhân Ung Thư Đại Trực Tràng

Biến đổi gen MT-CO1 là một trong những yếu tố quan trọng trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng. Gen MT-CO1, thuộc hệ gen ty thể, có vai trò quan trọng trong quá trình hô hấp tế bào. Nghiên cứu cho thấy rằng các biến đổi trong gen này có thể liên quan đến sự phát triển và tiến triển của ung thư đại trực tràng. Việc hiểu rõ về gen MT-CO1 và các biến đổi của nó có thể giúp cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị bệnh.

1.1. Biến Đổi Gen MT CO1 và Vai Trò Của Nó Trong Ung Thư

Gen MT-CO1 mã hóa cho một phần của phức hợp cytochrome c oxidase, có vai trò quan trọng trong chuỗi hô hấp. Biến đổi gen này có thể dẫn đến sự thay đổi trong chức năng hô hấp của tế bào, từ đó ảnh hưởng đến sự phát triển của ung thư đại trực tràng.

1.2. Tình Hình Nghiên Cứu Biến Đổi Gen MT CO1 Ở Việt Nam

Nghiên cứu về biến đổi gen MT-CO1 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam còn hạn chế. Tuy nhiên, một số nghiên cứu ban đầu đã chỉ ra rằng có sự hiện diện của các đột biến trong gen này, mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc chẩn đoán và điều trị.

II. Vấn Đề và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Biến Đổi Gen MT CO1

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về biến đổi gen MT-CO1, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định mối liên hệ giữa các biến đổi này và sự phát triển của ung thư đại trực tràng. Các yếu tố như di truyền, môi trường và lối sống có thể ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu.

2.1. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Biến Đổi Gen MT CO1

Các yếu tố di truyền và môi trường có thể tác động đến sự xuất hiện của các biến đổi trong gen MT-CO1. Việc xác định các yếu tố này là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế phát triển của ung thư.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Chẩn Đoán Biến Đổi Gen

Việc phát hiện các biến đổi gen MT-CO1 trong mẫu mô bệnh nhân gặp nhiều khó khăn do sự đa dạng của các đột biến và sự phức tạp trong phương pháp phân tích gen.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Biến Đổi Gen MT CO1 Ở Bệnh Nhân

Để nghiên cứu biến đổi gen MT-CO1, các phương pháp hiện đại như PCR, giải trình tự gen và phân tích RFLP được sử dụng. Những phương pháp này giúp xác định chính xác các biến đổi trong gen và mối liên hệ của chúng với ung thư đại trực tràng.

3.1. Phương Pháp PCR Trong Nghiên Cứu Gen MT CO1

Phương pháp PCR được sử dụng để khuếch đại đoạn gen MT-CO1, giúp dễ dàng phát hiện các biến đổi. Kỹ thuật này cho phép nghiên cứu sâu hơn về các đột biến gen trong mẫu mô bệnh nhân.

3.2. Giải Trình Tự Gen Để Phát Hiện Biến Đổi

Giải trình tự gen là phương pháp chính xác để xác định các biến đổi trong gen MT-CO1. Kết quả từ giải trình tự giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Biến Đổi Gen MT CO1

Nghiên cứu về biến đổi gen MT-CO1 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế phát triển của ung thư đại trực tràng mà còn có thể ứng dụng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị mới. Việc phát hiện sớm các biến đổi này có thể cải thiện tỷ lệ sống sót của bệnh nhân.

4.1. Ứng Dụng Trong Chẩn Đoán Sớm Ung Thư

Các biến đổi gen MT-CO1 có thể được sử dụng như một chỉ thị sinh học để phát hiện sớm ung thư đại trực tràng. Điều này giúp tăng cường khả năng điều trị và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

4.2. Phát Triển Phương Pháp Điều Trị Mới

Nghiên cứu về gen MT-CO1 có thể dẫn đến việc phát triển các phương pháp điều trị nhắm vào các biến đổi gen cụ thể, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị ung thư đại trực tràng.

V. Kết Luận Về Biến Đổi Gen MT CO1 Ở Bệnh Nhân Ung Thư Đại Trực Tràng

Biến đổi gen MT-CO1 đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của ung thư đại trực tràng. Nghiên cứu sâu hơn về gen này có thể mở ra hướng đi mới trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định rõ hơn mối liên hệ giữa các biến đổi gen và sự phát triển của ung thư.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Biến Đổi Gen MT CO1

Nghiên cứu về biến đổi gen MT-CO1 sẽ tiếp tục được mở rộng, với hy vọng tìm ra các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

5.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Trong Y Học

Nghiên cứu về gen MT-CO1 không chỉ có ý nghĩa trong việc điều trị ung thư mà còn góp phần vào sự phát triển của y học chính xác, nơi mà các phương pháp điều trị được cá nhân hóa dựa trên đặc điểm gen của từng bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư đại trực tràng là một trong những bệnh lý ác tính đường tiêu hóa phổ biến nhất với gánh nặng bệnh tật ngày càng gia tăng. Theo thống kê của Globocan năm 2012, ung thư đại trực tràng đứng thứ 3 về tỷ lệ mắc mới với khoảng 1,3 triệu ca và đứng thứ 4 về tỷ lệ tử vong với hơn 600.000 ca trên toàn cầu, chiếm tỷ trọng 8,5% tổng số ca tử vong do ung thư. Tại Việt Nam, căn bệnh này xếp thứ 4 ở nam giới với khoảng 4.561 ca mắc mới (chiếm 6,5%) và xếp thứ 6 ở nữ giới với 4.207 ca mắc mới (chiếm 7,7%). Vấn đề then chốt trong điều trị ung thư đại trực tràng là khả năng phát hiện ở giai đoạn sớm; nếu được chẩn đoán kịp thời, tỷ lệ điều trị thành công và kéo dài thời gian sống trên 5 năm của bệnh nhân sẽ tăng lên đáng kể.

Hệ gen ty thể không có protein histone bao bọc, cơ chế sửa chữa tổn thương kém hoàn thiện và nằm trực tiếp trong môi trường giàu các gốc oxy phản ứng do chuỗi hô hấp tế bào tạo ra, khiến phân tử này có tần số đột biến cao gấp nhiều lần so với hệ gen nhân. Đề tài nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá tình trạng biến đổi của gen mã hóa tiểu phần 1 của cytochrome c oxidase (MT-CO1) thuộc hệ gen ty thể và xác định mức độ dị tế bào chất trên các mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

Nghiên cứu được triển khai trên 106 cặp mẫu mô u và mô lành lân cận cùng 9 mẫu máu của bệnh nhân tại Bệnh viện K và Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức, đối chiếu với 99 mẫu máu người khỏe mạnh từ Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương trong giai đoạn 2016-2017. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử quan trọng, mở ra hướng ứng dụng các biến đổi gen ty thể như một chỉ thị sinh học tiềm năng hỗ trợ sàng lọc, chẩn đoán phân tử và tiên lượng tiến triển bệnh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết chuyển hóa năng lượng tế bào của Otto Warburg và sinh học phân tử hệ gen ty thể. Bản đồ hệ gen ty thể người là một phân tử DNA vòng kép khép kín gồm 16.569 cặp base (bp), mã hóa cho 37 gen bao gồm 2 rARN, 22 tARN và 13 chuỗi polypeptide tham gia cấu thành các phức hệ phosphoryl hóa oxy hóa (OXPHOS). Trong đó, phức hệ Cytochrome c oxidase (Phức hệ IV) có khối lượng phân tử khoảng 204.000 Dalton gồm 13 tiểu đơn vị, giữ vai trò xúc tác phản ứng chuyển 4 electron từ cytochrome c khử đến oxy để tạo thành 2 phân tử nước, đồng thời bơm proton qua màng trong ty thể nhằm duy trì điện thế màng tổng hợp ATP.

Gen MT-CO1 dài 1.542 bp (nằm từ vị trí 5904 đến 7445 trên chuỗi nặng của hệ gen ty thể), chứa 3 trung tâm xúc tác quan trọng là heme a, heme a3 và CuB. Khi xảy ra đột biến trên gen MT-CO1, cấu trúc không gian của chuỗi xoắn xuyên màng bị biến dạng, dẫn đến suy giảm hoạt tính enzym của phức hệ IV, rò rỉ dòng electron và tăng sinh ồ ạt các gốc tự do ROS. Hiện tượng này thúc đẩy quá trình sinh ung thư và ức chế cơ chế chết theo chương trình của tế bào biểu mô đại trực tràng. Do mỗi tế bào chứa hàng trăm đến hàng nghìn bản sao DNA ty thể, nghiên cứu áp dụng mô hình phân loại trạng thái di truyền thành đồng tế bào chất (toàn bộ bản sao mang cùng một kiểu gen) và dị tế bào chất (tồn tại song song giữa bản sao bình thường và bản sao mang đột biến).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm bao gồm 106 cặp mẫu mô u đại trực tràng và mô lân cận u (cắt cách rìa khối u từ 5 đến 10 cm), 9 mẫu máu toàn phần của chính bệnh nhân đó và 99 mẫu máu của người khỏe mạnh không mắc bệnh lý ung thư. Phương pháp chọn mẫu được thực hiện theo tiêu chuẩn chẩn đoán mô bệnh học kết hợp hệ thống phân loại TNM của Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ và Liên minh Kiểm soát Ung thư Quốc tế.

Quy trình phân tích trong phòng thí nghiệm được tiến hành tuần tự qua ba phương pháp chính:

• Kỹ thuật PCR và giải trình tự Sanger trực tiếp: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu 5851F và 7595R để khuếch đại toàn bộ chiều dài gen MT-CO1 tạo sản phẩm 1.745 bp. Sản phẩm được tinh sạch bằng hệ enzym ExoSAP-IT (Affymetrix, Mỹ) với chu trình ủ ở 37°C trong 15 phút và bất hoạt ở 80°C trong 15 phút, sau đó giải trình tự trực tiếp trên máy đọc tự động và so sánh với trình tự tham chiếu quốc tế NC_012920.1 qua công cụ BLAST.
• Kỹ thuật PCR-RFLP: Thiết kế cặp mồi rút gọn 6221F và 6381R tạo đoạn khuếch đại 161 bp chứa các vị trí biến đổi trọng điểm. Đoạn DNA được xử lý cắt bằng các enzym cắt giới hạn chuyên biệt gồm BccI (nhận diện vị trí 6340) và TaaI (nhận diện vị trí 6253). Sản phẩm cắt được phân tách trên gel polyacrylamide 10% với điều kiện điện di 110V trong 35 phút.
• Phương pháp phân tích hình ảnh định lượng: Sử dụng phần mềm ImageJ để đo đạc mật độ quang học điểm ảnh của các băng DNA (băng đột biến 161 bp và băng hoang dại 128 bp), từ đó xác định chính xác tỷ lệ phần trăm đột biến dị tế bào chất trong mẫu mô.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Phân tích giải trình tự trên 27 mẫu mô bệnh nhân ung thư đại trực tràng đã phát hiện tổng cộng 16 vị trí biến đổi nucleotide trên gen MT-CO1. Trong đó, có 13 biến đổi đồng nghĩa không làm thay đổi acid amin và 3 biến đổi sai nghĩa làm thay đổi cấu trúc chuỗi polypeptide bao gồm: T6253C (thay thế Methionine bằng Threonine), C6340T (thay thế Threonine bằng Isoleucine), và A7229G (thay thế Methionine bằng Valine). Biến đổi đồng nghĩa C7028T xuất hiện với tần suất áp đảo lên đến 85,2% (23/27 mẫu).

Sàng lọc mở rộng bằng kỹ thuật PCR-RFLP trên 106 mẫu mô ghi nhận đột biến T6253C xuất hiện ở 2 bệnh nhân (chiếm tỷ lệ 1,8%), đều tồn tại ở trạng thái đồng tế bào chất hoàn toàn 100%.

Đối với biến đổi C6340T, khi phân tích trên 80 mẫu mô u và 106 mẫu mô lân cận u, kết quả ghi nhận 3 mẫu mô u mang biến đổi (1 mẫu đồng tế bào chất và 2 mẫu dị tế bào chất) cùng 3 mẫu mô lân cận u mang biến đổi ở dạng dị tế bào chất. Ngược lại, biến đổi này hoàn toàn không xuất hiện trong 9 mẫu máu của chính bệnh nhân ung thư đại trực tràng và chỉ xuất hiện ở 1% (1/99 mẫu) trong quần thể người khỏe mạnh đối chứng.

Phân tích định lượng mức độ dị tế bào chất bằng phần mềm ImageJ cho thấy sự chênh lệch rõ rệt về mức độ đột biến giữa mô bệnh và mô lành. Tại bệnh nhân mã số 17401, tỷ lệ đột biến C6340T ở mô lân cận u là 16,8%, trong khi ở mô khối u tỷ lệ này tăng vọt lên 78,5%. Tại bệnh nhân mã số 16689, mô lân cận u có tỷ lệ đột biến là 89,7%, còn mô khối u đã chuyển hóa hoàn toàn sang dạng đột biến đồng tế bào chất với tỷ lệ 100%.

Thảo luận kết quả

Các kết quả thực nghiệm có thể được hệ thống hóa qua biểu đồ cột thể hiện sự biến thiên tỷ lệ dị tế bào chất giữa mô lành và mô ung thư, kết hợp bảng ma trận mật độ điểm ảnh của các băng phân đoạn 161 bp, 128 bp và 33 bp. Dữ liệu này chứng minh rõ nét sự tích lũy bản sao DNA ty thể đột biến trong quá trình phân chia mất kiểm soát của tế bào ung thư.

Sự biến đổi C6340T dẫn đến sự thay thế acid amin Threonine (một acid amin phân cực) thành Isoleucine (acid amin kỵ nước) tại vị trí chuỗi xoắn xuyên màng của protein MT-CO1. Sự xáo trộn này làm suy giảm tính toàn vẹn của trung tâm vận chuyển electron, dẫn tới sự gián đoạn chuỗi hô hấp tế bào và kích hoạt các phản ứng tăng sinh gốc oxy phản ứng nội bào.

Đặc biệt, việc đột biến C6340T hiện diện ở mô u và mô lân cận u nhưng vắng mặt trong mẫu máu toàn phần của cùng một cơ thể chứng minh đây là dạng đột biến soma phát sinh cục bộ trong quá trình sinh u ở đường tiêu hóa. Phát hiện này cung cấp góc nhìn mới so với các nghiên cứu trước đây trên thế giới của Petros và cộng sự (2005), vốn từng nhận định biến đổi C6340T là đột biến dòng mầm di truyền trên bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt. Sự tích tụ bản sao đột biến từ mức thấp ở mô cận u lên mức chiếm ưu thế tuyệt đối trong khối u khẳng định vai trò chọn lọc tiến hóa dòng tế bào trong vi môi trường khối u đại trực tràng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Xây dựng quy trình chuẩn hóa sàng lọc sớm đột biến soma gen MT-CO1 (trọng tâm là vị trí C6340T và T6253C) bằng kỹ thuật Real-time PCR hoặc PCR-RFLP tại các khoa xét nghiệm sinh học phân tử thuộc các bệnh viện ung bướu trên toàn quốc, nhằm mục tiêu nâng cao độ nhạy phát hiện tổn thương tiền ung thư lên mức trên 80% trong giai đoạn 2026-2028.
2. Mở rộng quy mô nghiên cứu dịch tễ học phân tử với cỡ mẫu từ 300 đến 500 bệnh nhân ung thư đại trực tràng trên nhiều vùng địa lý khác nhau của Việt Nam trong vòng 24 tháng tới, do các Viện nghiên cứu chuyên ngành và Đại học Y Dược chủ trì, nhằm thiết lập ngân hàng dữ liệu đột biến ty thể đặc thù cho người Việt.
3. Ứng dụng chỉ số ngưỡng dị tế bào chất (heteroplasmy threshold vượt mức 60%) như một thông số sinh học bổ trợ để đánh giá mức độ ác tính, mức độ xâm lấn mô học và dự báo nguy cơ tái phát sau phẫu thuật cắt bỏ khối u, hướng tới giảm tỷ lệ tái phát không được kiểm soát khoảng 15% vào năm 2030.
4. Triển khai các nghiên cứu thử nghiệm công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) độ sâu cao nhằm phát hiện DNA ty thể tự do mang đột biến C6340T trong huyết tương và mẫu phân không xâm lấn, giao cho các nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học y dược thực hiện trước năm 2029.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, Di truyền học và Y sinh học: Sử dụng luận văn như một tài liệu tham khảo toàn diện về phương pháp thiết kế mồi, kỹ thuật tinh sạch sản phẩm PCR bằng ExoSAP-IT, phản ứng cắt enzyme giới hạn và thuật toán phân tích densitometry bằng phần mềm ImageJ.
• Bác sĩ chuyên khoa Ung bướu, Ngoại Tiêu hóa và Giải phẫu bệnh: Tham khảo các dữ liệu biến đổi gen soma để hiểu sâu hơn về cơ chế chuyển hóa năng lượng ty thể trong khối u, từ đó định hướng kết hợp các xét nghiệm phân tử với chẩn đoán hình ảnh và nội soi đại trực tràng.
• Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm Sinh học phân tử y tế: Khai thác quy trình tối ưu hóa nhiệt độ chu trình luân nhiệt PCR, kỹ thuật đổ gel polyacrylamide 10% và các bước bất hoạt enzyme giới hạn để áp dụng trực tiếp vào quy trình kiểm nghiệm thường quy.
• Các chuyên gia phát triển kit chẩn đoán sinh học phân tử tại các doanh nghiệp công nghệ sinh học: Tiếp cận nguồn số liệu thực chứng về các vị trí đột biến điểm đặc hiệu của người Việt để nghiên cứu sản xuất các sinh phẩm chẩn đoán in-vitro giá thành hợp lý.

Câu hỏi thường gặp

Đột biến gen ty thể MT-CO1 có di truyền cho thế hệ sau không? Hệ gen ty thể di truyền theo dòng mẹ qua tế bào chất của trứng. Tuy nhiên, các biến đổi như C6340T được xác định trong nghiên cứu này là đột biến soma phát sinh tại mô đại trực tràng của bệnh nhân, không tồn tại trong tế bào sinh dục nên không di truyền cho thế hệ sau.

Tại sao biến đổi đồng nghĩa C7028T chiếm tỷ lệ cao tới 85,2% nhưng không gây thay đổi acid amin? Biến đổi C7028T là một dạng đa hình đơn nucleotide (SNP) phổ biến trong quần thể người châu Á. Mặc dù bộ ba mã hóa vẫn dịch mã ra cùng một loại acid amin Alanine, tỷ lệ xuất hiện cao phản ánh đặc tính phân nhóm dòng haplogroup đặc trưng của hệ gen ty thể người Việt Nam.

Hiện tượng dị tế bào chất (heteroplasmy) ảnh hưởng như thế nào đến sự phát triển của khối u? Khi tỷ lệ DNA ty thể đột biến vượt qua một ngưỡng sinh học nhất định (thường từ 60% đến 80%), tế bào sẽ bị suy giảm hô hấp nghiêm trọng. Tế bào u thích nghi bằng cách tăng cường đường phân và giải phóng các tín hiệu kích thích tăng sinh mạch máu, giúp khối u phát triển nhanh hơn.

Phương pháp PCR-RFLP kết hợp ImageJ có ưu điểm gì so với giải trình tự gen trực tiếp? Giải trình tự Sanger khó phát hiện chính xác các đột biến dị tế bào chất có tỷ lệ dưới 20%. PCR-RFLP kết hợp phân tích mật độ quang học trên ImageJ cho phép định lượng tỷ lệ đột biến nhỏ từ 5% đến 15% một cách nhanh chóng với chi phí rẻ hơn nhiều lần.

Mẫu mô lân cận u cách khối u 5-10 cm tại sao vẫn phát hiện được đột biến C6340T? Hiện tượng này phản ánh tình trạng tổn thương tiền ung thư dạng biến đổi vùng (field cancerization). Các tế bào niêm mạc lân cận nhìn bề ngoài bình thường về mặt mô học nhưng đã bắt đầu tích tụ các sai hỏng DNA ty thể trước khi xuất hiện khối u nhìn thấy được.

Kết luận

• Đã khuếch đại thành công toàn bộ chiều dài 1.542 bp của gen MT-CO1 ty thể và giải trình tự 27 mẫu mô bệnh nhân ung thư đại trực tràng, xác định được 16 vị trí biến đổi nucleotide bao gồm 13 biến đổi đồng nghĩa và 3 biến đổi sai nghĩa (T6253C, C6340T, A7229G).
• Khẳng định biến đổi C6340T là dạng đột biến soma đặc hiệu của khối u ung thư đại trực tràng tại Việt Nam, xuất hiện trong mô bệnh học nhưng vắng mặt trong mô máu của cùng một bệnh nhân.
• Ứng dụng thành công phần mềm ImageJ để định lượng mức độ dị tế bào chất của biến đổi C6340T, chỉ ra sự gia tăng bản sao đột biến từ 16,8% ở mô cận u lên đến 78,5% - 100% ở mô khối u nguyên phát.
• Đóng góp nguồn dữ liệu phân tử thực chứng quan trọng về đặc điểm biến đổi DNA ty thể ở bệnh nhân người Việt, tạo tiền đề khoa học cho việc phát triển các panel chỉ thị sinh học chẩn đoán sớm.
• Các đơn vị nghiên cứu và cơ sở y tế chuyên khoa cần tiếp tục đẩy mạnh ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử ty thể, mở rộng thử nghiệm lâm sàng để sớm đưa các chỉ thị gen vào quy trình tầm soát và điều trị cá thể hóa ung thư đại trực tràng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ung thƣ đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những loại ung thƣ biểu môphổ biến nhất có tỷ lệ mắc mới và tử vong caotrên toàn thế giới và Việt Nam. Ung thƣ đại trực tràng có thể điều trị khỏi hẳn hoặc kéo dài thời gian sống của bệnh nhân nếu đƣợc phát hiện và chẩn đoán ở giai đoạn sớm. Trên thế giới, hƣớng nghiên cứu tìm ra các chỉ thị sinh học cho các bệnh ung thƣ, trong đó có UTĐTT đƣợc sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Trong đó, nghiên cứu về các biến đổi trên ADN ty thể cũng là một hƣớng có nhiều triển vọng có thể tìm ra các chỉ thị giúp hỗ trợ chẩn đoán sớm ung thƣ.

Do ADN ty thể không có protein histone bảo vệ, cơ chế sửa chữa ADN kém hiệu quả và tồn tại trong bào quan với các phản ứng oxy hóa khử liên tục, do đó ADN ty thể chịu tác động mạnh mẽ bởi các tác nhân gây đột biến hơn so với ADN nhân. Đến nay, hơn 200 đột biến trong hệ gen ty thể ngƣời đƣợc phát hiện, gây ra các triệu trứng bệnh khác nhau, chủ yếu và tập trung vào cơ, thần kinh, khả năng chuyển hóa và bệnh ung thƣ. Trên thế giới, có rất nhiều các công trình nghiên cứu về đột biến ADN ty thể liên quan đến các bệnh khác nhau trong đó có các bệnh ung thƣ. Tuy nhiên, ở Việt Nam hƣớng nghiên cứu này vẫn còn mới mẻ, số liệu công bố chƣa nhiều.

Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Biến đổi của gen MT-CO1 ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng” nhằm mục tiêu: - Đánh giá tình trạng biến đổi của gen MT-CO1 thuộc ADN ty thể ở bệnh nhân UTĐTT. - Xác định đƣợcmức độ dị tế bào chất của gen MT-CO1đối với một sốmẫu môcủa bệnh nhân UTĐTT. Đề tài đƣợc hỗ trợ từ nguồn kinh phí của đề tài QG.05 và đƣợc thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1.

Tổng quan về bệnh ung thƣ đại trực tràng 1. Tình trạng ung thƣ đại trực tràng ở trên thế giới và Việt Nam UTĐTT là một trong những bệnh ung thƣ phổ biến trên thế giới và gặp nhiều ở các nƣớc phát triển. Theo thống kê năm 2012 của Globocan, UTĐTT đứng thứ 3 về tỷ lệ mắc (9,7%) và thứ 4 về tỷ lệ tử vong (8,5%) do ung thƣ (Hình 1. Tỷ lệ mắc bệnh trên thế giới có sự khác biệt lớn về vị trí địa lý và từng khu vực địa lý và cũng khác biệt theo giới tính, tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở Úc/ New Zealand (ASR 44,8 nam và 32,2 nữ trên 100.000) và thấp nhất ở Tây Phi (4,5 nam và 3,8 nữ trên 100.000) trong các trƣờng hợp đƣợc chẩn đoán là do ung thƣ.

Ở Mỹ, UTĐTT đứng thứ 4 về tỷ lệ mắc và thứ 2 về tỷ lệ tử vong do ung thƣ. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 1,3 triệu ca mắc mới và trên 600.000 ca tử vong[53]. Tỷ lệ mắc mới và tử vong của UTĐTT trong tổng số các loại ung thƣ [53] Ở Việt Nam, UTĐTT đứng thứ 5 sau ung thƣ dạ dày, phổi, vú, vòm họng và xu hƣớng ngày càng tăng. Theo dữ liệu thống kê của Glocbocan năm 2012, UTĐTT đứng thứ 4 ở nam giới, hàng năm có khoảng 4561 ca mắc mới, chiếm 6,5% tỉ lệ mắc mới ung thƣ; ở nữ giới UTĐTT đứng thứ 6, khoảng 4207 ca mắc mới, chiếm 7,7% tổng số ngƣời mắc mới ở nữ giới[53].

2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Ung thƣ đại trực tràng Đại tràng và trực tràng là phần cuối cùng của hệ thống ống tiêu hóa, thƣờng gọilà ruột già, đóng vai trò quan trọng việc xử lý các thức ăn không tiêu hóa đƣợc (chất xơ…), một số vi khuẩn ở ruột già có thể sản xuất các vitamin cho cơ thể, hấp thụ thức ăn và tạo nên phân để thải ra ngoài. Đại trực tràng ở ngƣời trƣởng thành thƣờng có kích thƣớc khoảng 1,5-1,8m; phần ruột lớn hình chữN gồm manh tràng, đại tràng lên, đại tràng ngang, đại tràng xuống, đại tràng sigma và trực tràng[54] (Hình 1.Trực tràng là đoạn cuối của ống tiêu hóa đi từ chỗ nối đại tràng sigma cho đến đƣờng lƣợc, dài khoảng 15cm. Trực tràng chia làm 3 phần: trực tràng trên cách rìa hậu môn từ 12-18cm, trực tràng giữa cách rìa hậu môn từ 6-12cm và trực tràng rìa hậu môn dƣới 6cm[4].

Hình ảnh vị trí đại tràng và trực tràng ở ngƣời [55] UTĐTT là loại ung thƣ hay gặp đứng thứ hai trong các loại ung thƣ đƣờng tiêu hóa và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong nếu không đƣợc chẩn đoán và điều trị sớm. UTĐTT thƣờng gặp là ung thƣ biểu mô tuyến, gây nên bởi sự phát triển bất thƣờng của các tế bào có khả năng xâm lấn hoặc lan rộng ra các bộ phận khác của cơ thể và bắt gặp ở bất cứ vị trị nào của đại trực tràng[6]. Theo nghiên cứu của Kahamoui cho thấycó 43% ung thƣ xảy ra ở vị trí của trực tràng, 25% là ở đại tràng sigma, đại tràng lên chỉ là 18%, đại tràng ngang là 9% và đại tràng xuống là 5%[32]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Các yếu tố nguy cơ ung thƣ đại trực tràng Có rất nhiều yếu tố nguy cơ gây nên bệnh UTĐTT. Dựa vào thống kê cho thấy có 2 nhóm yếu tố chính gây ra bệnh là: - Yếu tố di truyền: + Hoạt hóa các gen tiền ung thƣ, bất hoạt các gen ức chế khối u, sai hỏng trong sửa chữa ADN và di truyền gia đình. + Trong yếu tố di truyền theo gia đình, khi có thành viên trong gia đình đƣợc chuẩn đoán mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng thì nguy cơ mắc bệnh của các thành viên khác cao gấp nhiều lần so với mức trung bình, phụ thuộc vào số thành viên mắc bệnh và độ tuổi mắc bệnh. Ngoài ra, có mối liên quan giữa các hội chứng bệnh và UTĐTT: hội chứng Lynch, hội chứng Turcot, hội chứng Peutz-Jeghers sẽ dẫn đến bệnh UTĐTT[56].

- Yếu tố không di truyền[56]: + Bệnh viêm, loét đại tràng lâu ngày, các tác nhân vật lí, hóa học, chế độ ăn uống, sinh hoạt hay do lão hóa. + Nổi bật nhất với yếu tố không di truyền là thói quen ăn uống. Chế độ ăn uống ít chất xơ, giàu đạm hay thói quen sử dụng bia rƣợu, hút thuốc lá thƣờng xuyên có thể gây ra những biến đổi trong tế bào mô đại tràng dẫn đến viêm loét trực tràng và dẫn tới UTĐTT. Triệu trứng của bệnh Dựa vào các triệu chứng của UTĐTT có thể phát hiện bệnh sớm và có những biện pháp điều trị thành công.

Về mặt lâm sàng, phần lớn bệnh nhân UTĐTT không có bất kỳ triệu chứng rõ ràng nào cho đến khi bệnh tiến triển đến giai đoạn nặng, tức là xuất hiện khối u lớn hoặc thậm chí đã di căn. Ung thƣ đại trực tràng thƣờng có một số triệu chứng lâm sàng sau[54,9]: - Thay đổi thói quen trong đại tiện nhƣ: Tiêu chảy, táo bón tăng lên trong thời gian ngắn hoặc cảm giác mót rặn và nặng ở trực tràng 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] - Chảy máu trực tràng, có máu đen sẫm hoặc đỏ tƣơi trong phân - Giảm cân không rõ nguyên nhân - Thƣờng xuyên mệt mỏi 1. Phân loại ung thƣ đại trực tràng theo mô học Hệ thống phân giai đoạn TNM đƣợc phát triển và xác nhận bởi hiệp hội ung thƣ Hoa Kỳ - AJCC (Americant Joint Committee on Cancer) và liên minh kiểm soát ung thƣ quốc tế UICC (Union for International Cancer Control) công nhận làm tiêu chuẩn đánh giá các bệnh ung thƣ. Trong hệ thống phân loại TNM ở bệnh UTĐTT, mỗi khối u đƣợc phân loại dựa vào các tiêu chí sau(Bảng 1.

Bảng phân loại TNM của UICC(2002) trong ung thƣ đại trực tràng Theo khối u (T) TX Khối u không thể đo T0 Không có bằng chứng cho khối u ban đầu Tis Ung thƣ biểu mô tại chỗ T1 Khối u xâm nhập vào lớp mô liên kết dƣới niêm mạc T2 Khối u đã phát triển đến lớp cơ nằm phía dƣới của lớp dƣới niêm mạc T3 Khối u đã phát triển xuyên qua lớp cơ vào trong lớp thanh mạc T4a Khối u phát triển vào trong bề mặt của phúc mạc tạng T4b Khối u xâm lấn trực tiếp vào các cơ quan cận kề Theo hạch lympho (N) NX Không thể đánh giá N0 Không có sự di căn đến hạch lympho N1 Di căn trong 1-3 hạch N1a Di căn trong 1 hạch N1b Di căn trong 2-3 hạch N1c Khối u trong lớp dƣới thanh mạc, mạc treo hoặc mô quanh trực tràng mà không xâm lấn vào hạch lympho N2 Di căn trong từ 4 hạch lympho trở lên 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] N2a Di căn trong 4-6 hạch N2b Di căn trong 7 hạch hoặc nhiều hơn Theo di căn (M) M0 Khôngdi căn M1 Di căn xa M1a Di căn giới hạn trong một cơ quan M1b Di căn tới hơn 1 cơ quan Ngƣời ta sử dụng hệ thống phân loại này nhƣ một đánh giá chung để phân loại các giai đoạn tiến triển của bệnh UTĐTT [56]. Phân loại các giai đoạn phát triển của ung thƣ đại trực tràng Giai đoạn T N M 0 Tis No Mo I T1 No Mo T2 No Mo IIA T3 No Mo IIB T4a No Mo IIC T4b No Mo IIIA T1-T2 N1/N1c Mo T1 N2a Mo IIIB T3-T4a N1/N1c Mo T2-T3 N2a Mo T1-T2 N2b Mo IIIC T4a N2a Mo T3-T4a N2b Mo T4b N1-N2 Mo IVA T N M1a IVB T N M1b 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các chỉ thị sinh học của ung thƣ đại trực tràng UTĐTT là một trong những ung thƣ đƣờng tiêu hóa có tiên lƣợng tốt. Tuy nhiên, nếu phát hiện muộn thì cũng giống nhƣ tất cả các loại ung thƣ khác, khả năng điều trị ít hiệu quả.

Ngày nay, sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là các kỹ thuật sinh học phân tử đã góp phần chẩn đoán, phân biệt, phát hiện sớm và theo dõi hiệu quả điều trị UTĐTT. Để chuẩn đoán bệnh ở các giai đoạn đầu một cách đơn giản, ngành y học đã sử dụng các chỉ thị sinh học (biomaker). Chỉ thị sinh học đƣợc sử dụng đánh giá trạng thái sinh học của các mô, đánh giá khách quan về các chỉ số trong quá trình sinh học bình thƣờng, quá trình gây bệnh[46]. Các chỉ thị sinh học thƣờng dùng cho ung thƣ đại trực tràng là: Chỉ thị sinh học trong phân: Xét nghiệm máu trong phân (FOBT): Phƣơng pháp khá đơn giản, không tốn kém.