MỞ ĐẦU 1/Lý do chọn đề tài Sắc ký được ra đời từ năm 1903 bởi nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet), đến nay sắc ký đã phát triển mạnh mẽ trở thành môn học quan trọng của hoá phân tích hiện đại và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Nhờ có khả năng tách riêng rẽ các chất cho kết quả phân tích định tính hoặc định lượng đều rõ ràng. Sắc ký tham gia vào phân tích các mẫu phức tạp trong các lĩnh vực từ sản xuất nông nghiệp, công nghiệp đến các hoạt động phục vụ đời sống như chữa bệnh, điều tra hình sự. Ngoài ra sắc ký còn là công cụ phục vụ đắc lực cho nghiên cứu khoa học.
Thí dụ trong sản xuất nông nghiệp, sắc ký góp phần tách và định lượng các chất dinh dưỡng trong sản phẩm, phân tích các độc tố, như các hóa chất bảo vệ thực vật, các kim loại nặng trong thực phẩm, nước uống… Trong chữa bệnh, sắc ký góp phần xét nghiệm mẫu bệnh phẩm, thí dụ phân tích thuốc kháng sinh, phân tích các dược phẩm, dược liệu… Sắc ký cũng phục vụ đắc lực trong quan trắc môi trường, đánh giá tác động của môi trường tới đời sống con người. Thí dụ tách và định lượng hàm lượng các chất độc hại trong không khí. Vậy dạy cho học sinh THPT kiến thức về sắc ký là rất cần thiết, tuy nhiên chương trình môn Hoá Học ở bậc học phổ thông của nước ta hiện nay chưa có phần nào nói về sắc ký. Có lẽ khó khăn là các thí nghiệm thực hành về sắc ký thường khó làm, cần nhiều máy móc hỗ trợ hiện đại đắt tiền, thời gian làm thí nghiệm lâu có trường hợp diễn ra trong thời gian dài, nhiều hoá chất khó kiếm đắt tiền không phù hợp với trường THPT.
Với mong muốn có thể đưa nội dung sắc ký vào chương trình Hoá Học phổ thông ở nước ta Phó giáo sư - Tiến sĩ, Nhà giáo ưu tú Đào Hữu Vinh, đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện luận văn “Áp dụng phƣơng pháp sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng vào giảng dạy hoá học phổ thông”. 2/ Mục đích nghiên cứu Khảo sát để lựa chọn ra những thí nghiệm sắc ký có thể áp dụng dạy cho học sinh phổ thông. Nghĩa là thiết bị, hoá chất, đơn giản, ít hoặc không độc hại, dễ tìm kiếm ở phòng thí nghiệm của một trường THPT ở Việt Nam. Chọn thành phần pha động, pha tĩnh và chất phân tích sao cho thí nghiệm dễ làm, thời gian cho một nghiệm chỉ khoảng từ 5 đến 15 phút nhưng vẫn đảm bảo chuyển tải TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 5 được cho học sinh những kiến thức cơ bản nhất về bản chất, nguyên lý và ứng dụng của sắc ký.
3/ Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Kiến thức về sắc ký là khá rộng, nhưng do mục tiêu đã nêu trên hơn nữa thời gian nghiên cứu và khả năng của bản thân có hạn, nên tôi chỉ tập trung nghiên cứu khảo sát việc thay đổi các hoá chất dụng cụ để thực hiện thí nghiệm sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy ở mức tách định tính các chất màu trong lá xanh (chlorophyl, carotenoit), một số ion kim loại thông dụng có màu đặc trưng (Fe3+, Cu2+, Co2+, Ni2+). 4/ Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu các tài liệu về cơ sở lý thuyết chung của sắc ký, tài liệu hướng dẫn thực hành sắc ký. Làm thực nghiệm với sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy; nghiên cứu sự thay đổi thành phần pha động, pha tĩnh và chất phân tích để tìm ra những thí nghiệm phù hợp với mục đích đã nêu. TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 6 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.
Sơ lƣợc về lịch sử phát triển sắc ký [15, 18, 19] Năm 1903 nhà thực vật học người Nga Michael Tsvet đã dùng cột nhôm oxit (có tài liệu nói cột canxi cacbonat) làm pha tĩnh và pha động là ete dầu hoả tách thành công chlorophyl từ lá cây. Ông đã giải thích hiện tượng bằng ái lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặt tên phương pháp này là phương pháp sắc ký (chromatography), sắc ký nghĩa là ghi màu vì đã tách được những chất có màu. Tuy nhiên phát minh của Tsvet gần như bị lãng quên trong một thời gian dài. Mãi tới năm 1931 sau khi Vinterstin và Lederer dùng phương pháp của Tsvet tách caroten thô thành và caroten và nhận thấy giá trị của phương pháp về phương diện điều chế, phương pháp sắc ký mới bắt đầu được chú ý đúng mức và phát triển nhanh chóng.
Đặc biệt trong những năm 30 của thế kỷ XX, nhu cầu về phân tích và tách hỗn hợp các chất trở nên rất cấp thiết nên sắc ký phát triển nhanh chóng. Năm 1938 Izmailov và Shraiber đặt nền móng đầu tiên cho sắc ký lớp mỏng và sau đó những công trình của Stahl đã làm cho sắc ký lớp mỏng phát triển nhanh chóng và ứng dụng rất rộng rãi. Năm 1941 Tiselius phát triền các kỹ thuật tách sắc ký và chỉ ra các phương pháp phân tích tiền lưu, phân tích thế đẩy và phân tích rửa giải. Cũng trong năm 1941 sắc ký phân bố ra đời khi Martin và Synge đề xuất phương pháp tách không phải theo ái lực của các cấu tử đối với chất hấp thụ, mà do sự phân bố khác nhau của các cấu tử giữa hai chất lỏng không trộn lẫn.
Các tác giả trên đã phát triển một dạng mới của sắc ký phân bố: sắc ký giấy. Do có công đóng góp các tác giả đã nhận giải Nobel năm 1952. Vào năm 1941 – 1942, Martin đã làm một bước ngoặt lớn trong sắc ký do dùng sắc ký giấy tách thành công các ancaloit chiết được từ các cây thuốc. Năm 1952, Martin công bố công trình đầu tiên về sắc ký khí dựa trên sự phân bố của chất giữa pha tĩnh là chất lỏng và pha động là chất khí.
Vào những năm 1970, sắc ký khí phát triển, cùng với nó, sắc ký lỏng cũng nâng cao hiệu quả của phương pháp, các vật liệu làm pha tĩnh không ngừng được cải tiến, từ đó hiệu lực của các phương pháp sắc ký đạt được những thành tựu đáng kể như tách được các hỗn hợp các chất cực kỳ giống nhau (thí dụ các nguyên tố đất hiếm), các ancaloit, các hiđrocacbon trong các mẫu dầu…Ngày nay trong sắc ký lỏng chất nhồi được cải tiến, kích thước hạt giảm xuống tới 1,5 – 1,7 m, có khả năng chịu áp suất và nhiệt độ tốt, hình thành các phương pháp cực kỳ hiệu quả (Ultra Performance Liquid Chromatography – UPLC) có thể tách nhanh các hợp chất khó trong thời gian vài chục giây. Ngoài ra phương pháp siêu tới hạn TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 7 (Supercritical fluid chromatography – SFC) cũng được phát triển để phù hợp với các chất có khối lượng phân tử lớn. Vào cuối thể kỷ trước, một phương pháp tách mới được đời là các phương pháp điện di, đặc biệt là điện di mao quản. Phương pháp có hiệu lực tách rất cao, nhanh, có thể tách được nhiều các đối tượng vô cơ và hữu cơ.
Năm 1994, những máy điện di mao quản đầu tiên được bán trên thị trường, được sử dụng rất có hiệu quả để phân tích các dược phẩm, các mẫu sinh học, đặc biệt là các mẫu cực kỳ khó như protein, enzim… Sự phát triển phong phú của sắc ký đã làm cho danh từ “sắc ký” không còn đúng theo ý nghĩa ban đầu của nó. Tuy nhiên tất cả các phương pháp sắc ký đều có những nét chung nhất: quá trình tách dựa trên sự chuyển dịch của hỗn hợp chất phân tích qua lớp chất bất động (pha tĩnh) là chất rắn hoặc chất lỏng mang trên chất rắn hoặc giấy và sự chuyển dịch đó được thực hiện bằng một chất khí hoặc chất lỏng (pha động). Định nghĩa, nguyên tắc và phân loại các phƣơng pháp sắc ký [10, 15] 1. Định nghĩa Tính đa dạng muôn màu của phương pháp sắc ký đã làm nảy sinh nhiều định nghĩa, nhiều tên gọi trong lĩnh vực sắc ký.
Nhưng định nghĩa được nhiều nhà hoá học thừa nhận là hoàn chỉnh nhất, tổng quan nhất như sau: Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh. - Một hệ sắc ký bao gồm: chất phân tích, pha tĩnh và pha động. Nguyên tắc của sắc ký Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: một pha thường cố định gọi là pha tĩnh(stationary phase) và một pha chuyển động gọi là pha động (mobile phase). Khi cho mẫu chứa hỗn hợp chất cần phân tích đã được hoà tan trong dung môi thích hợp (pha động) di chuyển qua pha tĩnh do sự phân bố các chất cần phân tích giữa hai pha là khác nhau nên tốc độ di chuyển của chúng khác nhau và sẽ được tách khỏi nhau sau một thời gian nhất định.
Phân loại các phƣơng pháp sắc ký 1. Phân loại theo trạng thái liên hợp của pha động và pha tĩnh - Theo cách phân loại này tất cả các phương pháp sắc ký được phân thành hai nhóm lớn theo pha động: sắc ký lỏng và sắc ký khí. Đây là cách phân loại lôgic nhất và được sử dụng rộng rãi. - Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng (được mang trên chất rắn).
Phân loại theo cơ chế của quá trình tách TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 8 Phương pháp phân loại này dựa trên cơ chế của quá trình hấp thụ - giải hấp thụ, nghĩa là theo tương tác của chất được sắc ký với pha động. Có bốn cơ chế sắc ký chính sau đây. Sắc ký hấp phụ. Sự tách do ái lực khác nhau của các chất đối với chất hấp phụ rắn (pha tĩnh).
Đối với các chất hấp phụ phân cực, ái lực đó chủ yếu do tương tác của các cực. Do đó các nhóm phân cực trong phân tử ảnh hưởng tới kết quả tách mạnh hơn các mạch hiđrocacbon không phân cực. Sắc ký phân bố. Trong phương pháp này người ta lợi dụng sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha tĩnh lỏng (được giữ bởi chất mang rắn) và pha động.
Trong sắc ký lỏng pha tĩnh thường phân cực hơn pha động, tuy nhiên cũng có trường hợp ngược lại. Về nguyên tắc có thể có rất nhiều tổ hợp hai pha lỏng. Tuy nhiên trong thực tế số đó bị hạn chế rất lớn. Như chúng ta đã biết qui tắc về độ tan “các chất giống nhau hoà tan vào nhau”, do đó độ phân cực của các chất được sắc ký cũng như của các pha tĩnh và pha động có ảnh hưởng tới quá trình tách.