MỞ ĐẦU Hiện nay, có nhiều phƣơng pháp điều trị ung thƣ đã và đang đƣợc sử dụng trên thế giới nhƣ: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, liệu pháp nội tiết, liệu pháp miễn dịch, liệu pháp tế bào gốc, điều trị cá thể hóa, điều trị hƣớng đích, Tuy nhiên, mỗi phƣơng pháp đều tồn tại những tác dụng phụ nhất định. Để ngăn chặn sự phát triển và lây lan của khối u, hóa trị là biện pháp hiệu quả cả ở giai đoạn sớm và giai đoạn muộn của ung thƣ. Việc nghiên cứu phát triển các thuốc chống ung thƣ mới với giá thành rẻ đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học. Prodigiosin (Pg) là chất chuyển hóa thứ cấp có màu đỏ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét, ức chế miễn dịch và ngăn cản sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học cũng nhƣ tiềm năng ứng dụng Prodigiosin từ Serratia marcescens trong phát triển thuốc.Tuy nhiên, ở Việt Nam chƣa có nghiên cứu chuyên sâu nào về ảnh hƣởng của Pg lên mạng lƣới nội chất trong tế bào, cũng nhƣ sự đáp ứng của tế bào trong môi trƣờng có chứa Pg. Chính vì vậy tôi lựa chọn đề tài luận văn “Tinh sạch và đánh giá ảnh hƣởng của hợp chất Prodigiosin từ chủng Serratia marcescens đến mạng lƣới nội chất tế bào”.Nghiên cứu này đƣợc tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106. Đề tài luận văn này nhằm mục đích sản xuất, tinh sạch đƣợc prodigiosin từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens có độ tinh sạch cao, đánh giá ảnh hƣởng của Pg này đến lƣới nội chất tế bào. Trong các nghiên cứu trƣớc đây, chúng tôi đã đánh giá hoạt tính sinh học của Pg tách chiết từ chủng Serratia marcescens, kết quả cho thấy Pg gây độc dòng tế bào ung thƣ phổi LU – 1 với giá trị IC50 = 1,5 g/mL.
Bằng cách tiếp cận nghiên cứu cơ chế phân tử tác động của Pg đối với lƣới nội chất tế bào nấm men chúng tôi sẽ tìm đƣợc cơ chế phân tử của Pg đối với tế bào ung thƣ và tế bào thƣờng. Việc sử dụng sinh vật mô hình là nấm men Saccharomyces cerevisiae sẽ mang lại khả năng thành công cao hơn bởi hơn 40% trình tự gen bảo tồn ở nấm men đƣợc dự đoán là có mặt trong hệ gen 2 ngƣời, các cơ chế kiểm soát chu kỳ tế bào ở nấm men hoặc trong các tế bào khối u tồn tại tƣơng tự với nhiều hơn hoặc ít hơn các chức năng trong tế bào con ngƣời.Các kết quả nghiên cứu này sẽ góp phần hiểu rõ cơ chế tác động của Pg đến tế bào nấm men, từ đó có cơ sở để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế ảnh hƣởng của Pg đến tế bào động vật. Toàn bộ thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Serratia marcescens VÀ HỢP CHẤT PRODIGIOSIN 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens 1.1 Đặc điểm Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae.“Chúng có mặt ở trong đất, nƣớc, thực vật và trong cơ thể động vật.Trong các loài vi khuẩn thì S. marcescens là loài có khả năng sinh tổng hợp Pg đƣợc biết đến sớm nhất và đƣợc tìm hiểu từ rất sớm. Trong mƣời loài Serratia thì chỉ có ba loài có khả năng sinh tổng hợp Pg là S. rubidaea và một số nhóm S.
marcescens hô hấp tùy tiện, do đó nó có thể sinh Pg cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí.Tuy nhiên, sắc tố đỏ chỉ xuất hiện trong một phần nhỏ của dịch nuôi cấy riêng biệt của các chủng S. Mỗi chủng có khả năng sảnxuất sắc tố khác nhau và phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ môi trƣờng nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, pH, cacbon, nitơ và các muối vô cơ.Chủng vi khuẩnSerratia marcescenskhi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng (NA)có màu đỏ, tròn, lồi, bề mặt bóng (hình 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc chủng Serratia marcescensVTCC 910027 4 1.2 Sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens Khả năng sản xuất Pg của S. marcescens tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy, nguồn cacbon, nguồn nitơ, pH, nhiệt độ. marcescens sinh Pg trong môi trƣờng pH axit ở nhiệt độ 28oC và làm môi trƣờng chuyển sang màu đỏ (Hình 1.
marcescens không sinh sắc tố đỏ.” Sinh tổng hợp Pg bởi S. marcescens MSK1 đƣợc cảm ứng chỉ bởi methionine hoặc cysteine với sự có mặt của glucose. “Sinh tổng hợp Pg đƣợc tối ƣu đạt năng suất cao nhất trong môi trƣờng chứa 0,45 manose, 0,01% methionine, 0,03% cysteine và 0,1% amonium chloride, pH 8 ở 28oC dƣới điều kiện nuôi lắc 120 vòng/ phút trong 24 giờ [1].” Shahitha và Poornima (2012)đã sử dụng các môi trƣờng khác nhau và các nhiệt độ khác nhau để nghiên cứu sinh tổng hợp Pg từ S.“Sinh tổng hợp Pg cao nhất đƣợc quan sát thấy ở môi trƣờng bột hạt lạc (37,6mg/ml) và môi trƣờng bột hạt vừng (16,5mg/ml)khi so sánh với môi trƣờng canh thang dinh dƣỡng (NB) (0,51mg/ml) và môi trƣờng canh thang dinh dƣỡng có bổ sung glycerol (0,3mg/ml) ở 28oC, môi trƣờng canh thang dinh dƣỡng có bổ sung maltose (1,82mg/ml). Trong số dầu khác nhau, dầu lạc cho năng suất sắc tố cao (2,72mg/ml)[2].” Môi trƣờng canh thang dinh dƣỡng có bổ sung glycerol đƣợc chọn là môi trƣờng tổng hợp tốt nhất.”Hiệu quả của các thành phần môi trƣờng và các thông số quá trình khác nhau nhƣ nguồn cacbon và nitơ, nhiệt độ, pH, thời gian nuôi lắc và các chất bổ sung khác đã đƣợc khảo sát.
Hàm lƣợng Pg lớn nhất đƣợc sinh tổng hợp ở 25oC, pH 7 và thời gian nuôi lắc 48 giờ. Bổ sung thêmmôi trƣờng với maltose và peptone cho năng suất Pg cao nhất. Ngoài ra, việc bổ sung thêm các chất nhƣ muối sắt, phosphat vô cơ cũng cho các kết quả khả quan”[3]. marcescens sinh tổng hợp Pg tốt nhất ở nhiệt độ28oC hoặc 30oC,“thỉnh thoảng chúng sinh tổng hợp Pg ở nhiệt độ thấp hơn nhƣ ở 25oC [3].” Thời gian nuôi cấy các chủng S.
marcescens sinh tổng hợp Pg tối ƣu ngắn nhất “có thể là 24 giờ nhƣ S. marcescens MSK1[1], 48 giờ nhƣ S. marcescens S11[4]; 36 giờ nhƣ S. marcescens MBB05[5]; dài hơn là 72 giờ nhƣ S.
marcescens[7], có thể tới 84 giờ nhƣ S.” Với các thành phần môi trƣờng và các yếu tố nuôi cầy tối ƣu,“các chủng S. marcescens đƣợc phân lập từ các nguồn khác nhau cho năng suất sinh tổng hợp Pg khác nhau. Chẳng hạn chủng S. marcescens 1,84527 mg/l [7], chủng S.
marcescens SR1 là 0,7651g/l [8].” Pg đƣợc tổng hợp thông qua hai con đƣờng bao gồm: MBC (4- Methoxy-2,2'-bipyrrole-5-carboxaldehyde) và MAP (2 – methyl – 3 – n – amylpyrrole) [9].Có hơn 30 gen liên quan đến sinh tổng hợp Pg ở vi khuẩn Serratia sp. ATCC 39006,điều này cho thấy lợi thế sản xuất Pg của chúng so với các vi sinh vật sản xuất Pg khác. Mỗi chủng vi khuẩn mang các gen tham gia vào quá tình sinh tổng hợp Pg khác nhau (hình 1.2 Các gen tham gia sinh tổng hợp prodigiosin ở một số chủng vi khuẩn[10].2 Nguồn gốc, đặc điểm của prodigiosin Prodigiosin (Pg, PubChem CID: 5351169),“là chất chuyển hóa thứ cấp có màu đỏ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét, ức chế miễn dịch và chống ung thƣ[11,12]đƣợc sản xuất bởi vi khuẩn Serratia marcescens, Rubidaea, Vibrio psychroerythrous, gazogenes, Pseudomonas magneslorubra, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra[13,14]. marcescens có hiệu suất sản xuất Pg cao nhất và đƣợc nghiên cứu rộng rãi tại 6 nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới.
Pg đóng vai trò nhƣ một chất chuyển hóa thứ cấp của S. marcescens, chức năng của nó đối với vi khuẩn vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ. Một số nghiên cứu cho rằng Pg liên quan đến hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm, ảnh hƣởng đến quá trình trao đổi chất và tăng cƣờng sự bám dính vi khuẩn lên các bề mặt dẫn tới tăng cƣờng phát tán vi khuẩn.” Ba thành viên của nhóm“prodiginine bao gồm prodigiosin, undecylprodigiosin (UP) và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG HCl), có đặc tính ức chế miễn dịch và tác động đến tự chết tế bào ung thƣin vitro và in vivo. Hiệu ứng độc tế bào của chúng là do sự hiện diện của nhóm thế C – 6 methoxy.
Vòng A – pyrolđóng một vai trò quan trọng trong cả hai hoạt động nuclease và độc tế bào của Pg [15].” Nhóm sắc tố prodiginine đƣợc đặc trƣng bởi cấu trúc ba vòng pyrol[16]. Cấu trúc hóa học của Pg đã đƣợc làm sáng tỏ bởi nhóm nghiên cứu của Wasserman (1960) và Hlden (1962)[10].3 Cấu trúc phân tử prodigiosin gồm ba vòng pyrol đặc trƣng[17]. Pg“đƣợc báo cáo là có đƣờng cong quang phổ khác nhau ở pH axit và kiềm. Trong môi trƣờng axit, Pg có màu đỏ, đƣờng cong quang phổ từ 510 - 535 nm(đỉnh phổ).
Trong môi trƣờng kiềm Pg biểu hiện màu cam, đỉnh phổ 470 nm. Pg không tan trong nƣớc, tan trong alcohol, ete, methanol, acetone, chloroform, DMSO và dễ bị phân hủy bởi ánh sáng.3 Tinh sạch và xác định cấu trúc của prodigiosin Có nhiều phƣơng pháp chiết và tinh sạch prodigiosin khác nhau.“Song và cộng sự (2006) đã chiết và tinh sạch Pg từ chủng S. KH – 7 95 từ chất hấp phụ bên trong sử dụng methanol đã axit hóa và tách pha với nƣớc và chloroform. Tiếp theo, chất đƣợc tinh sạch bằng sắc ký silica gel và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [18].Chất tinh khiết Pg đƣợc nhận dạng cấu trúc bằng phân tích NMR.” Ramina và Samira (2009) đã tinh sạch prodigiosin từ dịch chiết thô chủng S.
marcescens UCP1549 bằng phƣơng pháp sắc ký cột sử dụng hệ dung môi chloroform :methanol tỷ lệ 9:1.“Pg đƣợc tinh chế qua cột sắc ký (50x1cm) sử dụng silica gel làm chất hấp phụ. Sau đó đƣợc hòa vào chloroform (100ml), rồi loại dung môi bằng cô quay. Sản phẩm đƣợc nhận dạng bằng đo quang phổ UV ở bƣớc sóng 700 - 200nm trong 95% ethanol và sau đó khối phổ sử dụng methanol. Kết quả đo khốiphổ cho thấy khối lƣợng phân tử của Pg từ chủng S.
marcescens đƣợc tách chiết bằng acetone và ethyl acetate, tinh chế bằng dung môi hữu cơ và sắc ký lớp mỏng TLClà 324 Da [19].” Sắc“tố đỏ từ chủng S. marcescens SU – 10hòa tan trong nƣớc và đƣợcchiết bằng ethanol và HCl (9,5:0,5) hay với acetone và ethyl acetate (1:1). Pg đƣợc tiếp tục tinh sạch bằng dung môi hữu cơ và sắc ký lớp mỏng TLC. Hệ dung môi ethanol: HCl đƣợc cho là có hiệu quả nhất để chiết Pg[6].
Pg đã đƣợc tinh sạch bằng sắc ký silica gel và đƣợc phân tích bằng H - NMR quang phổ.4 Hoạt tính sinh học của prodigiosin 1.1 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Hoạt tính kháng sinh của Pg đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1946.