Tổng quan nghiên cứu

Prodigiosin (Pg) là một hợp chất chuyển hóa thứ cấp có màu đỏ được sản xuất bởi vi khuẩn Serratia marcescens, nổi bật với các hoạt tính sinh học đa dạng như kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét, ức chế miễn dịch và đặc biệt là khả năng gây độc tế bào ung thư. Trên thế giới, Pg đã được nghiên cứu rộng rãi với tiềm năng ứng dụng trong phát triển thuốc điều trị ung thư và công nghệ thực phẩm. Tại Việt Nam, nghiên cứu chuyên sâu về ảnh hưởng của Pg đến mạng lưới nội chất tế bào vẫn còn hạn chế, đặc biệt là cơ chế phân tử tác động của Pg lên tế bào ung thư và tế bào bình thường.

Luận văn thạc sĩ này nhằm mục tiêu tinh sạch hợp chất prodigiosin từ chủng Serratia marcescens với độ tinh khiết cao và đánh giá ảnh hưởng của Pg đến mạng lưới nội chất tế bào, sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae làm mô hình sinh học. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2019-2020 tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Việc đánh giá tác động của Pg lên mạng lưới nội chất tế bào giúp làm sáng tỏ cơ chế stress nội bào và quá trình apoptosis, từ đó mở ra hướng phát triển thuốc điều trị ung thư mới có hiệu quả cao và ít tác dụng phụ.

Theo ước tính, hàm lượng Pg thu được từ quá trình chiết xuất đạt khoảng 600 mg/L môi trường nuôi cấy, với độ tinh khiết gần 99% sau quá trình tinh sạch. Nghiên cứu góp phần nâng cao hiểu biết về cơ chế tác động của Pg, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng hợp chất này trong công nghiệp dược phẩm và sinh học phân tử.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Mạng lưới nội chất (Endoplasmic Reticulum - ER) và stress ER: ER là bào quan quan trọng trong tổng hợp và gấp nếp protein. Stress ER xảy ra khi có sự tích tụ protein không gấp nếp đúng cách, kích hoạt phản ứng Unfolded Protein Response (UPR) nhằm duy trì cân bằng nội bào hoặc dẫn đến apoptosis nếu stress kéo dài.

  • Con đường tín hiệu UPR: Bao gồm ba nhánh chính là IRE1, PERK và ATF6. Trong đó, IRE1 có hoạt tính kinase và endoribonuclease, kích hoạt cắt nối mRNA Hac1 (ở nấm men) hoặc Xbp1 (ở động vật có vú), điều hòa biểu hiện các gen chaperone và enzyme gấp protein.

  • Cơ chế tác động của prodigiosin: Pg gây stress ER bằng cách tương tác với protein màng IRE1, kích hoạt con đường UPR, tăng hoạt tính β-galactosidase và biểu hiện mRNA Hac1, dẫn đến apoptosis qua các con đường JNK, caspase-3 và giảm hoạt động AKT/mTOR.

  • Sinh vật mô hình Saccharomyces cerevisiae: Với hơn 40% trình tự gen bảo tồn so với người, nấm men được sử dụng để nghiên cứu cơ chế phân tử stress ER và apoptosis, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí nghiên cứu.

Các khái niệm chính bao gồm: stress lưới nội chất, phản ứng UPR, hoạt tính β-galactosidase, mRNA Hac1, apoptosis, và prodigiosin.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Chủng vi khuẩn Serratia marcescens VTCC 910027 và nấm men KMY 1516 được lưu giữ tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

  • Quy trình thu sinh khối và chiết xuất Pg: Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường NB bổ sung 2% dầu vừng ở 28°C, 300 vòng/phút trong 72 giờ. Pg được chiết xuất bằng dung môi acetone với tỷ lệ tế bào:acetone 1:1 (w/v), lắc 3 giờ, ly tâm và rửa bằng ethyl acetate để loại bỏ tạp chất.

  • Tinh sạch Pg: Sử dụng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi toluen:ethyl acetate (9:1) để loại bỏ tạp chất và thu nhận Pg tinh khiết. Độ tinh khiết được xác định bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và phổ proton cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR).

  • Đánh giá ảnh hưởng của Pg lên mạng lưới nội chất: Sử dụng nấm men KMY 1516 với hệ thống báo hiệu β-galactosidase để đo hoạt tính enzyme phản ánh mức độ stress ER. Mức độ biểu hiện mRNA Hac1 được xác định bằng phương pháp reverse transcription-PCR và điện di agarose.

  • Phân tích số liệu: Cỡ mẫu gồm nhiều lần lặp thí nghiệm để đảm bảo tính chính xác. Phương pháp chọn mẫu là lấy mẫu ngẫu nhiên từ các lô nuôi cấy. Phân tích dữ liệu sử dụng các phần mềm thống kê chuyên dụng, biểu diễn kết quả bằng biểu đồ hoạt tính β-galactosidase và sắc ký đồ HPLC.

  • Timeline nghiên cứu: Từ tháng 1/2019 đến tháng 12/2020, bao gồm các giai đoạn thu sinh khối, chiết xuất, tinh sạch, đánh giá hoạt tính và phân tích dữ liệu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Hệ dung môi acetone tối ưu cho chiết xuất Pg: So sánh với hệ dung môi ethyl acetate + 1% HCl, acetone cho hiệu quả chiết xuất cao hơn gấp đôi, đạt khoảng 600 mg/L môi trường nuôi cấy. Dịch chiết bằng acetone có lớp dịch trong rõ ràng, thuận lợi cho quá trình tinh sạch.

  2. Hệ dung môi toluen:ethyl acetate (9:1) phù hợp nhất cho tinh sạch Pg: Qua sắc ký lớp mỏng (TLC), hệ dung môi này phân tách rõ ràng các hợp chất tạp, giúp thu được Pg tinh khiết với Rf khoảng 0,125. Tỷ lệ dung môi khác như 4:1 hoặc 7:3 làm giảm hiệu quả phân tách.

  3. Độ tinh khiết Pg đạt gần 99% sau tinh sạch: Kết quả sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cho thấy mẫu Pg tinh sạch có một peak duy nhất trùng với chuẩn Pg. Phổ 1H NMR xác nhận cấu trúc đặc trưng của Pg với các tín hiệu proton phù hợp, không có tạp chất.

  4. Pg gây stress mạng lưới nội chất tế bào nấm men: Hoạt tính β-galactosidase tăng theo hàm lượng Pg, đạt 60,22% so với đối chứng dương ở 0,2 μg/ml Pg, chứng tỏ Pg kích hoạt protein màng Ire1 và gây stress ER. Mức độ biểu hiện mRNA Hac1s cũng tăng rõ rệt theo nồng độ Pg, xác nhận sự kích hoạt con đường UPR.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy acetone là dung môi chiết xuất Pg hiệu quả hơn ethyl acetate + 1% HCl, phù hợp với nghiên cứu của các nhà khoa học trước đây. Việc lựa chọn hệ dung môi toluen:ethyl acetate (9:1) giúp tinh sạch Pg đạt độ tinh khiết cao, đảm bảo chất lượng cho các thí nghiệm sinh học tiếp theo.

Ảnh hưởng của Pg lên mạng lưới nội chất được thể hiện qua tăng hoạt tính β-galactosidase và biểu hiện mRNA Hac1, tương tự như các nghiên cứu quốc tế về stress ER do Pg gây ra trên tế bào ung thư. Stress ER kéo dài kích hoạt con đường apoptosis qua các protein như CHOP, JNK và caspase-3, phù hợp với cơ chế gây chết tế bào ung thư đã được báo cáo.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hoạt tính β-galactosidase theo nồng độ Pg và sắc ký đồ HPLC thể hiện độ tinh khiết Pg. Bảng so sánh hàm lượng Pg chiết xuất bằng các dung môi cũng minh họa hiệu quả chiết xuất.

Nghiên cứu góp phần làm rõ cơ chế phân tử tác động của Pg lên mạng lưới nội chất, mở rộng hiểu biết về tiềm năng ứng dụng Pg trong điều trị ung thư hướng đích.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất và tinh sạch Pg: Áp dụng hệ dung môi acetone cho chiết xuất và toluen:ethyl acetate (9:1) cho tinh sạch để nâng cao hiệu suất và độ tinh khiết Pg, giảm chi phí sản xuất. Thời gian thực hiện: 6 tháng. Chủ thể: các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học.

  2. Nghiên cứu sâu cơ chế tác động của Pg trên tế bào động vật và người: Sử dụng mô hình tế bào ung thư người để khảo sát chi tiết con đường stress ER và apoptosis do Pg gây ra, nhằm phát triển thuốc điều trị ung thư mới. Thời gian: 12-18 tháng. Chủ thể: các viện nghiên cứu y sinh.

  3. Phát triển sản phẩm thuốc điều trị ung thư dựa trên Pg: Tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của Pg, hướng tới ứng dụng trong điều trị ung thư đa dạng. Thời gian: 3-5 năm. Chủ thể: công ty dược phẩm, viện nghiên cứu.

  4. Ứng dụng Pg trong công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu bao gói và bảo quản Pg để sử dụng làm chất màu tự nhiên trong thực phẩm, tăng giá trị sản phẩm và đáp ứng nhu cầu thị trường. Thời gian: 1 năm. Chủ thể: doanh nghiệp công nghệ thực phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và dược học: Nắm bắt quy trình chiết xuất, tinh sạch và đánh giá sinh học của prodigiosin, phục vụ phát triển thuốc điều trị ung thư.

  2. Chuyên gia y sinh và ung thư học: Hiểu rõ cơ chế stress ER và apoptosis do Pg gây ra, hỗ trợ nghiên cứu thuốc hướng đích và liệu pháp điều trị mới.

  3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và dược phẩm: Áp dụng quy trình sản xuất Pg tinh khiết, phát triển sản phẩm thuốc và chất màu tự nhiên.

  4. Sinh viên và học viên cao học ngành sinh học phân tử, công nghệ sinh học: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sắc ký và phân tích sinh học trong nghiên cứu hợp chất sinh học.

Câu hỏi thường gặp

  1. Prodigiosin là gì và có tác dụng gì?
    Prodigiosin là hợp chất chuyển hóa thứ cấp màu đỏ do Serratia marcescens sản xuất, có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế miễn dịch và gây độc tế bào ung thư, được nghiên cứu để phát triển thuốc điều trị ung thư.

  2. Tại sao chọn nấm men Saccharomyces cerevisiae làm mô hình nghiên cứu?
    Nấm men có hệ gen nhỏ, thời gian sinh trưởng nhanh, hơn 40% gen bảo tồn với người, giúp nghiên cứu cơ chế phân tử stress ER và apoptosis tiết kiệm thời gian, chi phí và có tính ứng dụng cao.

  3. Phương pháp chiết xuất prodigiosin hiệu quả nhất là gì?
    Chiết xuất bằng dung môi acetone cho hiệu quả cao hơn ethyl acetate + 1% HCl, thu được hàm lượng Pg khoảng 600 mg/L môi trường nuôi cấy, thuận lợi cho quá trình tinh sạch.

  4. Làm thế nào để đánh giá mức độ stress mạng lưới nội chất do prodigiosin gây ra?
    Đo hoạt tính β-galactosidase trong tế bào nấm men có hệ thống báo hiệu Hac1, kết hợp phân tích biểu hiện mRNA Hac1 bằng RT-PCR và điện di agarose để xác định mức độ kích hoạt con đường UPR.

  5. Prodigiosin có thể ứng dụng trong lĩnh vực nào ngoài điều trị ung thư?
    Ngoài dược phẩm, Pg còn được ứng dụng làm chất màu tự nhiên trong công nghệ thực phẩm, nhờ khả năng ổn định màu sắc khi được bao gói bằng các vật liệu như kappa-carrageenan và maltodextrin.

Kết luận

  • Đã xác định được hệ dung môi acetone là tối ưu cho chiết xuất prodigiosin từ Serratia marcescens với hàm lượng khoảng 600 mg/L.
  • Hệ dung môi toluen:ethyl acetate (9:1) được lựa chọn để tinh sạch Pg, đạt độ tinh khiết gần 99% qua HPLC và phổ 1H NMR.
  • Prodigiosin kích hoạt stress mạng lưới nội chất tế bào nấm men, thể hiện qua tăng hoạt tính β-galactosidase và biểu hiện mRNA Hac1, dẫn đến apoptosis.
  • Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho phát triển thuốc điều trị ung thư hướng đích dựa trên cơ chế stress ER.
  • Đề xuất tiếp tục nghiên cứu mở rộng trên tế bào động vật và người, đồng thời phát triển quy trình sản xuất và ứng dụng Pg trong dược phẩm và công nghệ thực phẩm.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các viện nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp triển khai thử nghiệm tiền lâm sàng, tối ưu quy trình sản xuất và phát triển sản phẩm ứng dụng prodigiosin.