Chương 1 Sự cuốn của protein Trong chương này, chúng tôi sẽ giới thiệu tổng quan về sự cuốn của protein bao gồm một số kiến thức cơ sở về cấu trúc protein và hiện tượng cuốn protein, các quan điểm lý thuyết về cuốn protein, mô hình lý thuyết cho cơ chế cuốn protein, và một số kết quả thu được từ các mô hình đơn giản hóa sử dụng trong nghiên cứu cuốn protein.1 Các đặc trưng cấu trúc của protein Protein là các đại phân tử được tổng hợp bởi tế bào và chịu trách nhiệm cho hầu hết các hoạt động sinh học của tế bào. Chúng là những hợp chất hữu cơ cao phân tử (polymer) được tạo thành từ các đơn phân (monomer) gồm 20 loại amino acid khác nhau. Các amino acid trong protein chỉ khác nhau ở chuỗi bên (side chain) của chúng và liên kết với nhau thông qua các liên kết peptide tạo thành một chuỗi tuyến tính theo một trình tự cụ thể (Hình 1. Trình tự amino acid trong protein quyết định cấu trúc và chức năng của protein, và được gọi là cấu trúc bậc một của protein.
Do chứa các liên kết peptide, chuỗi amino acid trong protein còn được gọi là chuỗi polypeptide, và các đoạn protein ngắn được gọi là các peptide. Ở các điều kiện bình thường của cơ thể sống, cụ thể là trong một dung môi có pH trong vùng trung tính với nhiệt độ khoảng 20–40◦ C và dưới áp suất khí quyển, phần lớn các protein nằm ở một trạng thái có cấu trúc ba chiều gói chặt và duy nhất cho mỗi protein, được gọi là trạng thái tự nhiên (native state) hoặc trạng thái cuốn (folded state) của protein. Hoạt tính sinh học của protein chỉ được thể hiện khi nó nằm ở trạng thái cuốn. Hiện nay có khoảng hơn 130.000 cấu trúc protein và các phức hệ protein đã được xác định bởi thực nghiệm sử dụng các phương pháp như tinh thể học tia X (X-ray crystallography) và cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance – NMR), được lưu giữ trong ngân hàng dữ liệu protein PDB (Protein Data Bank).
Các cấu trúc protein có một điểm chung đó là được đặc trưng bởi các dạng cấu trúc địa phương là xoắn α, phiến β và khúc ngoặt (turn), gọi là các cấu trúc bậc hai [1].2(a–c) cho ta thấy hình ảnh cấu trúc 3 chiều của vùng B1 8 Chương 1. Sự cuốn của protein (a) (b) amino group carboxyl group (c) Peptide bonds Hình 1.1: Hình vẽ minh họa a) cấu trúc hóa học của amino acid (trừ proline), b) cấu trúc hóa học của proline (Pro) và c) chuỗi polypeptide với các amino acid liên kết với nhau bởi các liên kết peptide. Mỗi amino acid gồm một nguyên tử carbon trung tâm Cα liên kết với một nhóm amine (-NH2 ), một nhóm carboxyl (-COOH), một nguyên tử H và một chuỗi bên R. Trong amino acid proline, chuỗi bên R liên kết hóa trị với nguyên tử C trong nhóm carboxyl.
Các amino acid trong protein khác nhau bởi chuỗi bên R. của protein G, gồm một xoắn α và một phiến β tạo bởi 4 dải β.2(d–f) cho thấy một ví dụ khác với cấu trúc cuốn của protein A có dạng bó xoắn tạo bởi 3 xoắn α. Có thể thấy rằng các cấu trúc bậc hai chiếm tỷ lệ lớn trong chuỗi polypeptide. Cấu trúc trạng thái cuốn của toàn bộ protein, thường là của một chuỗi polypeptide, được gọi là cấu trúc bậc ba.
Các cấu trúc bậc ba của protein rất đa dạng, tuy nhiên khá nhiều protein có cấu trúc giống nhau hoặc gần giống nhau. Do đó người ta phân loại cấu trúc protein thành các họ (family) với số lượng họ cấu trúc khoảng vài nghìn [28]. Các protein lớn có thể có nhiều vùng cấu trúc khác nhau. Một số protein có thể gồm vài chuỗi polypeptide với các cấu trúc bậc ba riêng biệt.
Khi đó sự sắp xếp không gian của các cấu trúc bậc ba trong protein được gọi là cấu trúc bậc bốn. Một dạng cấu trúc bậc bốn phổ biến là dimer được lắp ghép bởi hai cấu trúc bậc ba của hai chuỗi polypeptide giống nhau. Các cấu trúc bậc hai xoắn α và phiến β lần đầu tiên được phát hiện bởi Linus Pauling vào năm 1951 dựa trên sự tối ưu hóa số liên kết hydro giữa các nhóm amine và carboxyl trong mạch xương sống của protein [29, 30]. Ramachandran khảo sát các góc nhị diện của mạch xương sống của chuỗi polypeptide được cho phép bởi sự chiếm giữ không gian của các nguyên tử và tìm thấy 2 vùng trên bản đồ góc nhị diện (gọi là bản đồ Ramachandran) tương ứng với các cấu trúc xoắn α và phiến β [31].
Dựa trên các phân tích thống kê, người ta phát hiện ra các amino acid Proline (Pro) và Glycine (Gly) ít tham gia các cấu trúc bậc hai, 9 Chương 1. Sự cuốn của protein (a) (b) (c) (d) (e) (f) Hình 1.2: Cấu trúc trạng thái cuốn của vùng B1 của protein G (a–c) và của protein A (d–f). Các cấu trúc protein được biểu diễn ở dạng gồm tất cả các nguyên tử (all-atom) (a,d), dạng dải (ribbon) (b,e) và dạng mạch xương sống (backbone) (c,f). Trong biểu diễn dạng dải, các xoắn α được tô màu đỏ và các phiến β được tô màu vàng.
Trong biểu diễn mạch xương sống, các amino acid khác nhau được phân biệt bằng các màu khác nhau. Các dữ liệu cấu trúc được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein (PDB) với mã PDB 1pga cho vùng B1 của protein G và 2spz cho protein A. trong khi một vài các amino acid khác có xu hướng xuất hiện nhiều hơn tại một loại cấu trúc cụ thể. Ví dụ, Alanine (Ala) xuất hiện nhiều trong các xoắn α và được gọi amino acid tạo xoắn.
Tuy vậy, hầu hết các amino acid đều có thể tham gia các cấu trúc bậc hai. Cấu trúc protein được ổn định bởi tương tác giữa các amino acid, bao gồm liên kết hydro, tương tác van der Waals, tương tác kỵ nước. Các liên kết hydro giúp ổn định các cấu trúc bậc hai trong khi tương tác kỵ nước và van der Waals có vai trò chủ yếu trong việc ổn định cấu trúc bậc ba. Trong một số protein có thể tồn tại các cầu muối (salt bridge) là liên kết ion giữa các nhóm nguyên tử mang điện tích trái dấu, và cầu lưu hình kép (disulfide bridge) là tương tác hóa trị giữa 2 nguyên tử lưu huỳnh của hai amino acid Cysteine (Cys).2 Hiện tượng cuốn protein Khi các điều kiện của môi trường như nhiệt độ, áp suất, độ pH bị thay đổi, hoặc khi các chất làm duỗi được cho thêm vào dung dịch, protein có thể bị duỗi ra thành dạng cuộn ngẫu nhiên, không giữ được cấu trúc bậc hai, bậc ba và mất 10 Chương 1.
Sự cuốn của protein đi hoạt tính sinh học vốn có. Hiện tượng duỗi protein được phát hiện lần đầu bởi Christian Anfinsen vào năm 1957. Trong thí nghiệm của mình Anfinsen đã làm thay đổi cấu trúc và làm mất hoạt tính sinh học của ribonuclease A bằng cách thêm urea vào dung dịch chứa protein. Khi các điều kiện dung môi trở lại như ban đầu, Anfinsen phát hiện ra rằng protein bị duỗi gần như ngay lập tức quay trở lại trạng thái cuốn [3].
Quá trình hồi phục này được gọi là quá trình cuốn protein (protein folding) và nó diễn ra nhanh chóng, trong khoảng thời gian từ vài phần nghìn giây đến vài giây, với hầu hết protein. Các thí nghiệm của Anfinsen dẫn đến kết luận cho rằng cấu trúc 3 chiều của protein được xác định hoàn toàn bởi trình tự amino acid [3]. Kết luận này cũng được biết đến với các tên gọi mã di truyền bậc hai và giả thuyết nhiệt động lực học. Theo giả thuyết nhiệt động lực học, trạng thái cuốn của protein phải là trạng thái có năng lượng thấp nhất để protein có thể duỗi ra và cuốn lại và trạng thái ban đầu một cách thuận nghịch.
Cấu trúc ba chiều chính xác là điều kiện cần để hầu hết các protein thực hiện chức năng sinh học của chúng. Những protein thất bại khi cuốn về cấu trúc tự nhiên trong một số trường hợp có thể dẫn tới những hệ quả độc hại. Một số loại bệnh như Alzeihmer, Parkinson, tiểu đường tuýp 2 được cho là kết quả của sự tích tụ của các protein cuốn sai thành các sợi amyloid [2]. Trong tế bào cũng tồn tại một số loại protein chức năng luôn ở trạng thái không cuốn hoặc có một phần không cuốn, được gọi là các protein có bản chất mất trật tự (intrinsically disordered proteins) [32].3 Nghịch lý Levinthal Dựa trên số lượng bậc tự do của chuỗi polypeptide, Levinthal đã ước lượng số cấu hình khả dĩ của phân tử protein và cho thấy nó là con số rất lớn.
Một chuỗi polypeptide có 100 đơn phân sẽ có 99 liên kết peptide và bởi vậy có 198 góc nhị diện φ và ψ khác nhau (φ và ψ là các góc quay xung quanh các liên kết N–Cα và Cα –C’ trong mạch xương sống của chuỗi polypeptide). Mỗi góc liên kết đó có thể ở một trong ba cấu hình ổn định thì số cấu hình của phân tử protein là 3198. Nếu quá trình cuốn là một sự tìm kiếm mù lòa (blind search) trong không gian cấu hình, protein buộc phải kiểm tra tất cả các cấu hình để tìm ra trạng thái native. Do số cấu hình rất lớn, nếu protein chỉ cần ở mỗi cấu hình trong 10−15 s thì thời gian cuốn đã dài hơn cả tuổi vũ trụ.
Trong khi đó chúng ta biết rằng protein trong tự nhiên cuốn trong thời gian từ vài mini giây tới vài giây. Nghịch lý này dẫn đến giả thuyết cho rằng quá trình cuốn phải diễn ra theo một 11 Chương 1. Sự cuốn của protein vài đường dẫn cuốn (folding pathway) xác định [5]. Các đường dẫn cuốn này chỉ bao gồm một phần rất nhỏ các cấu hình trong không gian cấu hình, do vậy protein tránh được nghịch lý Levinthal.
Giả thuyết về sự tồn tại của các đường dẫn cuốn này được coi là quan điểm cũ (old view) về cuốn protein [33].4 Phễu cuốn Theo giả thuyết nhiệt động lực học [3], trạng thái cuốn của protein là trạng thái có năng lượng thấp nhất. Quá trình cuốn do vậy là có thể coi là quá trình tiến về trạng thái năng lượng thấp nhất đó trên một địa hình năng lượng (energy landcape) xác định bởi năng lượng của tất cả các trạng thái trong không gian cấu hình. Có thể hình dung địa hình năng lượng là bề mặt năng lượng trong không gian nhiều chiều của tất cả các bậc tự do của protein. Quá trình cuốn trong nghịch lý Levinthal ứng với một địa hình năng lượng dạng sân gôn, trong đó tất cả các cấu hình có năng lượng bằng nhau ngoại trừ trạng thái cuốn có năng lượng thấp hơn (Hình 1.
Địa hình năng lượng như vậy không dẫn dắt quá trình cuốn và thời gian cuốn là vô cùng lớn.
