MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay việc sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống ngày càng được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và thực tế cho thấy chế phẩm enzyme đang được sử dụng phổ biến ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn, đặc biệt là các enzyme có khả năng phân hủy các hợp chất thơm đa vòng. Điển hình trong số đó là enzyme laccase. Laccase thuộc nhóm polyphenol oxydase do đó có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan.
Laccase còn được biết đến như một enzyme thân thiện với môi trường do trong phản ứng laccase chỉ cần lấy oxy từ không khí và sản phẩm phụ duy nhất tạo thành sau phản ứng là nước (Riva, 2006). Laccase có thể được thu từ các nguồn khác nhau như thực vật, vi khuẩn, côn trùng và phổ biến nhất là nấm. Hiện nay nhiều chủng nấm đã được phát hiện cho thấy khả năng tổng hợp laccase rất tốt như: Rhizoctonia solani (Crowe and Olsson, 2001), Trametes versicolor (Bourbonnais et al., 1995), Melanocarpus albomyces (Kiiskinen, 2005), Trametes modesta (Nyanhongo et al. Đồng thời do nấm có khả năng sinh trưởng phát triển mạnh nên còn tạo thuận lợi rất nhiều cho việc sản xuất laccase ở quy mô lớn phục vụ trong công nghiệp.
Trong những năm gần đây, laccase được ứng dụng phổ biến trên nhiều lĩnh vực khác nhau như tẩy trắng bột giấy, tẩy màu thuốc nhuộm vải, ứng dụng trong chế biến thực phẩm thông qua việc đưa vào các quy trình xử lý sinh học (Kunamneni et al. Laccase còn được sử dụng trong tổng hợp chất hữu cơ, xử lý các nguồn nước thải bị ô nhiễm bằng việc loại bỏ các hợp chất phenol, ứng dụng trong việc xử lý phụ phẩm của sản phẩm nông nghiệp để tạo nguyên liệu cho các quá trình khác. Phổ ứng dụng của laccase được mở rộng bằng việc kết hợp laccase với các mediator -chất trung gian - làm chúng có khả năng oxy hóa những hợp chất không có bản chất phenol (non-phenol). Cùng với những ứng dụng quan trọng mà enzyme laccase mang lại đồng thời góp phần mở rộng nguồn nguyên liệu sản xuất laccase và việc sử dụng chúng trong thực tế sản xuất, đặc biệt là đối với các quá trình xử lý nước thải công nghiệp, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tuyển chọn chủng nấm sinh tổng hợp laccase tại thành phố Đà Nẵng và tỉnh Thừa Thiên Huế”.
Mục tiêu đề tài Tuyển chọn được chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase từ phụ phẩm phế thải, tạo nguồn nguyên liệu ứng dụng xử lý một số chất hữu cơ gây ô nhiễm môi trường. Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về chủng nấm sinh tổng hợp laccase. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu tạo cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và ứng dụng chủng này để phát triển cho các nghiên cứu tiếp theo ở quy mô phòng thí nghiệm và ứng dụng trong thực tiễn. Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn và định danh được chủng nấm sinh tổng hợp laccase.
- Xây dựng đường cong sinh trưởng và đường cong tích lũy enzyme của chủng nấm phân lập được. - Khảo sát một số đặc điểm và động học enzyme ngoại bào. - Khảo sát khả năng phân hủy một số thuốc nhuộm tổng hợp của enzyme ở quy mô phòng thí nghiệm. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.2) thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ thể là polyphenol oxidase.
Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử. Phổ cơ chất của laccase rất đa dạng bao gồm: diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, dioxin và cả các hợp chất vô cơ như iot. Các loại enzyme laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau rất khác nhau về mức độ glycosyl hóa, khối lượng phân tử và tính chất động học (Kiiskinen, 2005). Cấu tạo của laccase a.
Khối lượng phân tử Phân tử laccase thường là monomeric protein, chỉ một số là oligomeric protein, có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60 – 90 kDa. Phần lớn laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm lượng carbonhydrate chiếm khoảng 10 – 25% (Piontek et al. Có nhiều công bố chỉ ra rằng mỗi loài nấm mốc riêng biệt có thể cho nhiều loại isozyme (bảng 1. Sự thay đổi điều kiện trong quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp laccase có thể cho những isozyme khác nhau của cùng một chủng nấm (Bollag and Leonowicz, 1984).
Khối lượng phân tử và số lượng isozym laccase từ một số chủng nấm (Bar, 2001). Chủng Số lượng Khối lượng Tài liệu tham khảo izozyme phân tử (kDa) Podospora anserina 3 70/80/390 Thurston, 1994 Neurospora crassa 1 65 Germann et al, 1988 Agaricus bisporus 2 65/100 Perry et al, 1993 Botrytis cinerea 2 72 Thurston, 1994 Phlebia radiata 1 64 Saloheimo et al, 1991 Armillaria mellea 1 80 Curir et al, 1997 Monocillium indicum 1 72 Thakker et al, 1992 3 Pleurotus ostreatus 3 54/59/57 Palmieri et al, 1997 Phanerochaete flavidoalbans 1 94 Perez et al, 1996 Rhizoctonia solani 4 50-100 Wahleitner et al, 1996 Pleurotus ostreatus RK 36 1 67 Giardina et al, 1999 Ceriporiopsis subvermispora 2 71/68 Fukishima and Kirk, 1995 Pycnoporus cinnabarinus 1 81 Eggert et al, 1996 Coriolus hirsutus 1 80 Shin and Kim, 1998 Pycnoporus cinnabarinus 1 63 Schliephake et al, 2000 Trametes villosa 1 63 Yaver et al, 1996 Trichoderma 1 71 Assavanig et al, 1992 Marasmius quercophilus 2 Farnet et al, 2000 b. Cấu trúc không gian Tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng. Những nguyên tử đồng này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử.
Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp phụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ hấp thụ điện tử, và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh (Riva, 2006). Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần (vùng) chính A, B, C có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác của laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và C. Trung tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa 1 nguyên tử đồng T1, liên kết với một đoạn peptide có 2 gốc histidine và 1 gốc cystein.
Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng. Trung tâm đồng 3 nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3. Nguyên tử đồng T2 liên kết với 2 gốc histidine bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidine bảo thủ (Kiiskinen, 2005) (hình 1. Cấu trúc bậc ba của laccase từ Hình 1.
Trung tâm hoạt động của laccase Melanocarpus albomyces (Puskas, 2013). Đặc tính của laccase a. Các chất cảm ứng và ức chế hoạt tính laccase Các nghiên cứu tăng khả năng tổng hợp laccase của vi sinh vật bằng các chất cảm ứng đã và đang trở thành một trong các biện pháp mang lại hiệu quả cao. Các nguồn này bao gồm các amino acid, các hợp chất thơm, các chất chiết từ thực vật và các kim loại trong đó có Cu2+ (Cavallazzi et al., 2005) Trong quá trình nuôi cấy, một số chất có ảnh hưởng kìm hãm đến hoạt tính của laccase.
Các chất ức chế của laccase thường là các ion nhỏ như azide, cyanide, fluoride. Các ion này sẽ liên kết vào trung tâm đồng 3 nguyên tử và cản trở các dòng điện tử đi đến các nguyên tử này. Ngoài ra, còn có các chất ức chế khác là ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA), acid béo, tropolone, acid kojic và acid coumaric, nhưng chúng chỉ có tác dụng ức chế ở nồng độ cao và các hợp chất chứa sulfhydryl như L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic acid cũng được coi là các chất ức chế laccase (Kunamneni et al. Tính đặc hiệu cơ chất Tính đặc hiệu cơ chất của laccase thường rất thấp bởi laccase có phổ cơ chất giống với tyrosinase.
Nhưng laccase có hoạt tính ortho và para-diphenol trong khi tyrosinase chỉ có hoạt tính o-diphenol. Chính vì vậy, chỉ có tyrosinase có hoạt tính cresolase (oxy hóa L-tyrosine) và chỉ có laccase có khả năng oxy hoá syringaldazine (hình 1. Quá trình oxy hóa syringaldazine thành dạng quinone tương ứng bởi laccase (Bar, 2001). Bên cạnh đó, tính đặc hiệu cơ chất thấp còn thể hiện ở dải cơ chất rộng của laccase.
Năm 1994, Thuston cho rằng hydroquynon, catechol, guacicol và 2,6- dimethoxyphenol (DMP) đều là những cơ chất tốt cho laccase. Para-phenylenediamin là cơ chất thông dụng và syringaldazine là cơ chất duy nhất chỉ dành cho laccase vì vậy laccase có thể oxy hoá cả các polyphenol methoxy và rất nhiều các hợp chất khác. Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính. Thứ nhất là sự phù hợp giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme.
Các đại lượng này phụ thuộc cấu trúc hóa học của cơ chất (Kiiskinen, 2005). Nhiệt độ và pH tối ưu Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của vi sinh vật. Nhìn chung, laccase bền ở 30 – 50°C và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 60°C (Kunamneni et al. Laccase bền nhiệt nhất được phân lập chủ yếu từ các loài thuộc prokaryote.
Ví dụ, thời gian bán hủy của laccase phân lập từ Streptomyces lavendulae là 100 phút ở 70°C (Suzuki et al., 2003) và của protein cotA từ loài Bacillus subtilis là 112 phút ở 80°C (Hullo et al. Thời gian bán hủy của laccase có nguồn gốc nấm thường là nhỏ hơn 1 giờ ở 70°C và dưới 10 phút ở 80°C (Rodríguez-Couto et al. Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4 – 6 đối với cơ chất phenolic. Khi tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính của laccase bị giảm, nguyên nhân do 6 anion nhỏ là ion hydroxide đã ức chế laccase.
Mặt khác, tăng pH còn làm giảm thế oxy hóa khử của các cơ chất phenolic do đó cơ chất phenolic dễ bị oxy hóa bởi laccase hơn. Do vậy, hoạt tính laccase ở các pH khác nhau là kết quả của hai tác dụng đối lập của pH là sự tăng chênh lệch thế oxy hóa khử laccase – cơ chất và tác dụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên tử của ion hydroxide.