Tổng quan nghiên cứu

Protease là nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide trong phân tử protein, đóng vai trò quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp như thực phẩm, dược phẩm, nông nghiệp và công nghệ sinh học. Theo ước tính, protease chiếm gần 60% thị trường enzyme toàn cầu, trong đó protease từ vi sinh vật chiếm khoảng 40%. Aspergillus oryzae, một loại nấm sợi được công nhận là an toàn (GRAS) bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ, có khả năng sinh tổng hợp nhiều enzyme ngoại bào, trong đó có protease, được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm lên men truyền thống và công nghiệp enzyme.

Tuy nhiên, giá thành chế phẩm protease còn khá cao do nhu cầu sử dụng ngày càng tăng. Việc tối ưu các điều kiện môi trường nuôi cấy để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp protease là cần thiết nhằm giảm chi phí sản xuất và nâng cao hiệu quả kinh tế. Nghiên cứu này tập trung tối ưu một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC-F-0187, sử dụng nguyên liệu rẻ và sẵn có trong nước như bột lõi ngô, bột đậu tương và cám gạo.

Phạm vi nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, trong khoảng thời gian từ tháng 6/2017 đến 7/2018. Mục tiêu chính là xây dựng quy trình sản xuất protease ngoại bào từ chủng A. oryzae VTCC-F-0187 với hiệu suất cao, góp phần phát triển công nghệ enzyme trong nước và ứng dụng trong các ngành công nghiệp liên quan.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết enzyme sinh học và mô hình xúc tác Michaelis-Menten, trong đó enzyme (E) kết hợp với cơ chất (S) tạo thành phức hợp trung gian (ES) trước khi tạo ra sản phẩm (P) và giải phóng enzyme:

$$ E + S \rightleftharpoons ES \rightarrow P + E $$

Protease được phân loại theo pH hoạt động tối ưu thành ba nhóm: acid (pH 2-6), trung tính (pH 7-8) và kiềm (pH 8-13). Ngoài ra, protease còn được phân loại dựa trên vị trí tác động trên chuỗi polypeptide thành endopeptidase và exopeptidase, với các nhóm enzyme chính như serine proteinase, cysteine proteinase, aspartic proteinase và metallo proteinase.

Aspergillus oryzae là sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ, tiết ra nhiều enzyme ngoại bào như protease, amylase, pectinase, lipase, có khả năng phân giải các cơ chất phức tạp trong môi trường nuôi cấy. Việc lựa chọn chủng giống thuần chủng, môi trường nuôi cấy phù hợp và điều kiện lên men tối ưu là yếu tố quyết định hiệu suất sinh tổng hợp protease.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC-F-0187 được cung cấp bởi Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam. Nguyên liệu nuôi cấy gồm bột lõi ngô, bột đậu tương, cám gạo và dung dịch khoáng Czapek.

  • Phương pháp phân tích: Nuôi cấy theo phương pháp lên men xốp trong môi trường cơ chất tổng hợp với các tỷ lệ thành phần khác nhau. Hoạt độ protease được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến, dựa trên khả năng thủy phân casein và định lượng sản phẩm tạo thành qua phản ứng màu với thuốc thử Folin, đo quang phổ ở bước sóng 750 nm.

  • Thiết bị: Sử dụng máy lắc, máy li tâm lạnh, máy đo quang phổ UV-Vis, tủ ấm và các thiết bị vô trùng khác.

  • Timeline nghiên cứu: Từ tháng 6/2017 đến 7/2018, tiến hành các thí nghiệm tối ưu tỷ lệ cơ chất, độ ẩm, nhiệt độ, pH và thời gian lên men.

  • Cỡ mẫu và chọn mẫu: Mỗi thí nghiệm được thực hiện độc lập với các biến số môi trường thay đổi, các yếu tố khác được cố định nhằm đánh giá ảnh hưởng riêng biệt.

  • Xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2013 để phân tích thống kê và xây dựng đường chuẩn tyrosine.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187:
    Chủng nấm sau bảo quản vẫn giữ được khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào với hoạt độ enzyme đạt 15,2 ± 0,3 U/g. Vòng phân giải cơ chất casein trên môi trường thạch đạt 20-25 mm với thể tích enzyme từ 25-100 µl.

  2. Tối ưu tỷ lệ bột đậu tương và bột lõi ngô:
    Hoạt tính protease tăng khi tỷ lệ bột lõi ngô tăng từ 55% lên 65%, đạt cực đại 18 U/g tại tỷ lệ 65% lõi ngô và 35% đậu tương. Khi tỷ lệ lõi ngô vượt quá 65%, hoạt tính giảm, thấp nhất là 13,5 U/g ở tỷ lệ 95% lõi ngô và 5% đậu tương.

  3. Tối ưu tỷ lệ cám gạo bổ sung:
    Bổ sung cám gạo làm tăng hoạt tính protease, đạt tối đa 19,7 U/g tại tỷ lệ 10% cám gạo, 35% đậu tương và 55% lõi ngô. Tăng tỷ lệ cám gạo trên 10% làm giảm hoạt tính enzyme.

  4. Tối ưu độ ẩm:
    Độ ẩm 60% là điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp protease với hoạt tính đạt 22,2 U/g. Độ ẩm thấp hơn hoặc cao hơn đều làm giảm hoạt tính enzyme, chỉ còn 16,6 U/g ở độ ẩm 90%.

  5. Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy:
    Nhiệt độ 30°C là tối ưu, đạt hoạt tính protease 23,7 U/g. Nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn làm giảm hoạt tính enzyme.

  6. Tối ưu pH môi trường:
    pH ban đầu 6 là điều kiện tối ưu với hoạt tính protease 25,1 U/g. Hoạt tính giảm khi pH tăng lên 7 hoặc 8, lần lượt còn 23,7 U/g và 20,8 U/g.

  7. Tối ưu thời gian lên men:
    Thời gian lên men 6 ngày cho hoạt tính protease cao nhất 27,1 U/g, gấp gần 4 lần so với ngày đầu tiên (7,7 U/g). Sau 6 ngày, hoạt tính giảm dần.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy việc tối ưu các điều kiện môi trường như tỷ lệ cơ chất, độ ẩm, nhiệt độ, pH và thời gian lên men có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187. Việc sử dụng hỗn hợp bột đậu tương, lõi ngô và cám gạo làm cơ chất nuôi cấy không chỉ tận dụng nguyên liệu sẵn có trong nước mà còn nâng cao hiệu suất enzyme so với việc sử dụng từng loại riêng lẻ.

Hoạt tính protease đạt được trong nghiên cứu tương đương hoặc cao hơn so với một số nghiên cứu trước đây sử dụng các chủng Aspergillus khác hoặc cơ chất khác như bột khoai tây, bột hướng dương. Độ ẩm 60% và nhiệt độ 30°C phù hợp với điều kiện sinh trưởng và hoạt động enzyme của nấm sợi, tạo môi trường thuận lợi cho quá trình lên men xốp.

pH môi trường ban đầu nghiêng về acid nhẹ (pH 6) phù hợp với đặc tính enzyme protease acid và trung tính của A. oryzae. Thời gian lên men 6 ngày dài hơn so với một số nghiên cứu trước, phản ánh đặc điểm sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của chủng nghiên cứu.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ đường chuẩn tyrosine, biểu đồ hoạt tính protease theo tỷ lệ cơ chất, độ ẩm, nhiệt độ, pH và thời gian lên men, giúp minh họa rõ ràng xu hướng và điểm tối ưu.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Áp dụng quy trình nuôi cấy với tỷ lệ cơ chất 35% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo:
    Giúp tối ưu hóa hoạt tính protease, giảm chi phí nguyên liệu, thích hợp cho sản xuất quy mô công nghiệp trong vòng 6 ngày.

  2. Kiểm soát độ ẩm môi trường nuôi cấy ở mức 60%:
    Đảm bảo điều kiện lên men xốp hiệu quả, tăng năng suất enzyme, giảm thất thoát do độ ẩm không phù hợp.

  3. Duy trì nhiệt độ nuôi cấy ổn định ở 30°C và pH ban đầu 6:
    Tối ưu hóa hoạt động enzyme và sinh trưởng nấm, nâng cao hiệu quả sản xuất protease.

  4. Thời gian lên men 6 ngày là tối ưu:
    Khuyến nghị không kéo dài quá thời gian này để tránh giảm hoạt tính enzyme do quá trình hóa nâu bào tử và suy giảm sinh tổng hợp.

  5. Chủ thể thực hiện: Các nhà sản xuất enzyme, phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, doanh nghiệp chế biến thực phẩm lên men có thể áp dụng quy trình này để nâng cao hiệu quả sản xuất.

  6. Thời gian thực hiện: Áp dụng ngay trong các chu kỳ sản xuất tiếp theo, đồng thời tiếp tục nghiên cứu mở rộng để cải tiến quy trình.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm:
    Nghiên cứu sâu về enzyme protease, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy vi sinh vật, phát triển công nghệ enzyme.

  2. Doanh nghiệp sản xuất enzyme và chế phẩm sinh học:
    Áp dụng quy trình tối ưu để nâng cao hiệu suất sản xuất protease, giảm chi phí nguyên liệu và thời gian lên men.

  3. Ngành công nghiệp thực phẩm lên men và chế biến:
    Sử dụng protease trong sản xuất nước mắm, phomat, bia, chế biến thịt và thủy sản nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm.

  4. Cơ quan quản lý và phát triển công nghệ sinh học:
    Tham khảo để xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển công nghệ enzyme trong nước, thúc đẩy sản xuất enzyme từ nguồn nguyên liệu nội địa.

Câu hỏi thường gặp

  1. Protease là gì và vai trò của nó trong công nghiệp?
    Protease là enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptide trong protein, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, nông nghiệp và công nghệ sinh học để phân giải protein, làm mềm thịt, sản xuất phomat, nước mắm và các sản phẩm lên men.

  2. Tại sao chọn Aspergillus oryzae VTCC-F-0187 làm chủng nghiên cứu?
    Chủng này có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào mạnh, được công nhận an toàn, có lịch sử ứng dụng lâu dài trong công nghiệp thực phẩm và enzyme, phù hợp với điều kiện nuôi cấy trong nước.

  3. Nguyên liệu nuôi cấy gồm những gì và tại sao chọn hỗn hợp bột đậu tương, lõi ngô và cám gạo?
    Nguyên liệu gồm bột đậu tương, bột lõi ngô và cám gạo là nguồn carbon và nitrogen rẻ, sẵn có trong nước, cung cấp dinh dưỡng đa dạng cho nấm phát triển và sinh tổng hợp enzyme hiệu quả.

  4. Điều kiện môi trường nào ảnh hưởng nhiều nhất đến sinh tổng hợp protease?
    Độ ẩm, nhiệt độ, pH và tỷ lệ cơ chất là các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme. Độ ẩm 60%, nhiệt độ 30°C, pH 6 và tỷ lệ cơ chất 35% đậu tương, 55% lõi ngô, 10% cám gạo là điều kiện tối ưu.

  5. Thời gian lên men tối ưu là bao lâu và tại sao?
    Thời gian lên men 6 ngày là tối ưu vì hoạt tính protease đạt cao nhất vào ngày này. Kéo dài thời gian lên men sẽ làm giảm hoạt tính do sự hóa nâu bào tử và giảm sinh tổng hợp enzyme.

Kết luận

  • Chủng Aspergillus oryzae VTCC-F-0187 có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào với hoạt độ enzyme đạt 27,1 U/g sau 6 ngày lên men trong điều kiện tối ưu.
  • Tỷ lệ cơ chất tối ưu là 35% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo, độ ẩm 60%, nhiệt độ 30°C và pH ban đầu 6.
  • Thời gian lên men 6 ngày cho hiệu suất enzyme cao nhất, phù hợp cho sản xuất quy mô công nghiệp.
  • Quy trình nghiên cứu góp phần phát triển công nghệ enzyme trong nước, sử dụng nguyên liệu sẵn có, giảm chi phí sản xuất.
  • Đề xuất áp dụng quy trình trong sản xuất enzyme protease và tiếp tục nghiên cứu mở rộng để nâng cao hiệu quả và ứng dụng đa dạng.

Hành động tiếp theo: Các đơn vị sản xuất enzyme và nghiên cứu công nghệ sinh học nên triển khai áp dụng quy trình tối ưu này, đồng thời theo dõi và điều chỉnh để phù hợp với quy mô và điều kiện thực tế.