Khóa luận: Nghiên cứu nhân nhanh chồi bắp (Zea mays L.) in vitro

Tài liệu nghiên cứu quy trình nhân nhanh chồi bắp (Zea mays L.) in vitro. Phân tích ảnh hưởng của BA, IAA và đề xuất phương pháp hiệu quả nhất.

• Tác giả: Phạm Thị Ngọc Quỳnh
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Trần Đông Phương
• Trường học: Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Nông nghiệp-Dược-Môi trường
• Đề tài: Nhân Nhanh Chồi Bắp Zea Mays L. In Vitro
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Bình Dương

Tóm tắt

I. Khái niệm và Ứng dụng Nhân Nhanh Chồi Bắp In Vitro

Nhân nhanh chồi bắp Zea mays L. in vitro là một kỹ thuật công nghệ sinh học tiên tiến nhằm tạo ra nhiều cây con giống hệt cây mẹ trong thời gian ngắn. Phương pháp này sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng. Ứng dụng của quy trình nhân nhanh chồi bắp rất đa dạng, bao gồm bảo tồn các giống bắp quý hiếm, tạo ra cây con chất lượng cao, giảm thời gian sinh sản so với phương pháp truyền thống, và phục vụ nghiên cứu khoa học. Kỹ thuật này đã được phát triển thành công ở nhiều quốc gia trên thế giới và đang được áp dụng rộng rãi trong nông nghiệp hiện đại.

1.1. Định nghĩa Nhân Nhanh Chồi In Vitro

Nhân nhanh chồi là quá trình tạo chồi bất định từ các mô thực vật bằng cách sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật như BA (6-Benzinaminopurine) và IAA (Indole-3-acetic acid). Phương pháp này cho phép tạo ra hàng trăm cây con từ một cây mẹ trong vòng vài tuần.

1.2. Giá Trị Kinh Tế và Khoa Học

Quy trình nhân nhanh chồi bắp in vitro mang lại giá trị kinh tế cao do nâng cao năng suất, tạo cây con đồng nhất, và giảm chi phí sản xuất. Về mặt khoa học, nó góp phần vào nghiên cứu phát sinh hình thái chồi bất định và hiểu biết sâu hơn về sinh lý phát triển của thực vật.

II. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Quá Trình Nhân Nhanh Chồi

Thành công của quy trình nhân nhanh chồi bắp phụ thuộc vào nhiều yếu tố sinh lý và môi trường. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật đóng vai trò quyết định, đặc biệt là BA và IAA, những hợp chất này điều khiển sự phân chia tế bào và phát triển chồi. Nồng độ chất điều hòa cần được tối ưu hóa dựa trên loại vật liệu ban đầu. Môi trường MS (Murashige and Skoog) là nền tảng dinh dưỡng chuẩn được sử dụng rộng rãi. Ngoài ra, các yếu tố khác như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, và sự hiện diện của casein hydrolysate đều ảnh hưởng đến hiệu suất tạo chồi. Việc kiểm soát các điều kiện này là chìa khóa để đạt được kết quả tối ưu.

2.1. Chất Điều Hòa Sinh Trưởng Thực Vật

BA (6-Benzinaminopurine) là cytokin mạnh, kích thích sự phân chia tế bào và tạo chồi. IAA (Indole-3-acetic acid) là auxin, điều chỉnh sự cân bằng giữa tạo chồi và tạo rễ. Tỷ lệ BA/IAA quyết định loại cơ quan phát sinh từ calus hoặc mô nguyên bào.

2.2. Môi Trường Dinh Dưỡng và Các Chất Bổ Sung

Môi trường MS cung cấp macro-nutrient, micro-nutrient và vitamin cần thiết. Casein hydrolysate 500 mg/l được bổ sung để cung cấp nitrogen hữu cơ, amino acid, và các chất tăng trưởng, giúp tăng cường khả năng nảy mầm của hạt bắp và tạo chồi hiệu quả.

III. Phương Pháp và Quy Trình Thực Hiện

Quy trình nhân nhanh chồi bắp Zea mays L. in vitro bao gồm nhiều bước kỹ thuật cụ thể. Đầu tiên, hạt bắp được khử trùng bề mặt để tạo seedling sạch trùng. Sau đó, mô thực vật (đoạn thân có chứa đỉnh sinh trưởng) được tách chiết từ cây con 2-3 tuần tuổi. Mô này được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các nồng độ khác nhau của chất điều hòa sinh trưởng BA và IAA. Có hai phương pháp xử lý: chẻ đôi đoạn thân hoặc hủy đỉnh sinh trưởng để kích thích tạo chồi bất định. Cây con được nuôi cấy trong điều kiện in vitro với ánh sáng nhân tạo (16 giờ/ngày) ở nhiệt độ 25±2°C. Sau 4 tuần, chồi được đếm và đánh giá khả năng tạo chồi. Khi chồi đủ cao, chúng được chuyển sang môi trường có IAA để kích thích tạo rễ.

3.1. Chuẩn Bị Vật Liệu Ban Đầu

Hạt bắp được khử trùng bề mặt bằng ethanol 70% và NaOCl, sau đó rửa sạch với nước cất vô trùng. Hạt được nuôi trên môi trường MS có casein hydrolysate để tăng tỷ lệ nảy mầm. Seedling 2-3 tuần tuổi được sử dụng làm nguồn mô tế bào thực vật để tách chiết đoạn thân.

3.2. Bố Trí Thí Nghiệm và Điều Kiện Nuôi Cấy

Đoạn thân được đặt trên môi trường MS bổ sung BA ở các nồng độ 0-5 mg/l, kết hợp với casein hydrolysate 0-500 mg/l hoặc IAA 0.1-0.5 mg/l. Mỗi xử lý có 30 replicate, nuôi cấy ở 25±2°C dưới ánh sáng 16 giờ/ngày. Dữ liệu được thu thập hàng tuần để theo dõi khả năng tạo chồi và tốc độ phát triển.

IV. Kết Quả và Hiệu Quả của Nhân Nhanh Chồi Bắp

Các nghiên cứu về nhân nhanh chồi bắp Zea mays L. in vitro đã cho thấy kết quả rất khả quan. Khả năng tạo chồi đạt hiệu suất cao nhất khi sử dụng ba phương pháp: (1) Môi trường MS có bổ sung BA ở nồng độ tối ưu 3-4 mg/l cho tạo chồi hiệu quả; (2) Kết hợp casein hydrolysate 500 mg/l với BA giúp tăng cường tạo chồi từ đoạn thân chẻ đôi và đỉnh sinh trưởng bị hủy; (3) Kết hợp IAA và BA với tỷ lệ BA/IAA cao (4-10:1) tạo điều kiện tối ưu cho phát sinh hình thái chồi bất định. Các chồi được hình thành từ mô nguyên bào thay vì calus, đảm bảo chúng là clone cây mẹ. Sau 4 tuần, số lượng chồi trung bình mỗi explant lên đến 10-15 chồi. Hiệu suất này cho phép nhân nhanh cây bắp với chi phí tương đối thấp và thời gian ngắn so với phương pháp hạt giống truyền thống.

4.1. Tác Động của BA Lên Tạo Chồi

Nồng độ BA tối ưu là 3-4 mg/l, khi đó khả năng tạo chồi từ đoạn thân bắp đạt cao nhất, với số chồi trung bình 12-15 chồi/explant sau 4 tuần. Nồng độ BA quá cao (>5 mg/l) gây ra chồi lùn và dị dạng, còn nồng độ thấp (<2 mg/l) cho ít chồi và chồi phát triển chậm.

4.2. Tác Động của Casein Hydrolysate và Tỷ Lệ BA IAA

Casein hydrolysate 500 mg/l kết hợp với BA 3-4 mg/l làm tăng tỷ lệ hình thành chồi lên 85-90% so với chỉ dùng BA (70-75%). Tỷ lệ BA/IAA = 4:1 đến 10:1 cung cấp môi trường tối ưu, với tốc độ tạo chồi nhanh nhất và chồi khỏe mạnh nhất, sẵn sàng để phát triển rễ hoặc nhân nhanh tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bắp (Zea mays L.) là một loài thực vật thuộc họ Hòa thảo với danh pháp khoa học là Poaceae. Bắp thuộc cây thân thảo, chiều cao có thể lên đến khoảng 3 m. Sự phân bố đầu tiên ở Mexico và Trung Mỹ sau đó lan sang các nước Đông Nam Á. Bắp chủ yếu sống ở vùng nhiệt đới nhưng qua quá trình trồng trọt và chọn tạo tự nhiên đã có thể trồng trên những vùng đất với khí hậu khác nhau.

Ở Việt Nam, Bắp là loại cây có diện tích và sản lượng thu hoạch đứng thứ hai sau lúa. Tất cả các bộ phận của cây đều có thể sử dụng để làm lương thực, thực phẩm cho con người và làm thức ăn cho gia súc. Tuy nhiên, con người thường trồng Bắp ở những khu vực miền núi, đất đai cằn cỗi, khô hạn, thiếu nước tưới, nghèo chất dinh dưỡng hoặc trồng xen canh với các loại cây trồng khác. Đây là nguyên nhân chủ yếu khiến năng suất thu hoạch thường không cao.

Do đó, việc tăng năng suất Bắp là vô cùng quan trọng và hết sức cần thiết. Muốn vậy, nền nông nghiệp nói chung và sản xuất Bắp nói riêng phải nhanh chóng tiếp thu các tiến bộ khoa học kỹ thuật, đầu tư vốn, nguồn giống. Hiện nay, trên thế giới đã có một số quốc gia nghiên cứu về Bắp. Năm 1983, Mỹ đã nghiên cứu ứng dụng của nuôi cấy mô để tạo cụm chồi và phôi soma từ chồi ngọn.

Huang đã nghiên cứu khả năng tái sinh cây thông qua mô sẹo bắt đầu từ phôi của cây Bắp Zea mays L. Trong nước cũng có nhiều nghiên cứu về loại cây này. Năm 2006, Nguyễn Thị Phương Nam đã xây dựng hệ thống in vitro để tái sinh cây Bắp và sau đó ứng dụng để chuyển gen tạo protein giàu sắt. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nhân nhanh chồi Bắp Zea mays L.

in vitro” nhằm tìm ra môi trường tối ưu cho việc tạo chồi cây Bắp trong điều kiện in vitro, với mong muốn tạo được số lượng chồi lớn từ một nguồn vật liệu ban đầu thông qua các cách xử lý khác nhau. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lược về họ Hòa thảo (Poaceae) Họ Hòa thảo là họ thực vật một lá mầm, còn được biết đến với danh pháp khác là Gramineae. Họ này khá đồng nhất được chia làm 3 phân họ, bao gồm 700 chi với khoảng 10.000 loài, phân bố khắp nơi trên Trái đất.

Ở Việt Nam, hiện biết khoảng 150 chi với gần 500 loài. Đây là một trong những họ có tầm quan trọng lớn vì là nguồn cung cấp lương thực cho con người hoặc là thức ăn cho gia súc [3]. Hầu hết họ Hòa thảo là cây thân cỏ, sống lâu năm, ít khi 1 hay 2 năm, một số có dạng thân gỗ thứ sinh (tre, nứa. Thân khí sinh chia lóng và mắt: lóng thường rỗng (trừ một số loài như mía, kê, ngô có thân đặc), không phân nhánh (trừ tre), mà chỉ phân nhánh từ thân rễ hoặc từ gốc.

Lá mọc cách, xếp thành hai dãy hai bên thân, ít khi có dạng xoắc ốc, gân lá song song. Bẹ lá to, dài, hai mép của bẹ lá không dính liền nhau. Các bông nhỏ hợp thành những cụm hoa phức tạp như bông kép, chùm, chùy. Mỗi bông nhỏ mang 1-10 hoa.

Nhị thường là 3 (đôi khi 6), chỉ nhị dài bao phấn đính lưng, hai bao phấn khi chín thường loe ra thành chữ X. Bộ nhụy 2 lá noãn hợp, bầu trên, 1 ô, 1 noãn đính đáy, 2 vòi nhụy ngắn và hai đầu nhụy dài mang chùm lông để hứng hạt phấn, thường màu nâu hoặc tím. Các hạt phấn nhỏ, nhẹ, dễ dàng được gió chuyển đi đến thụ phấn cho hoa khác. Quả dĩnh, vỏ quả và vỏ hạt dính nhau.

Chỉ một số loài của chi Bambusa (tre) mới có quả bế hay quả mọng. Hạt chứa nhiều tinh bột. Vỏ quả và vỏ hạt gồm những tế bào nhu mô chứa nhiều protein, vitamin, dầu. Phôi nằm lệch 1 bên so với nội nhũ, ở gốc của quả dĩnh và phân cách với nội nhũ bởi một bộ phận gọi là lá mầm [3].

Một số cây thuộc họ Hòa thảo: bắp, lúa, mía, cỏ tranh, tre, nứa, giang, ý dĩ (bo bo). Sơ lược về cây Bắp Zea mays L. Vị trí phân loại Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Poales Họ: Poaceae Chi: Zea Loài: Zea mays L. Nguồn gốc, phân bố Bắp có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Mexico và Trung Mỹ.

Từ thời cổ đại, người dân đã biết cách trồng cây này. Đến thế kỉ thứ XVI, người Bồ Đào Nha đưa Bắp từ châu Mỹ vào vùng Đông Nam Á. Ngày nay, Bắp đã trở thành loại cây cho hạt được trồng rộng rãi nhất thế giới. Ở Việt Nam, Bắp cũng được coi là cây trồng cổ và được trồng ở khắp các địa phương, đặc biệt là các tỉnh trung du và miền núi [1].

Đặc điểm hình thái của cây Bắp Bắp là cây thân thảo, cao 2-3 m. Thân thẳng, đặc, nhẵn, không phân nhánh, các đốt ở gốc mang rễ. Lá hình dải, dài 30-40 cm, thường gập xuống, gốc nhẵn sát thân, đầu thuôn nhọn, mép có lông mềm, dạng mi, gân giữa nổi rõ, bẹ lá nhẵn, lưỡi bẹ ngắn [1]. Cụm hoa đực mọc ở ngọn thân thành chùy, cuống có lông; bông nhỏ hình bầu dục mang 2 hoa, hoa có 3 nhị, bao phấn thuôn, mày mềm hình mũi mác, có lông.

Cụm hoa cái mọc ở kẽ lá thành bông dày hình trụ, không cuống: bông nhỏ 4 rất ngắn mang 1 hoa, hoa ở dưới rỗng, các hoa ở trên có bầu và vòi nhụy dài, mày mềm, khá rộng [1]. Quả cứng, bóng, màu vàng, đôi khi đỏ hoặc nâu, tím, xếp thành nhiều dãy, bao bọc bởi mày, có vòi tồn tại rất dài và mảnh [1]. Đặc điểm sinh thái của cây Bắp Cây Bắp có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới nhưng qua quá trình trồng trọt, chọn lọc và thuần hóa nên Bắp đã có thể trồng trên nhiều vùng khí hậu khác nhau. Bắp là cây ưa nhiệt, có thể sinh trưởng và phát triển tốt ở biên độ nhiệt từ 25- 300C, pH trong khoảng 5,7-7,5.

Ánh sáng là một yếu tố quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Bắp, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tích lũy chất dinh dưỡng và ảnh hưởng đến độ dài quá trình sinh trưởng [1]. Cây Bắp có thể chống chịu tốt với điều kiện mất nước và quang hợp ở nhiệt độ cao. Ở những vùng nóng, nơi có sự thoát hơi nước cao, nhu cầu nước của cây Bắp lại càng cao. Bắp là cây trồng cạn cần nhiều nước nhưng cũng rất nhạy cảm với độ ẩm đất cao.

Đặc biệt, khi cây còn nhỏ chỉ cần nằm dưới nước 1-2 ngày cũng có thể bị chết [1]. Thành phần và công dụng của cây Bắp 1.1 Thành phần hóa học Thân Bắp chứa khá nhiều sucrose. Lá Bắp chứa 13-14% protein và feredoxin (protein có sắt). Trong hạt chứa 55-70% tinh bột; 10-15% protein; 5-10% lipid và một số chất khác.

Hạt Bắp còn chứa nhiều vitamin như thiamin, riboflavin, acid pantothenic, acid folic, biotin, vitamin E. Râu Bắp có 2,5% chất béo; 0,12% tinh dầu; 3,8% chất gôm; 2,7% chất nhựa; 1,5% glucosid đắng; 3,18% saponin; cryptoxanthin; các vitamin C và K; sitosterol; stigmasterol; nhiều acid hữu cơ (acid malic, acid tartric. Tác dụng dược lý Râu Bắp có tác dụng lợi tiểu, tăng bài tiết mật, làm giảm lượng bilirubin và tăng lượng prothrombin trong máu trên động vật thí nghiệm. Râu Bắp dưới 5 dạng chế phẩm ủ lên men, có tác dụng hạ đường máu trên động vật đái tháo đường.

Dầu Bắp có tác dụng làm hạ cholesterol máu ở người và một số động vật, làm giảm giảm mức độ bão hòa của β- lipoprotein trong máu với cholesterol, làm chậm sự thâm nhiễm β- lipoprotein vào động mạch chủ và giảm xơ vữa động mạch [1]. Nghiên cứu trong và ngoài nước 1. Nghiên cứu trong nước Năm 1995, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, Z. Tkaschuc đã tạo cụm chồi cây Bắp Zea mays L.

từ đỉnh sinh trưởng và phôi hạt nuôi cấy in vitro. Năm 2007, Nguyễn Thị Phương Nam, Lê Tấn Đức, Phạm Đức Trí, Nguyễn Hữu Tâm, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển đã xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây Bắp Zea mays L. và sau đó ứng dụng để chuyển gen tạo protein giàu sắt nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Nghiên cứu ngoài nước Năm 1992, Heng Zhong, C.

Srinivasan và Mariam B. Sticklen đã nghiên cứu sự phát sinh hình thái của cây Bắp trong điều kiện in vitro. Huang và cộng sự đã nghiên cứu khả năng tái sinh cây thông qua mô sẹo bắt đầu từ phôi của cây Bắp Zea mays L. Nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.

Khái niệm và ứng dụng Thuật ngữ “nuôi cấy mô tế bào thực vật” được dùng một cách rộng rãi để nói về việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong điều kiện vô trùng. Hệ thống nuôi cấy mô thực vật thường được sử dụng để nghiên cứu tất cả các vấn đề liên quan đến thực vật như sinh lí học, sinh hóa học, di truyền học và cấu trúc thực vật [5]. 6 Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và cơ quan thực vật hiện nay đã được củng cố vững chắc ở rất nhiều phòng thí nghiệm trên khắp thế giới. Nhiều phương pháp đã được phát triển để nhân giống, chọn lọc các đặc điểm mong muốn khác nhau, tạo dòng tế bào, nhân nhanh các kiểu di truyền tạo ra các cây đơn bội từ nuôi cấy noãn và túi phấn, đa dạng hóa các kiểu di truyền bằng cách tạo đột biến và nhân dòng soma, tạo mô sẹo cô lập và nuôi cấy tế bào để nghiên cứu ảnh hưởng của khoáng, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào.

Nhiều kỹ thuật nuôi cấy mô đặc biệt đã được nghiên cứu và ứng dụng. Trong tương lai, các mô được nuôi cấy sẽ được sử dụng như công cụ cơ bản và người ta đã sử dụng nhiều thuật ngữ chuyên biệt để phân biệt các kiểu nuôi cấy khác nhau: cấy cây, cấy phôi, cấy cơ quan, cấy mô, cấy tế bào, cấy tế bào trần, cấy túi phấn, hạt phấn [5]. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô 1. Sự lựa chọn mẫu cấy Việc lựa chọn nguồn mẫu cấy thích hợp là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả nuôi cấy mô.

Nói chung, mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây. Chồi hoa non hay cụm hoa cũng thường có kết quả tái sinh rất tốt. Mẫu cấy thích hợp phải có khả năng biểu hiện tính toàn thể [5].