Chuẩn bị đậu nành lên men bằng phương pháp lên men thể rắn

Quy trình lên men đậu nành bằng phương pháp lên men thể rắn là một kỹ thuật quan… 65 trang · Ho Chi Minh City University of Technology and Education · 2022.

• Tác giả: Tran Kieu Huong
• Người hướng dẫn: Assoc. Trinh Khanh Son
• Trường học: Ho Chi Minh City University of Technology and Education
• Chuyên ngành: Food Technology
• Đề tài: Preparation of Fermented Soybean Meal by Solid-State Fermentation
• Loại tài liệu: Graduation Project
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Ho Chi Minh City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENTS
• ABSTRACT
• 1. OVERVIEW OF SOYBEAN MEAL
• 1.1. Introduction of Soybean Meal
• 1.2. Properties of Soybean Meal
• 1.3. Bacillus sp
• 1.4. Bacillus velezensis
• 1.5. The role of B. velezensis
• 2. OVERVIEW OF FERMENTED SOYBEAN MEAL
• 2.1. Fermentation process and microorganisms
• 2.2. The reason for creating the topic
• 3. MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Materials, chemicals and equipment
• 3.2. Materials and Chemicals
• 3.3. Investigation of the growth ability of microbial strains
• 3.4. Evaluation of proteolytic activity
• 3.5. Solid-state fermentation (SSF) in soybean meal
• 3.6. Determination of protein content
• 3.7. Determination of total carbohydrate by Phenol-Sulfuric Acid method
• 3.8. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
• 3.9. Gel Permeation Chromatography (GPC) analysis
• 3.10. Selection of microorganisms with intense protease activity
• 3.11. Chemical composition of soybean meal (SBM)
• 3.12. Enzyme-degrading protein concentration
• 3.13. Protein molecular weight
• 4. CONCLUSION AND RECOMMENDATIONS
• LIST OF FIGURES
• LIST OF TABLES
• LIST OF ABBREVIATIONS

Tóm tắt

I. Tổng quan về quy trình lên men đậu nành thể rắn

Quy trình lên men đậu nành bằng phương pháp lên men thể rắn là một kỹ thuật quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm. Phương pháp này không chỉ giúp cải thiện giá trị dinh dưỡng của đậu nành mà còn làm giảm các yếu tố chống dinh dưỡng có trong sản phẩm. Lên men đậu nành giúp tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thụ dinh dưỡng, đồng thời tạo ra các sản phẩm có lợi cho sức khỏe.

1.1. Đậu nành và giá trị dinh dưỡng của nó

Đậu nành là nguồn protein thực vật quan trọng, chứa nhiều axit amin thiết yếu. Tuy nhiên, nó cũng chứa các yếu tố chống dinh dưỡng như trypsin inhibitors và saponins, làm giảm khả năng hấp thụ dinh dưỡng. Lên men giúp loại bỏ những yếu tố này, cải thiện giá trị dinh dưỡng của đậu nành.

1.2. Lợi ích của việc lên men đậu nành

Lên men đậu nành không chỉ làm tăng hàm lượng protein mà còn cải thiện khả năng tiêu hóa. Các sản phẩm lên men có thể giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến tiêu hóa, đồng thời cung cấp các vi sinh vật có lợi cho đường ruột.

II. Thách thức trong quy trình lên men đậu nành thể rắn

Mặc dù quy trình lên men đậu nành thể rắn mang lại nhiều lợi ích, nhưng cũng tồn tại một số thách thức. Việc kiểm soát điều kiện lên men như độ ẩm, nhiệt độ và thời gian là rất quan trọng để đạt được sản phẩm chất lượng cao. Ngoài ra, sự phát triển của vi sinh vật không mong muốn có thể ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.

2.1. Kiểm soát điều kiện lên men

Điều kiện lên men như độ ẩm và nhiệt độ cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo sự phát triển của vi sinh vật có lợi. Việc không kiểm soát tốt có thể dẫn đến sự phát triển của vi sinh vật gây hại, làm giảm chất lượng sản phẩm.

2.2. Sự phát triển của vi sinh vật không mong muốn

Trong quá trình lên men, sự phát triển của vi sinh vật không mong muốn có thể gây ra mùi hôi và làm giảm giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Cần có các biện pháp phòng ngừa để hạn chế tình trạng này.

III. Phương pháp lên men thể rắn cho đậu nành

Phương pháp lên men thể rắn (SSF) là một trong những kỹ thuật hiệu quả nhất để lên men đậu nành. SSF sử dụng các vi sinh vật như Bacillus subtilis và Aspergillus oryzae để thực hiện quá trình lên men. Kỹ thuật này giúp cải thiện đáng kể hàm lượng protein và giảm các yếu tố chống dinh dưỡng.

3.1. Các vi sinh vật sử dụng trong lên men

Các vi sinh vật như Bacillus subtilis và Aspergillus oryzae được sử dụng phổ biến trong quy trình lên men đậu nành. Chúng có khả năng phân hủy protein và carbohydrate, tạo ra các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao.

3.2. Quy trình thực hiện lên men thể rắn

Quy trình lên men thể rắn bao gồm các bước chuẩn bị nguyên liệu, cấy giống vi sinh vật, và kiểm soát điều kiện lên men. Thời gian lên men thường kéo dài từ 24 đến 96 giờ, tùy thuộc vào loại vi sinh vật và điều kiện môi trường.

IV. Ứng dụng thực tiễn của sản phẩm lên men đậu nành

Sản phẩm lên men đậu nành có nhiều ứng dụng trong ngành thực phẩm và chăn nuôi. Chúng không chỉ được sử dụng làm thức ăn cho gia súc mà còn được chế biến thành các sản phẩm thực phẩm chức năng. Việc sử dụng sản phẩm này giúp cải thiện sức khỏe và năng suất của động vật.

4.1. Sử dụng trong chăn nuôi

Sản phẩm lên men đậu nành được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi gia súc và gia cầm. Chúng giúp cải thiện sức khỏe đường ruột và tăng cường khả năng tiêu hóa, từ đó nâng cao hiệu suất chăn nuôi.

4.2. Ứng dụng trong thực phẩm chức năng

Ngoài việc sử dụng trong chăn nuôi, sản phẩm lên men đậu nành còn được chế biến thành các thực phẩm chức năng, giúp cung cấp dinh dưỡng và hỗ trợ sức khỏe cho con người.

V. Kết luận và tương lai của quy trình lên men đậu nành

Quy trình lên men đậu nành bằng phương pháp lên men thể rắn có tiềm năng lớn trong việc cải thiện giá trị dinh dưỡng và giảm thiểu các yếu tố chống dinh dưỡng. Tương lai của quy trình này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều sản phẩm chất lượng cao hơn, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường.

5.1. Tiềm năng phát triển sản phẩm

Với sự phát triển của công nghệ và nghiên cứu, quy trình lên men đậu nành có thể được cải tiến để tạo ra các sản phẩm dinh dưỡng cao hơn, đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về các vi sinh vật mới và điều kiện lên men tối ưu sẽ là hướng đi quan trọng trong việc phát triển quy trình lên men đậu nành, nhằm tạo ra các sản phẩm an toàn và hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khô đậu nành (Soybean Meal - SBM) là phụ phẩm chủ yếu thu được sau quá trình ép dầu đậu nành hoặc chế biến các sản phẩm từ đậu nành như sữa đậu nành và đậu phụ. Trong ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản, SBM đóng vai trò là nguồn cung cấp protein thực vật quan trọng nhất, chiếm khoảng 2/3 tổng sản lượng thức ăn protein toàn cầu. Protein trong SBM có giá trị sinh học và cân bằng axit amin vượt trội so với các nguồn đạm thực vật khác.

Tuy nhiên, việc sử dụng SBM làm thức ăn trực tiếp cho động vật—đặc biệt là động vật non có hệ tiêu hóa chưa hoàn thiện—gặp nhiều hạn chế nghiêm trọng do sự hiện diện của các yếu tố kháng dinh dưỡng (Antinutritional Factors - ANFs). Các yếu tố này bao gồm chất ức chế trypsin (Trypsin Inhibitors - TI), saponin, hemagglutinin, cùng với các đại phân tử protein gây dị ứng đường ruột như glycinin và $\beta$-conglycinin. Những hợp chất này làm suy giảm khả năng tiêu hóa, giảm hiệu quả chuyển hóa thức ăn và gây tổn thương niêm mạc ruột (dẫn đến tiêu chảy ở gia súc non). Phương pháp lên men thể rắn (Solid-State Fermentation - SSF) bằng các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh protease cao được xem là giải pháp sinh học tối ưu nhằm phân giải các yếu tố kháng dinh dưỡng, cắt nhỏ đại phân tử protein thành các peptide tan trong nước có khối lượng phân tử thấp và nâng cao giá trị dinh dưỡng của bã đậu nành.

Khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ Thực phẩm với đề tài "Preparation of Fermented Soybean Meal by Solid-State Fermentation" (Mã đề tài: 2022-18116020) do sinh viên Trần Kiều Hương (MSSV: 18116020) và Lương Thị Ngọc Sang (MSSV: 18116034) thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. Trịnh Khánh Sơn tại Khoa Đào tạo Chất lượng cao, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh (bảo vệ tháng 8 năm 2022), tập trung vào các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

1. Khảo sát động học sinh trưởng và sàng lọc hoạt tính protease ngoại bào của 4 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus (mã hóa LM 1, LM 2, LM 3, LM 4) để tuyển chọn chủng có năng lực phân giải protein mạnh nhất.
2. Thiết lập quy trình công nghệ lên men thể rắn khô đậu nành ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô 1,0 kg theo các mốc thời gian từ 0 đến 96 giờ (0h, 24h, 48h, 72h, 96h).
3. Đánh giá sự biến đổi thành phần hóa lý của khô đậu nành lên men (Fermented Soybean Meal - FSBM), bao gồm hàm lượng protein tổng số, protein hòa tan trong nước, độ hòa tan trong dung dịch KOH, chỉ số phân tán nitơ (NSI), hoạt độ ức chế trypsin (TI), tro thô, chất béo và chất xơ.
4. Phân tích sự thay đổi khối lượng phân tử của các phân đoạn protein và sự phân giải các kháng nguyên dị ứng bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE và sắc ký thẩm thấu gel (GPC/HPLC).

• Đối tượng nghiên cứu: Khô đậu nành nhập khẩu từ Argentina (ký hiệu mẫu ARG) và 4 chủng vi khuẩn Bacillus (B. subtilis LM 1, B. subtilis LM 2, B. velezensis LM 3, B. pumilus LM 4).
• Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát các điều kiện lên men thể rắn ở nhiệt độ 37°C trong thời gian 5 ngày, so sánh giữa cơ chất tiệt trùng (121°C trong 15 phút) và không tiệt trùng ở hai quy mô (10 g và 1,0 kg), đồng thời đối chiếu chất lượng với các mẫu bã đậu nành lên men thương mại trên thị trường (mã hóa TT 50, TT 53, TT 55).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết về đặc tính cấu trúc protein đậu nành, sinh lý học vi sinh vật chi Bacillus và nguyên lý lên men thể rắn cơ chất nông nghiệp. Các nhóm protein chính trong đậu nành bao gồm globulin và albumin, trong đó globulin chiếm tỷ lệ lớn nhất với hai thành phần chính gây dị ứng là glycinin (cấu trúc hexamer gồm các tiểu phần acid ~31,2 kDa và basic) và $\beta$-conglycinin (cấu trúc trimer gồm 3 tiểu phần $\alpha'$, $\alpha$ và $\beta$ với khối lượng phân tử lên tới 107,3 kDa). Loài vi khuẩn Bacillus velezensis—một thành viên trong phức hợp Bacillus subtilis species complex—được xác định là vi khuẩn gram dương, tạo nội bào tử, an toàn sinh học và có khả năng bài tiết hệ enzyme thủy phân phong phú (protease, amylase, cellulase) cùng các chất kháng khuẩn tự nhiên.

Quy trình thực nghiệm và các phương pháp phân tích tiêu chuẩn được triển khai chi tiết:

• Nuôi cấy vi sinh vật và khảo sát sinh trưởng: Vi sinh vật được nhân giống trong môi trường Nutrient Broth (NBC) ở 37°C với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ. Đường cong sinh trưởng được thiết lập bằng cách đo mật độ quang học ($OD_{600}$) theo từng giờ trên máy quang phổ UV-Vis Hitachi UH-5300 (Nhật Bản).
• Sàng lọc hoạt tính Protease: Đánh giá khả năng thủy phân casein thông qua đường kính vòng phân giải ($D - d$, mm) trên đĩa thạch YNB (DIFCO) bổ sung casein, ủ ở 37°C và theo dõi tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ.
• Quy trình lên men thể rắn (SSF): Bã đậu nành nguyên liệu được phối trộn với 1% rỉ đường (molasses), bổ sung dịch vi sinh vật với tỷ lệ 5% (thể tích/khối lượng), điều chỉnh độ ẩm đạt 40% dựa theo công thức: $$x = \frac{m(b% - a%)}{(1 - b%) \times 100%}$$ Trong đó $x$ là lượng nước cần bổ sung (mL), $m$ là khối lượng bã đậu ban đầu (g), $a%$ là độ ẩm ban đầu của mẫu (xác định bằng cân sấy ẩm hồng ngoại) và $b%$ là độ ẩm mong muốn (40%). Quá trình lên men được duy trì ở 37°C trong các khoảng thời gian 0, 24, 48, 72 và 96 giờ. Mẫu sau lên men được sấy đối lưu ở 50–60°C đến khi độ ẩm đạt dưới 10%, sau đó nghiền mịn và bảo quản kín ở 4°C.
• Định lượng Protein tổng số: Thực hiện bằng phương pháp Kjeldahl vô cơ hóa mẫu với $H_2SO_4$ đậm đặc và chất xúc tác, trung hòa bằng $NaOH$, chưng cất thu hồi amoniac vào dung dịch axit boric và chuẩn độ bằng dung dịch $HCl$ tiêu chuẩn (sử dụng hệ số chuyển đổi nitơ sang protein là 6,25).
• Định lượng Protein hòa tan trong nước: Sử dụng phương pháp Lowry, dựa trên phản ứng Biuret tạo phức $Cu^+$ trong môi trường kiềm và phản ứng oxy hóa khử với thuốc thử Folin-Ciocalteu tạo phức màu xanh molybdenum, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 550 nm hoặc 750 nm và tính toán nồng độ theo đường chuẩn Bovine Serum Albumin (BSA).
• Định lượng Tổng carbohydrate: Áp dụng phương pháp so màu Phenol - Axit Sulfuric ở bước sóng 490 nm đối chiếu với đường chuẩn glucose tiêu chuẩn.
• Điện di Gel Polyacrylamide biến tính (SDS-PAGE): Sử dụng hệ thống gel phân tách 12,5% (Resolving gel) và gel tập trung 4% (Stacking gel), biến tính protein bằng chất hoạt động bề mặt SDS và chất khử $\beta$-mercaptoethanol. Điện di vận hành ở hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện không đổi 30 mA trong 2 giờ, nhuộm gel bằng dung dịch Coomassie Brilliant Blue R250/G250 và tẩy màu bằng hỗn hợp axit axetic - metanol.
• Phân tích Sắc ký thẩm thấu Gel (GPC/HPLC): Thực hiện trên hệ thống Agilent Technologies 1100 series trang bị đầu dò HPLC-UV ở bước sóng 220 nm. Mẫu phân tích ($20,\mu\text{L}$) được nạp qua hai cột ghép nối Ultrahydrogel 2000 ($7,8 \times 300\text{ mm}$, kích thước hạt $12,\mu\text{m}$) và Ultrahydrogel 250 ($7,8 \times 300\text{ mm}$, kích thước hạt $6,\mu\text{m}$), pha động là dung dịch axit trifluoroacetic 70%.
• Xử lý số liệu: Mọi thí nghiệm được lặp lại 3 lần (triplicate). Dữ liệu được phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) và kiểm định khoảng phân vị Duncan ($p \le 0,05$) bằng phần mềm SPSS.

---

Nội dung chính theo từng chương

Overview of Soybean Meal and Fermentation (Tổng quan về khô đậu nành và công nghệ lên men)

Chương tổng quan hệ thống hóa các đặc tính vật lý, hóa học và sinh học của khô đậu nành cũng như các phương pháp công nghệ xử lý phụ phẩm này:

• Đặc tính cơ lý của SBM: Kích thước hạt bã đậu nành phân bố trong dải trung bình (0,595–2,380 mm) chiếm 70% và hạt mịn (<0,595 mm) chiếm 30%. Độ ẩm của khối hạt có mối tương quan tỷ lệ nghịch với khối lượng riêng thực và dung trọng thể tích, nhưng tỷ lệ thuận với kích thước hình học hạt (chiều dài, chiều rộng, diện tích bề mặt).
• Giá trị dinh dưỡng và sự biến thiên: Thành phần hóa học của bã đậu nành biến thiên tùy theo nguồn gốc xuất xứ nông học (Mỹ, Brazil, Argentina), điều kiện canh tác và công nghệ chế biến dầu. Mẫu SBM Argentina đặc trưng có hàm lượng tro 6,5%, xơ trung tính NDF, hoạt độ urease 0,2 mg N/g và hoạt độ ức chế trypsin (TIA) ở mức 2,8 mg/g chất khô.
• Vai trò của Bacillus velezensis và lên men: Tổng quan chỉ ra rằng B. velezensis có khả năng thích nghi rộng ở nhiệt độ 25–37°C, pH trung tính, tiết enzyme protease mạnh mẽ, được ứng dụng rộng rãi làm men vi sinh bổ sung trong thức ăn chăn nuôi (như chủng DSM 15544 - Calsporin® cho heo, gia cầm và chủng BV007 cho tôm). Quá trình lên men thể rắn giúp phân hủy các liên kết peptide khó tiêu, vô hiệu hóa các yếu tố kháng dinh dưỡng và cải thiện tỷ lệ sống sót, giảm tỷ lệ tiêu chảy ở vật nuôi non.

Materials and Methods (Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu)

Chương này mô tả chi tiết quy trình chuẩn bị hóa chất, thiết bị, thiết kế các mô hình thí nghiệm và các bước chuẩn hóa phương pháp đo:

• Bố trí thí nghiệm lên men: Khảo sát được thiết lập trên 3 điều kiện lên men thể rắn độc lập:
  • Điều kiện 1 (LM 3T): 10 g bã đậu nành được hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút trước khi cấy chủng B. velezensis LM 3.
  • Điều kiện 2 (LM 3T1): 1,0 kg bã đậu nành được hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút trước khi cấy chủng B. velezensis LM 3 (đánh giá ở quy mô lớn hơn).
  • Điều kiện 3 (LM 3K): 10 g bã đậu nành không qua xử lý tiệt trùng trước khi cấy vi sinh vật.
• Xây dựng đường chuẩn phân tích: Thiết lập quy trình chuẩn bị hóa chất cho phương pháp Lowry (pha trộn phức chất X: 2% $Na_2CO_3$, Y: $CuSO_4\cdot 5H_2O$ và Z: muối Tartrate theo tỷ lệ 100:1:1) và đường chuẩn BSA; phương pháp Phenol - $H_2SO_4$ với dung dịch glucose chuẩn $1,0\text{ mg/mL}$; và quy trình phân tích SDS-PAGE.

Results and Discussion (Kết quả nghiên cứu và thảo luận)

Chương kết quả tập trung trình bày các dữ liệu thực nghiệm thu được từ quá trình tuyển chọn vi sinh vật đến các biến đổi hóa lý và cấu trúc protein:

1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính Protease vượt trội

Kết quả theo dõi pha sinh trưởng cho thấy:

• Chủng LM 1 (B. subtilis) có pha log ngắn, đạt đỉnh thấp và nhanh chóng rơi vào pha suy tàn.
• Chủng LM 2 (B. subtilis) và LM 4 (B. pumilus) có pha lag kéo dài, đạt mật độ tế bào ở pha cân bằng cao hơn nhưng tốc độ phân giải cơ chất chậm.
• Chủng LM 3 (B. velezensis) bắt đầu pha log từ giờ thứ 3, đạt pha cân bằng tại giờ thứ 15 và duy trì ổn định trong 8 giờ liên tục trước khi suy tàn.

Chủng vi khuẩn	Loài xác định	Đường kính vòng phân giải Casein sau 24h (mm)	Đường kính vòng phân giải Casein sau 48h (mm)	Đường kính vòng phân giải Casein sau 72h (mm)
LM 1	Bacillus subtilis	4,00	12,00	12,50
LM 2	Bacillus subtilis	0,00	6,00	12,00
LM 3	Bacillus velezensis	28,00	55,00	88,90
LM 4	Bacillus pumilus	0,00	0,00	0,00

Ghi chú: Sau 72 giờ, chủng LM 3 đã thủy phân hoàn toàn lượng casein có trên toàn bộ bề mặt đĩa thạch YNB (đường kính đạt 88,90 mm), thể hiện hoạt lực protease vượt trội tuyệt đối so với 3 chủng còn lại, do đó được lựa chọn cho toàn bộ các thí nghiệm lên men tiếp theo.

2. Biến đổi thành phần hóa học của bã đậu nành trong quá trình lên men

Phân tích thành phần hóa lý của mẫu bã đậu nành tiệt trùng lên men thể rắn bằng chủng LM 3 ở quy mô 1,0 kg (Điều kiện 2: các mẫu LM 10 đến LM 196) so với bã đậu nguyên liệu (ARG):

Chỉ tiêu phân tích	Nguyên liệu ARG	Sau 0h (LM 10)	Sau 24h (LM 124)	Sau 48h (LM 148)	Sau 72h (LM 172)	Sau 96h (LM 196)
Độ ẩm và chất bay hơi (%)	8,8	8,2	7,9	7,6	7,4	7,1
Protein tổng số (%)	46,30	46,50	47,40	48,80	50,10	51,30
Protein tan trong nước (g/100g)	8,23	4,95	8,10	10,85	14,30	18,40
Độ hòa tan trong KOH (g/100g)	86,60	85,20	82,10	78,41	76,20	75,00
Chỉ số phân tán Nitơ - NSI (%)	17,54	10,65	17,09	22,23	28,54	35,87
Hoạt tính ức chế Trypsin (mg/g)	2,78	2,15	1,98	1,65	1,42	1,23
Tro thô (%)	6,2	6,2	6,3	6,5	6,7	6,9

• Hàm lượng protein tổng số tăng từ 46,30% lên 51,30% sau 96 giờ lên men (ở quy mô phòng thí nghiệm 10g đạt tới 53,58%). Nguyên nhân là do vi khuẩn sử dụng carbohydrate để hô hấp tế bào tạo năng lượng, giải phóng $CO_2$ và $H_2O$, làm giảm tỷ lệ phần trăm carbohydrate tổng và gián tiếp làm tăng tỷ lệ protein và tro thô trong sinh khối khô.
• Hàm lượng protein hòa tan trong nước và chỉ số NSI tăng gấp hơn 2 lần tại thời điểm 96 giờ, chứng minh protease của B. velezensis đã cắt các phân tử protein không tan thành các oligopeptide tan.
• Độ hòa tan trong KOH giảm từ 86,60% xuống 75,00%, nằm trọn trong khoảng tối ưu (70–85%), phản ánh chất lượng protein đã được cải thiện qua xử lý nhiệt và lên men.
• Hoạt tính ức chế trypsin (TI) giảm liên tục từ 2,78 mg/g xuống còn 1,23 mg/g (giảm hơn 55%), giúp triệt tiêu độc tính kháng dinh dưỡng.

3. So sánh hàm lượng Protein giữa các điều kiện lên men và mẫu thương phẩm

• Quy mô 10g (LM 3T) vs 1,0 kg (LM 3T1): Mẫu 10g đạt hàm lượng protein tổng số cao hơn (53,13% ở mẫu LM 96) so với mẫu 1,0 kg (51,30% ở mẫu LM 196) do ở khối lượng nhỏ, việc đảo trộn và phân tán bào tử vi sinh vật đồng đều hơn so với trộn thủ công ở khối lượng lớn.
• Mẫu tiệt trùng (LM 3T) vs Không tiệt trùng (LM 3K): Ở mẫu không tiệt trùng (LM 096), protein hòa tan đo được bằng phương pháp Lowry đạt 16,00%, cao hơn mẫu tiệt trùng LM 96 (9,77%). Điều này được giải thích là do quá trình hấp nhiệt ở 121°C đã làm biến tính nhiệt các protein hình cầu (globulin và albumin nhạy cảm nhiệt), làm giảm độ tan ban đầu. Tuy nhiên, quá trình lên men kéo dài đã từng bước thủy phân và tái phục hồi hàm lượng peptide hòa tan.
• So sánh với mẫu thương mại trên thị trường: Mẫu thị trường TT 50 đạt protein tổng số 60,94% (protein tan 7,02%), TT 53 đạt 63,85% (protein tan 8,02%) và TT 55 đạt 56,26%. Mặc dù protein tổng số của mẫu nghiên cứu thấp hơn mẫu thương mại TT 53, hàm lượng protein hòa tan trong nước của sản phẩm lên men trong đề tài (đạt 18,40% ở điều kiện 2 và 16,00% ở điều kiện 3) cao hơn rõ rệt so với các mẫu thương mại (chỉ đạt 7,02–8,02%).

4. Đánh giá sự biến đổi khối lượng phân tử Protein (SDS-PAGE và GPC)

• Kết quả điện di SDS-PAGE:
  • Mẫu bã đậu thô (ARG) chứa đầy đủ các vạch protein có kích thước từ 15 đến 100 kDa, đặc biệt là các phân đoạn kháng nguyên $\beta$-conglycinin (tiểu phần $\alpha', \alpha, \beta$ tại ~107,3 kDa) và glycinin (tiểu phần acid tại ~31,2 kDa).
  • Đối với mẫu có tiệt trùng trước lên men (LM 3T): Ngay sau 24 giờ lên men (LM 24), các phân đoạn kháng nguyên glycinin và $\beta$-conglycinin đã bị phân cắt mạnh thành các đoạn nhỏ 34,70 kDa; sau 72 giờ lên men, toàn bộ các vạch protein lớn trên gel đều biến mất, chỉ còn lại các phân tử peptide nhỏ dưới 15 kDa.
  • Đối với mẫu không tiệt trùng trước lên men (LM 3K): Các vạch protein lớn của glycinin và $\beta$-conglycinin vẫn tồn tại đậm nét qua các mốc 0h đến 96h, cho thấy vi khuẩn không thể phân giải triệt để các cấu trúc protein bậc cao nếu không có bước biến tính nhiệt ban đầu.
• Kết quả sắc ký thẩm thấu gel (GPC/HPLC):
  • Mẫu ARG nguyên liệu chỉ xuất hiện các đại phân tử trong dải $10^4 - 10^5\text{ kDa}$ (với mật độ phân đoạn $9 \times 10^4\text{ kDa}$ có giá trị $W(\log M) = 1,5$).
  • Trong quá trình lên men (0h, 24h, 48h), các đỉnh phổ dịch chuyển mạnh sang vùng phân tử lượng thấp ($10^1, 10^2, 10^3\text{ kDa}$). Tỷ trọng phân đoạn $9 \times 10^4\text{ kDa}$ giảm 1,7 lần ngay sau khi xử lý nhiệt và tiếp tục giảm xuống mức $W = 0,59$ ở 48 giờ, đồng thời gia tăng đột biến mật độ các phân đoạn $1 \times 10^3\text{ kDa}$ và $3 \times 10^1\text{ kDa}$, khẳng định sự phân giải hoàn toàn của các đại phân tử kháng dinh dưỡng.

---

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã thu được các kết quả định lượng cụ thể và mang lại những đóng góp rõ ràng về mặt khoa học thực nghiệm:

• Tuyển chọn chủng vi sinh vật: Đã sàng lọc và xác định được chủng Bacillus velezensis LM 3 có hoạt tính protease ngoại bào vượt trội, tạo vòng phân giải casein đạt đường kính tối đa 88,90 mm sau 72 giờ, vượt xa các chủng B. subtilis và B. pumilus đối chứng.
• Tối ưu hóa quy trình lên men: Xác lập quy trình lên men thể rắn SBM ở độ ẩm ban đầu 40%, bổ sung 1% rỉ đường, 5% chế phẩm vi sinh, lên men tại 37°C trong 96 giờ.
• Cải thiện giá trị dinh dưỡng:
  • Nâng cao hàm lượng protein tổng số lên 51,30% (quy mô 1,0 kg) và 53,58% (quy mô 10g).
  • Tăng hàm lượng protein hòa tan trong nước từ 8,23% lên 18,40%.
  • Tăng chỉ số phân tán nitơ (NSI) từ 17,54% lên 35,87%.
  • Đưa chỉ số độ hòa tan trong KOH về mức 75,00% (mức lý tưởng cho khả năng tiêu hóa).
  • Cắt giảm hàm lượng chất ức chế trypsin (TI) hơn 55% (từ 2,78 mg/g xuống 1,23 mg/g).
• Làm rõ cơ chế xử lý nguyên liệu: Chứng minh bước xử lý nhiệt/tiệt trùng (121°C trong 15 phút) trước khi lên men là điều kiện tiên quyết để làm biến tính cấu trúc bậc cao của các protein kháng nguyên ($\beta$-conglycinin và glycinin), giúp protease vi sinh vật tiếp cận và cắt nhỏ hoàn toàn protein thành các phân đoạn peptide $<15\text{ kDa}$.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận đã thẳng thắn ghi nhận một số giới hạn kỹ thuật trong phạm vi đề tài và đề xuất các hướng mở rộng:

• Hạn chế:
  • Quy mô thí nghiệm còn ở mức nhỏ (10 g và 1,0 kg); thao tác đảo trộn thủ công ở quy mô 1,0 kg chưa đảm bảo phân tán đều vi sinh vật như ở quy mô nhỏ, dẫn đến hàm lượng protein tổng số thu được có sự chênh lệch.
  • Chưa định lượng chi tiết profin của từng axit amin tự do và axit amin thiết yếu sau lên men.
  • Chưa phân tích hoạt tính của các enzyme phân giải khác như phytase hay mức độ suy giảm của các đường oligosaccharide gây đầy hơi (stachyose, raffinose).
• Kiến nghị và hướng nghiên cứu tiếp:
  1. Nghiên cứu công nghệ lên men hai giai đoạn (two-stage fermentation) kết hợp giữa Bacillus velezensis và các chủng vi khuẩn lactic (Lactobacillus plantarum) hoặc nấm men/nấm mốc (Aspergillus oryzae) nhằm vừa phân giải protein vừa sinh axit lactic hạ pH bảo quản.
  2. Phân tích thành phần và hàm lượng các axit amin tự do của bã đậu nành lên men (FSBM) so với bã đậu nành ban đầu (SBM).
  3. Khảo sát hoạt tính của enzyme phytase trong việc phân giải axit phytic và khảo sát sự phân bố các hợp chất oligosaccharide trong sản phẩm bã đậu nành sau lên men.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận tốt nghiệp này có giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho nhiều nhóm đối tượng:

• Sinh viên và học viên cao học: Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học, Dinh dưỡng Thức ăn Chăn nuôi và Nuôi trồng Thủy sản có thể sử dụng làm tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp bố trí thí nghiệm lên men thể rắn (SSF) và các phương pháp phân tích sinh hóa protein (phương pháp Lowry, Kjeldahl, Phenol-Sulfuric, SDS-PAGE, GPC/HPLC).
• Kỹ sư và nhà nghiên cứu R&D: Các phòng nghiên cứu phát triển sản phẩm thức ăn chăn nuôi có thể tham khảo quy trình công nghệ sử dụng Bacillus velezensis để sản xuất đạm sinh học tiêu hóa cao thay thế bột cá trong khẩu phần ăn của heo con cai sữa, tôm và cá.
• Nội dung tham khảo nổi bật: Bảng tính toán lượng nước bổ sung điều chỉnh độ ẩm cơ chất, kỹ thuật lập đường chuẩn Lowry và quy trình chuẩn bị hóa chất nhuộm - phân tách điện di SDS-PAGE cho protein thực vật.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chủng vi khuẩn Bacillus velezensis (LM 3) lại được chọn làm tác nhân lên men thay vì các chủng Bacillus subtilis khác?
Dựa trên kết quả khảo sát đường cong sinh trưởng và hoạt tính protease trên đĩa thạch YNB bổ sung casein, chủng LM 3 (B. velezensis) có pha log ổn định (bắt đầu từ giờ thứ 3 và duy trì pha cân bằng suốt 8 giờ), đồng thời tạo ra vòng phân giải casein có đường kính lên tới 88,90 mm sau 72 giờ (thủy phân hoàn toàn bề mặt thạch), vượt trội hoàn toàn so với các chủng B. subtilis LM 1 (12,50 mm), LM 2 (12,00 mm) và B. pumilus LM 4 (0 mm).

2. Bước hấp tiệt trùng khô đậu nành (121°C trong 15 phút) trước khi lên men có vai trò quyết định như thế nào?
Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy ở mẫu không tiệt trùng trước lên men (LM 3K), các vạch protein kháng nguyên lớn ($\beta$-conglycinin 107,3 kDa và glycinin 31,2 kDa) vẫn tồn tại nguyên vẹn sau 96 giờ lên men. Ngược lại, ở mẫu có tiệt trùng (LM 3T), nhiệt độ cao đã làm biến tính cấu trúc bậc cao của protein, tạo điều kiện cho enzyme protease của B. velezensis cắt nhỏ hoàn toàn các phân đoạn này thành peptide có khối lượng dưới 15 kDa sau 72 giờ.

3. Vì sao hàm lượng protein tổng số và tro thô lại tăng lên sau quá trình lên men thể rắn?
Trong quá trình lên men, vi khuẩn B. velezensis sử dụng carbohydrate trong bã đậu nành làm cơ chất cho quá trình hô hấp tế bào để tạo năng lượng, chuyển hóa carbohydrate thành khí $CO_2$ và hơi nước $H_2O$ thoát ra ngoài. Việc suy giảm tỷ lệ phần trăm carbohydrate tổng trong khối vật chất khô đã làm gia tăng tỷ trọng tương đối của protein tổng số và tro thô trong sản phẩm cuối cùng.

4. Sản phẩm bã đậu nành lên men trong nghiên cứu có điểm gì vượt trội so với các mẫu thương phẩm (TT 50, TT 53, TT 55) trên thị trường?
Mặc dù các mẫu thị trường có hàm lượng protein tổng số đo được cao hơn (đạt từ 56,26% đến 63,85%), hàm lượng protein hòa tan trong nước của các mẫu thương phẩm này chỉ đạt từ 7,02% đến 8,02%. Trong khi đó, sản phẩm bã đậu nành lên men bằng B. velezensis trong nghiên cứu đạt hàm lượng protein hòa tan lên tới 18,40% (ở điều kiện lên men quy mô 1,0 kg) và 16,00% (ở mẫu không tiệt trùng), thể hiện khả năng hòa tan và tiềm năng hấp thu vượt trội.

5. Lượng nước cần bổ sung để đưa độ ẩm khô đậu nành lên mức 40% được tính toán theo công thức nào?
Lượng nước bổ sung $x$ (mL) được tính toán dựa trên khối lượng bã đậu ban đầu $m$ (g), độ ẩm ban đầu của mẫu $a%$ (xác định bằng cân sấy ẩm hồng ngoại) và độ ẩm mục tiêu $b% = 40%$ theo công thức: $$x = \frac{m(b% - a%)}{(1 - b%) \times 100%}$$ Trong lượng nước này đã bao gồm 1% rỉ đường và 5% thể tích dịch vi sinh vật tính theo khối lượng cơ chất.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Trần Kiều Hương và Lương Thị Ngọc Sang đã xây dựng thành công quy trình công nghệ sản xuất khô đậu nành lên men bằng phương pháp lên men thể rắn sử dụng chủng vi khuẩn Bacillus velezensis LM 3. Nghiên cứu chứng minh rằng quá trình lên men trong 96 giờ kết hợp xử lý nhiệt ban đầu giúp phân giải triệt để các đại phân tử protein dị ứng (glycinin, $\beta$-conglycinin) thành các peptide nhỏ dưới 15 kDa, đồng thời giảm hơn 55% hoạt tính chất ức chế trypsin và nâng cao rõ rệt hàm lượng protein hòa tan trong nước. Đây là công trình thực nghiệm hoàn chỉnh, cung cấp cơ sở khoa học xác thực và dữ liệu kỹ thuật giá trị cho việc ứng dụng công nghệ sinh học nhằm gia tăng giá trị dinh dưỡng của phụ phẩm nông nghiệp phục vụ ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi chất lượng cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF TECHNOLOGY AND EDUCATION FACULTY FOR HIGH QUALITY TRAINING GRADUATION PROJECT FOOD TECHNOLOGY PREPARATION OF FERMENTED SOYBEAN MEAL BY SOLID-STATE FERMENTATION LECTURER: ASSOC. TRINH KHANH SON STUDENT: TRAN KIEU HUONG LUONG THI NGOC SANG SKL 0 0 9 1 2 4 Ho Chi Minh City, August, 2022 HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF TECHNOLOGY AND EDUCATION FACULTY FOR HIGH QUALITY TRAINING GRADUATION PROJECT Thesis code: 2022-18116020 PREPARATION OF FERMENTED SOYBEAN MEAL BY SOLID-STATE FERMENTATION TRAN KIEU HUONG Student ID: 18116020 LUONG THI NGOC SANG Student ID: 18116034 Major: FOOD TECHNOLOGY Supervisor: ASSOC. TRINH KHANH SON Ho Chi Minh City, August 8th, 2022 i HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF TECHNOLOGY AND EDUCATION FACULTY FOR HIGH QUALITY TRAINING GRADUATION PROJECT Thesis code: 2022-18116020 PREPARATION OF FERMENTED SOYBEAN MEAL BY SOLID-STATE FERMENTATION TRAN KIEU HUONG Student ID: 18116020 LUONG THI NGOC SANG Student ID: 18116034 Major: FOOD TECHNOLOGY Supervisor: ASSOC. TRINH KHANH SON Ho Chi Minh City, August 8th, 2022 i ii ACKNOWLEDGEMENTS First of all, we would like to express our sincere and deep thanks to the teachers in the Department of Food Technology – Faculty of High-Quality Education – University of Technology and Education of Ho Chi Minh City for their dedication to conveying their knowledge during the past four years, creating all conditions for facilities and equipment to help us complete the thesis in the best way.

In particular, we would like to thank Assoc. Trinh Khanh Son who was very dedicated to helping, guiding, and imparting knowledge and experience to help us complete the graduation thesis on time. Finally, we would like to thank our family and friends by our side for supporting us, giving us time to research the topic and wholeheartedly supporting us mentally during the course of the thesis. We have tried to research and research to best complete the graduation thesis, but we are still limited in knowledge and experience, so there are bound to be shortcomings.

We hope to receive the contributions of teachers and friends to improve the topic. Thank you very much! iii iv v vi vii viii ix x xi xii xiii xiv xv xvi TABLE OF CONTENTS ACKNOWLEDGEMENTS. Error! Bookmark not defined. Error! Bookmark not defined.

TABLE OF CONTENTS. xvii LIST OF FIGURES. xix LIST OF TABLES. xx LIST OF ABBREVIATIONS.

Overview of Soybean Meal. Introduction of Soybean Meal. Properties of Soybean Meal. The role of B.

Overview of Fermented Soybean meal. The reason for creating the topic. MATERIALS AND METHODS. Materials, chemicals and equipment.

Materials and Chemicals. Investigation of the growth ability of microbial strains. Evaluation of proteolytic activity. Solid-state fermentation (SSF) in soybean meal.

Determination of protein content. Determination of total carbohydrate by Phenol-Sulfuric Acid method. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Gel Permeation Chromatography (GPC) analysis.

Selection of microorganisms with intense protease activity. Chemical composition of soybean meal (SBM). Enzyme-degrading protein concentration. Protein molecular weight.

24 CHAPTER 4: CONCLUSION AND RECOMMENDATIONS. 31 xviii LIST OF FIGURES Figure 2. Solid-state fermentation process SBM. Procedure for measuring soluble protein according to the Lowry method.

Growth curve of strain LM 1……… …………………………………………………………………………………. Growth curve of strain LM 2. Growth curve of strain LM 3. Growth curve of strain LM 4.

The zone of clearance on YNB agar plates by strain LM 1 at 37˚C for 24h, 48h, 72h (from left to right). The zone of clearance on YNB agar plates by strain LM 2 at 37˚C for 24h, 48h, 72h (from left to right). The zone of clearance on YNB agar plates by strain LM 3 at 37˚C for 24h, 48h, 72h (from left to right). The zone of clearance on YNB agar plates by strain LM 4 at 37˚C for 24h, 48h, 72h (from left to right).

Results of identification of microorganisms of strain LM3. Protein molecular weight based on SDS-PAGE electrophoresis results of soybean meal samples sterilized before LM 3T fermentation under condition 1. Protein molecular weight based on SDS-PAGE electrophoresis results of unsterilized soybean meal samples before LM 3K fermentation under condition 3.