Luận văn thạc sĩ: Tinh chế hạt giống virus Dengue từ nuôi cấy tế bào côn trùng

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu quy trình tinh chế hạt giống virus dengue từ nuôi cấy tế bào côn trùng, ứng dụng trong sản xuất vaccine và chẩn đoán.

• Tác giả: Bach Thi Dung
• Người hướng dẫn: Asst. Kanokwan Poomputsa
• Trường học: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Purification Of Dengue Virus Like Particle From Insect Cell Culture
• Loại tài liệu: Bachelor Thesis
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thai Nguyen

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• ABSTRACT
• 1. PART 1: INTRODUCTION
• 1.1. Dengue infection/ disease
• 1.2. Structure
• 1.3. Life cycle
• 1.4. Immune system interaction
• 1.5. Dengue vaccine types
• 2. PART 2: MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Equipments and Materials
• 2.2. Collection of Dengue VLP from Sf9-Dg stable cells
• 2.3. Purification of dengue Virus-Like-Particle by HiTrap™ Blue column chromatography (Affinity chromatography)
• 2.4. Purification of Dengue Virus-Like-Particle by ÄKTA™ flux
• 2.5. Purification of Dengue Virus-Like-Particle by Aqueous two-phase system (ATPS)
• 2.6. Concentration of Dengue VLP by 100 KDa MWCO Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices for volumes up to 4 mL
• 2.7. Concentration of Dengue VLP by 35% PEG precipitation
• 2.8. Concentration of Dengue VLP by Acetone precipitation
• 2.9. Western Blot Analysis of Dengue VLP
• 2.10. Commassie Blue Staining Analysis
• 2.11. Silver Staining Analysis
• 2.12. Dot Blot Analysis
• 3. PART 3: RESULTS AND DISCUSSIONS
• 3.1. Purification of dengue Virus-Like-Particle by HiTrap™ BLUE column chromatography
• 3.2. Purification of Dengue Virus Like Particle (VLP) by ÄKTA™ flux
• 3.3. Purification of Dengue Virus Like Particle by Aqueous two-phase system (ATPS)
• 4. PART 4: CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS
• LIST OF TABLE
• LIST OF FIGURES
• LIST OF ABBREVIATION

Tóm tắt

I. Tinh chế hạt giống virus Dengue

Tinh chế hạt giống virus là quá trình quan trọng trong sản xuất vaccine Dengue. Nghiên cứu này tập trung vào việc tinh chế hạt giống virus Dengue từ nuôi cấy tế bào côn trùng, cụ thể là tế bào Sf9. Phương pháp tinh chế bao gồm sắc ký cột, lọc chéo tiếp tuyến và hệ thống hai pha nước (ATPS). Kết quả cho thấy ATPS là phương pháp hiệu quả nhất, giúp tách hạt giống virus Dengue khỏi các tạp chất protein lớn trong môi trường nuôi cấy.

1.1. Nuôi cấy tế bào côn trùng

Nuôi cấy tế bào côn trùng là bước đầu tiên trong quá trình tinh chế hạt giống virus Dengue. Tế bào Sf9 được nuôi trong môi trường TNMFH bổ sung 10% huyết thanh bò thai (FBS). Quá trình này tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân lên của virus Dengue trong tế bào chủ. Tế bào côn trùng nuôi cấy được chọn vì khả năng biểu hiện protein virus cao và ổn định.

1.2. Phương pháp tinh chế

Ba phương pháp tinh chế được áp dụng: sắc ký cột HiTrap™ Blue, lọc chéo tiếp tuyến bằng ÄKTA™ flux và hệ thống hai pha nước (ATPS). ATPS cho thấy hiệu quả vượt trội trong việc tách hạt giống virus Dengue khỏi albumin và các tạp chất protein khác. Phương pháp này không chỉ đơn giản mà còn tiết kiệm chi phí, phù hợp với quy mô sản xuất lớn.

II. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu này có giá trị thực tiễn cao trong việc phát triển vaccine phòng bệnh sốt xuất huyết Dengue. Hạt giống virus Dengue tinh chế từ nuôi cấy tế bào côn trùng có thể được sử dụng để sản xuất virus-like particle (VLP), một ứng cử viên tiềm năng cho vaccine. VLP có cấu trúc giống với virus tự nhiên nhưng không chứa vật liệu di truyền, đảm bảo an toàn và hiệu quả trong việc kích thích phản ứng miễn dịch.

2.1. Sản xuất vaccine

Hạt giống virus Dengue tinh chế là nguyên liệu quan trọng để sản xuất vaccine. VLP được tạo ra từ nuôi cấy tế bào côn trùng có khả năng kích thích hệ miễn dịch mà không gây bệnh. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển vaccine an toàn và hiệu quả, đặc biệt là ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới.

2.2. Giảm chi phí sản xuất

Việc sử dụng tế bào côn trùng nuôi cấy và phương pháp tinh chế hiệu quả như ATPS giúp giảm đáng kể chi phí sản xuất. Điều này làm cho vaccine trở nên dễ tiếp cận hơn, đặc biệt là ở các quốc gia đang phát triển, nơi bệnh sốt xuất huyết Dengue đang là vấn đề nghiêm trọng.

III. Kết luận và đề xuất

Nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của phương pháp tinh chế hạt giống virus Dengue từ nuôi cấy tế bào côn trùng. ATPS là phương pháp ưu việt, mang lại hiệu quả cao và tiết kiệm chi phí. Kết quả này mở ra tiềm năng lớn trong việc sản xuất vaccine phòng bệnh sốt xuất huyết Dengue, góp phần giải quyết vấn đề y tế toàn cầu.

3.1. Hướng nghiên cứu tương lai

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình tinh chế virus và nâng cao hiệu quả sản xuất VLP. Việc kết hợp các công nghệ mới như kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử có thể giúp cải thiện chất lượng và số lượng hạt giống virus Dengue.

3.2. Ứng dụng rộng rãi

Kết quả nghiên cứu cần được áp dụng rộng rãi trong các chương trình sản xuất vaccine, đặc biệt là ở các quốc gia có tỷ lệ mắc bệnh sốt xuất huyết Dengue cao. Sự hợp tác giữa các tổ chức y tế và nhà sản xuất vaccine là yếu tố then chốt để đạt được mục tiêu này.

Nội dung chính

## Tổng quan nghiên cứu

Bệnh sốt xuất huyết Dengue là một trong những vấn đề y tế toàn cầu nghiêm trọng, đặc biệt phổ biến ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới như Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm có khoảng 50-100 triệu người nhiễm bệnh, với khoảng 25.000 ca tử vong, chủ yếu là trẻ em. Bệnh do virus Dengue (DENV) gây ra, truyền qua muỗi Aedes spp, có thể gây ra các triệu chứng từ sốt Dengue nhẹ đến sốt xuất huyết Dengue nặng và sốc Dengue. Hiện nay, việc phát triển vaccine phòng bệnh là cấp thiết nhằm kiểm soát sự lây lan của dịch bệnh.

Mục tiêu nghiên cứu là tinh sạch hạt giống virus Dengue dạng hạt giống virus-like particle (VLP) từ môi trường nuôi cấy tế bào côn trùng, nhằm phục vụ cho phát triển vaccine Dengue an toàn và hiệu quả. Nghiên cứu tập trung vào việc so sánh hiệu quả của ba phương pháp tinh sạch: sắc ký cột ái lực, lọc chéo dòng (tangential flow filtration) và hệ thống pha hai nước (ATPS). Phạm vi nghiên cứu thực hiện trên tế bào Sf9 được chuyển gen ổn định, nuôi cấy trong môi trường TNMFH bổ sung 10% huyết thanh bò bào thai (FBS) tại Đại học Nông Lâm Thái Nguyên trong giai đoạn 2012-2016.

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chất lượng và hiệu quả sản xuất vaccine Dengue, góp phần giảm thiểu tỷ lệ mắc và tử vong do bệnh sốt xuất huyết, đồng thời mở rộng ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất vaccine dưới điều kiện an toàn sinh học cao.

## Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

### Khung lý thuyết áp dụng

- **Virus Dengue và cấu trúc**: Virus Dengue là virus RNA đơn sợi thuộc họ Flaviviridae, gồm 5 kiểu huyết thanh (DENV-1 đến DENV-5). Hạt virus có đường kính khoảng 50 nm, bao gồm các protein cấu trúc như capsid (C), prM (tiền thân màng), và E (vỏ bọc), cùng các protein không cấu trúc NS1 đến NS5. Protein E đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập tế bào chủ và kích thích đáp ứng miễn dịch.

- **Virus-like particles (VLPs)**: VLP là các hạt virus giả có cấu trúc tương tự virus thật nhưng không chứa vật liệu di truyền, do đó an toàn và có khả năng kích thích miễn dịch mạnh mẽ. VLP được xem là ứng viên vaccine tiềm năng, đặc biệt trong các vaccine dưới dạng tiểu đơn vị.

- **Phương pháp tinh sạch protein**: Dựa trên các tính chất vật lý và hóa học của protein, các kỹ thuật như sắc ký ái lực, lọc chéo dòng và hệ thống pha hai nước được sử dụng để tách chiết và tinh sạch VLP khỏi các tạp chất như albumin trong môi trường nuôi cấy.

### Phương pháp nghiên cứu

- **Nguồn dữ liệu**: Mẫu nghiên cứu là dịch nuôi cấy tế bào Sf9 côn trùng được chuyển gen ổn định biểu hiện protein prM và E của virus Dengue, nuôi trong môi trường TNMFH bổ sung 10% FBS.

- **Phương pháp phân tích**: Ba kỹ thuật tinh sạch được áp dụng gồm:

  1. **Sắc ký cột ái lực HiTrap™ Blue**: Dựa trên khả năng liên kết chọn lọc của ligand Cibacron Blue F3G-A với albumin để loại bỏ tạp chất.
  
  2. **Lọc chéo dòng (ÄKTA™ flux)**: Sử dụng màng lọc có kích thước cắt 10 kDa và 50 kDa để phân tách protein dựa trên kích thước phân tử.
  
  3. **Hệ thống pha hai nước (ATPS)**: Sử dụng pha PEG và muối để tách protein dựa trên tính chất phân cực và trọng lượng phân tử.

- **Timeline nghiên cứu**: Quá trình thu thập mẫu, tinh sạch và phân tích kéo dài trong giai đoạn 2012-2016, với các bước chuẩn bị mẫu, tinh sạch, cô đặc và phân tích bằng SDS-PAGE, nhuộm Coomassie, nhuộm bạc, Western blot và Dot blot.

- **Cỡ mẫu**: Mẫu dịch nuôi cấy được thu thập từ nhiều lần nuôi cấy tế bào Sf9 ổn định, đảm bảo tính đại diện và độ tin cậy của kết quả.

## Kết quả nghiên cứu và thảo luận

### Những phát hiện chính

1. **Hiệu quả của sắc ký cột HiTrap™ Blue**: Phương pháp này có khả năng liên kết albumin trong môi trường nuôi cấy, tuy nhiên do nồng độ albumin quá cao vượt quá khả năng hấp phụ của cột, albumin vẫn còn tồn tại trong mẫu tinh sạch. Protein E (~50 kDa) và prM (~20 kDa) được phát hiện chủ yếu trong phần dòng chảy qua cột, chứng tỏ VLP không bị giữ lại. Kết quả Western blot xác nhận sự hiện diện của protein E trong dòng chảy qua.

2. **Lọc chéo dòng với màng 10 kDa và 50 kDa**: Kết quả cho thấy VLP tồn tại trong phần giữ lại và rửa màng, nhưng albumin vẫn xuất hiện trong tất cả các phần, cho thấy màng lọc có kích thước cắt chưa đủ lớn để tách biệt hoàn toàn VLP và albumin.

3. **Hệ thống pha hai nước (ATPS)**: Phương pháp này cho thấy khả năng tách biệt tốt hơn giữa VLP và albumin. VLP chủ yếu tập trung ở pha giàu PEG (pha trên), trong khi albumin tập trung ở pha trung gian và pha đáy. Dot blot và nhuộm bạc cho thấy sự hiện diện rõ ràng của protein E trong pha trên, đặc biệt ở pH 8.0, cho thấy điều kiện này tối ưu cho quá trình tinh sạch.

### Thảo luận kết quả

- Nguyên nhân chính khiến sắc ký HiTrap™ Blue không loại bỏ hoàn toàn albumin là do nồng độ albumin trong môi trường nuôi cấy quá cao, vượt quá khả năng hấp phụ của cột. Điều này làm giảm hiệu quả tinh sạch VLP.

- Lọc chéo dòng với màng 10 kDa và 50 kDa không đủ phân biệt kích thước giữa albumin và VLP, do đó cần thử nghiệm màng có kích thước cắt lớn hơn (100 kDa hoặc 500 kDa) để cải thiện hiệu quả.

- ATPS cung cấp môi trường nhẹ nhàng, nhanh chóng và hiệu quả trong việc tách VLP khỏi các tạp chất protein lớn như albumin. Việc điều chỉnh pH và nồng độ muối, PEG có thể tối ưu hóa thêm hiệu suất thu hồi VLP.

- Kết quả phù hợp với các nghiên cứu trước đây về ứng dụng ATPS trong tinh sạch protein và virus-like particles, đồng thời mở ra hướng đi mới cho sản xuất vaccine Dengue an toàn và hiệu quả.

- Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh tỷ lệ thu hồi VLP và loại bỏ albumin giữa ba phương pháp, cũng như bảng phân tích định lượng protein trong từng pha/tầng.

## Đề xuất và khuyến nghị

1. **Tối ưu hóa pH và nồng độ trong sắc ký HiTrap™ Blue**: Điều chỉnh pH của dung dịch đệm gắn và rửa để tăng khả năng liên kết albumin, đồng thời giảm nồng độ huyết thanh trong môi trường nuôi cấy để tránh quá tải cột.

2. **Sử dụng màng lọc có kích thước cắt lớn hơn trong lọc chéo dòng**: Áp dụng màng 100 kDa hoặc 500 kDa để phân tách hiệu quả hơn giữa VLP và albumin, nâng cao độ tinh khiết sản phẩm.

3. **Tối ưu hóa hệ thống pha hai nước (ATPS)**: Thay đổi trọng lượng phân tử và nồng độ PEG, muối, cũng như điều chỉnh pH để tăng tỷ lệ thu hồi VLP và loại bỏ tạp chất.

4. **Phát triển quy trình kết hợp đa bước**: Kết hợp các phương pháp tinh sạch như ATPS trước, sau đó sử dụng lọc chéo dòng hoặc sắc ký để đạt độ tinh khiết cao nhất, phù hợp cho sản xuất vaccine quy mô lớn.

5. **Thời gian thực hiện**: Các đề xuất trên nên được triển khai trong vòng 1-2 năm tiếp theo để hoàn thiện quy trình sản xuất.

6. **Chủ thể thực hiện**: Các phòng thí nghiệm nghiên cứu vaccine, các công ty công nghệ sinh học và các viện nghiên cứu y sinh.

## Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. **Nhà nghiên cứu vaccine và công nghệ sinh học**: Nghiên cứu về sản xuất và tinh sạch các hạt virus-like particles, phát triển vaccine mới.

2. **Cơ sở sản xuất vaccine**: Áp dụng quy trình tinh sạch hiệu quả để nâng cao chất lượng sản phẩm, giảm chi phí sản xuất.

3. **Sinh viên và học giả ngành công nghệ sinh học, y sinh**: Tìm hiểu về kỹ thuật tinh sạch protein và ứng dụng trong sản xuất vaccine.

4. **Cơ quan quản lý y tế và chính sách**: Đánh giá các công nghệ mới trong phòng chống dịch bệnh sốt xuất huyết, hỗ trợ quyết định đầu tư nghiên cứu và phát triển vaccine.

## Câu hỏi thường gặp

1. **Virus-like particles (VLP) là gì và tại sao chúng quan trọng trong vaccine?**  
VLP là các hạt virus giả có cấu trúc giống virus thật nhưng không chứa vật liệu di truyền, do đó an toàn và có khả năng kích thích miễn dịch mạnh mẽ. Chúng giúp tạo ra vaccine hiệu quả mà không gây bệnh.

2. **Tại sao việc tinh sạch VLP từ môi trường nuôi cấy tế bào côn trùng lại khó khăn?**  
Môi trường nuôi cấy chứa nhiều protein tạp như albumin với nồng độ cao, gây khó khăn trong việc tách biệt VLP khỏi các tạp chất này, đòi hỏi kỹ thuật tinh sạch phức tạp và hiệu quả cao.

3. **Phương pháp nào trong nghiên cứu cho hiệu quả tinh sạch VLP tốt nhất?**  
Hệ thống pha hai nước (ATPS) cho kết quả tốt nhất trong việc tách biệt VLP khỏi albumin và các tạp chất lớn, đặc biệt khi điều chỉnh pH ở mức 8.0.

4. **Lọc chéo dòng có ưu điểm gì trong tinh sạch VLP?**  
Lọc chéo dòng giúp cô đặc và loại bỏ các phân tử nhỏ hơn kích thước màng lọc, giữ lại các phân tử lớn như VLP, tuy nhiên cần lựa chọn màng có kích thước cắt phù hợp để đạt hiệu quả cao.

5. **Làm thế nào để tối ưu hóa quy trình tinh sạch VLP cho sản xuất vaccine?**  
Cần kết hợp các phương pháp tinh sạch, điều chỉnh các thông số kỹ thuật như pH, nồng độ muối, trọng lượng phân tử của polymer, và lựa chọn màng lọc phù hợp để tăng hiệu quả thu hồi và độ tinh khiết của VLP.

## Kết luận

- Đã sản xuất thành công hạt virus-like particle Dengue từ tế bào côn trùng Sf9 ổn định trong môi trường TNMFH bổ sung 10% FBS.  
- Ba phương pháp tinh sạch được đánh giá gồm sắc ký cột HiTrap™ Blue, lọc chéo dòng ÄKTA™ flux và hệ thống pha hai nước (ATPS).  
- ATPS cho hiệu quả tinh sạch tốt nhất, tách biệt rõ ràng VLP khỏi albumin và tạp chất, đặc biệt ở pH 8.0.  
- Cần tối ưu hóa các thông số kỹ thuật và kết hợp các phương pháp để nâng cao hiệu quả tinh sạch trong sản xuất vaccine.  
- Đề xuất triển khai nghiên cứu tiếp theo trong 1-2 năm tới nhằm hoàn thiện quy trình sản xuất vaccine Dengue an toàn và hiệu quả.

**Hành động tiếp theo**: Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học áp dụng và phát triển quy trình tinh sạch VLP dựa trên kết quả nghiên cứu này để thúc đẩy sản xuất vaccine Dengue quy mô công nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

THAI NGUYEN UNIVERSITY UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY BACH THI DUNG Topic title: PURIFICATION OF DENGUE VIRUS LIKE PARTICLE FROM INSECT CELL CULTURE BACHELOR THESIS Study Mode : Full-time Major : Biotechnology Faculty : Biotechnology and Food Technology Batch : 2012 – 2016 Thai Nguyen, 15/08/2016 n THAI NGUYEN UNIVERSITY UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY BACH THI DUNG Topic title: PURIFICATION OF DENGUE VIRUS LIKE PARTICLE FROM INSECT CELL CULTURE BACHELOR THESIS Study Mode : Full-time Major : Biotechnology Faculty : Biotechnology and Food Technology Batch : 2012 – 2016 Supervisors : Asst. Kanokwan Poomputsa __________ Dr. Nguyen Xuan Vu ______________ Thai Nguyen, 15/08/2016 n DOCUMENTATION PAGE WITH ABSTRACT Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry Major Biotechnology Student name Bach Thi Dung Student ID DTN1253150043 Thesis title Purification of dengue Virus-like-particle from insect cell culture Supervisors 1. Nguyen Xuan Vu Abstract: Dengue infection, a disease caused by the Dengue virus infection, is one of a global health problem in the tropics and subtropical areas.

To prevent the spreading of this disease, vaccination using Dengue vaccine is needed. One of the vaccine candidates against Dengue virus (DENV) is Dengue virus like particle (VLP). Dengue VLP which is a particle with structure is identical to the native. Dengue virus with no genetic material is potential to highly and safely elicit the immune response.

In this study, Dengue VLP produced from stable transfected insect cells cultured in TNMFH medium supplemented with 10% feval bovine serum (FBS) was purified by three methods: affinity column chromatography, tangential cross-flow filtration, and aqueous two-phase system (ATPS). The result showed that ATPS was the best method that can separate Dengue VLP from albumin as well as the biggest protein impurities in the culture medium. Key words Purification, DENV, Dengue virus like particle, Concentration, affinity column chromatography, tangential cross-flow filtration, ATPS Number of pages 37 i n ACKNOWLEDGEMENT Attain this thesis; I would like to express my deep gratitude to my thesis advisor Asst. Kanokwan Poomputsa from the School of Bioresources and Technology, King Mongkut’s University of Technology Thonburi (KMUTT), Thailand.

The door to her office was always opened whenever I ran into a trouble spot or had questions about my research or writing. She consistently allowed this paper to be my own work, but steered me in the right direction whenever she though I need it. I would also like to thank Dr. Nguyen Xuan Vu from the Biotechnology and Food Department of Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry (TUAF) who used to help, support and give me encouragements during this thesis implementation.

I would also like to extend my heartfelt thanks to my teachers of Biotechnology and Food Department, TUAF who imparted me a lot of knowledge through four years of university. The knowledge not only helped me with my research but also created a basic and soul foundation for me to start the job in the future. Further, I would also like to express my sincere gratitude to Dr. Duong Van Cuong and Msc.

Trinh Thi Chung for providing me the opportunity to develop my skills by doing an internship abroad. I sincerely thank to the teachers, the laboratory staffs and students at Animals Cell Culture laboratory for their regards and giving me an opportunity to do research in the laboratory. I would also especially thank Msc. Marlita who always helped, cared and taught me as my sister during my practicing in Thailand.

I am especially grateful to my dear mother, Duong Thi Nga and all my family and to the many old and dear friends who have stood by my side trough the many ups and downs of this long campaign. Many thank you and best regards, Student Bach Thi Dung ii n CONTENTS LIST OF TABLE. vi LIST OF FIGURES .iv LIST OF ABBREVIATION .viii PART 1: INTRODUCTION. Dengue infection/ disease.

Immune system interaction .1 Dengue vaccine types .2 Dengue vaccine production .4 Production of dengue virus like particle (VLP) from insect cell culture .5 Dengue virus like particle (VLP) purification from cell culture. HiTrap™ Blue column chromatography. Cross filtration by ÄKTA™ flux s. Aqueous two-phase system.

Scope of study. 14 PART 2: MATERIALS AND METHODS .1 Equipments and Materials .1 Collection of Dengue VLP from Sf9-Dg stable cells .2 Purification of dengue Virus-Like-Particle by HiTrap™ Blue column chromatography (Affinity chromatography) .3 Purification of Dengue Virus-Like-Particle by ÄKTA™ flux .4 Purification of Dengue Virus-Like-Particle by Aqueous two-phase system (ATPS) .5 Concentration of Dengue VLP by 100 KDa MWCO Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices for volumes up to 4 mL .6 Concentration of Dengue VLP by 35% PEG precipitation .7 Concentration of Dengue VLP by Acetone precipitation .8 Western Blot Analysis of Dengue VLP .9 Commassie Blue Staining Analysis .10 Silver Staining Analysis .11 Dot Blot Analysis. 21 PART 3: RESULTS AND DISCUSSIONS .1 Purification of dengue Virus- Like- Particle by HiTrap™ BLUE column chromatography .2 Purification of Dengue Virus Like Particle (VLP) by ÄKTA™ flux .2 Purification of Dengue Virus Like Particle by Aqueous two-phase system (ATPS). 31 iv n PART 4: CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS.

41 v n LIST OF TABLE TABLE PAGE 1 Technique of purification protein base on different property 10 vi n LIST OF FIGURES Figure 1.1: Time course of clinical signs and symptoms .2: Structure of Dengue virus .3: Dengue virus life cycle (website: http://www.com/dengue- virus.4: Model of antibody-dependent enhancement of dengue infection .5: Types of dengue vaccines .1: Characterization of Dengue VLP from TNMFH + 10% FBS culture after purification by HiTrap™BLUE affinity chromatography column. The samples were run SDS-PAGE and were stained by Coomassie blue staining after purification by HiTrap™BLUE affinity chromatography column .2: Characterization of Dengue VLP from TNMFH+10% FBS culture after purificationby HiTrap™ BLUE affinity chromatography column. The samples were run SDS-PAGE and were stained by Silver staining after purification by HiTrap™BLUE affinity chromatography column .3: Characterization of Dengue VLP from TNMFH+10% FBS culture after purification by HiTrap™ BLUE affinity chromatography column. The samples were run SDS-PAGE and were run by Western Blot after purification by HiTrap™BLUE affinity chromatography column .4: Characterization of Dengue VLP from TNMFH+10% FBS culture after purification by 10 kDa MWCO ÄKTA™ flux .5: Characterization of Dengue VLP from TNMFH+10% FBS culture after purification by 50 kDa MWCO ÄKTA™ flux .6: Result of purification of Dengue Virus-Like-Particle by Aqueous two-phase system (ATPS) with three phases: PEG-rich phase, intermediate phase (interface) and bottom phase (Salt- rich phase) .7: Characterization of Dengue VLP from TNMFH+10% FBS culture after purification by Aqueous two-phase system (ATPS).

The samples were run SDS-PAGE and were stained by Comassie blue staining analysis (12% resolving gel electrophoresis) of Dg-VLP after purification by Aqueous two-phase system .8: Characterization of Dengue VLP from TNMFH+10% FBS culture after purification by Aqueous two-phase system (ATPS). The samples were run SDS-PAGE and were stained by Silver staining analysis (12% resolving gel electrophoresis) of Dg- VLP after purification by Aqueous two-phase system .9: Characterization of Dengue VLP from TNMFH+10% FBS culture after purification by Aqueous two-phase system (ATPS). The samples were run SDS-PAGE and were run Dot Blot analysis of Dg-VLP after purification by Aqueous two-phase system. 35 vii n LIST OF ABBREVIATION % percentage Square Centimetre °C degree centigrade or Celcius µg microgram µl microliter aa amino acid Ab antibody Bp base pair BSA bovine serum albumin C-terminal carboxy terminal DENV Dengue virus DF Dengue Fever Dg-VLP dengue virus-like-particle DHF Dengue Hemorrhagic Fever DI water Deionized water DNA deoxyribonycleic acid DSS dengue shock syndrome EtOH ethanol FBS fetal bovine serum g gram h hours IgG immunoglobulin G kb kilobase of 1,000 bp viii n kDa kiloDalton Kg kilogram L Liter M Molar (mole/ liter) mA milliampere mg milligram min minutes ml milliliter mM millimolar NaOH Sodium hydroxide NTE NaCl-Tris-EDTA buffer PBS phosphate buffer saline PBST phosphate buffer saline tween PEG Ethylene glycol or Diethylene glycol.

RNA ribonucleic acid rpm resolution per minute SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Sf-9 Spodoptera frugiperda-9 V voltage VLP virus like particle Vol volume WHO World Health Organization ix n PART 1 INTRODUCTION 1. Dengue infection/ disease Dengue is a dangerous pandemic disease that has spread rapidly in recent years. More than 100 countries around the world, especially in Southeast Asia and the Western Pacific, face the disease. World Health Organization (WHO) reported that 50-100 million people are infected by the disease each year, and approximately 25,000 people, mostly children, are death per year (WHO, 2008).

Dengue fever is a viral infection transmitted by Aedes spp mosquitoes (Simmons et al. The infection causes flu-like illness that can develop into severe hemorrhagic fever and death in patients (WHO, 2008). Nowadays, the global incidence of dengue has grown dramatically in recent decades and about half of the world's population is currently at risk of contracting the disease (Brady et al. Dengue is commonly found in the densely populated urban and semi-urban areas which climates are tropical or subtropical (Rogers et al., 2006), such as in Africa, the Americas, the Eastern Mediterranean, Southeast Asia and the Western Pacific.

Among those regions, the Southeast Asia and the Western Pacific are reported as the most gravely affected regions in which the disease death rate in children is very high (WHO, 2009; Singhasivanon and Jacobson, 2009). DENV cause a variety of symptoms from a self-limiting Dengue Fever (DF) to a life-threatening syndrome called Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) or dengue shock syndrome (DSS). The virus may cause illness in humans after an incubation period of 3 to 14 days (Figure 2.1: Time course of clinical signs and symptoms (http://www.com/signs-a-symptoms.html, 2016) Dengue viral infection has become an increasing global health concern with over two-fifths of the world's population at risk of infection and the lack of a licensed vaccine to provide protection against it (WHO, 2009). Until now, several dengue vaccine candidates are in development process, including live attenuated, chimeric live attenuated vaccine, inactivated vaccine, subunit vaccine and nucleic acid-based vaccines.

In there, subunit vaccine that is protective against five serotypes, capable to create a lifelong protection, safe, universally cover all endemic regions, and has an affordable cost for the user (Murphy and Whitehead , 2011).1 Structure The Dengue virus (DENV), is caused Dengue Fever, a small single-stranded RNA virus from the genus Flavivirus and the family Flaviviridae. DEVN comprises five distinct serotypes: DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4 and DENV-5. The distinction between these serotypes is based on their antigen (Dennis, 2013; Solomonide and Tony, 2 n 2010). The mature particle of the dengue virus is spherical with a diameter of 50 nm containing multiple copies of the three structural proteins, a host-derived membrane bilayer and a single copy of a positive-sense, single-stranded RNA genome.

The genome is about 11000 bases that is cleaved by host and viral proteases in three structural proteins (capsid, C, prM, the precursor of membrane, M, protein and envelope, E) and seven nonstructural proteins (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Distinct genotypes or lineages (viruses highly related in nucleotide sequence) have been identified within each serotype, highlighting the extensive genetic variability of the dengue serotypes (Henchal and Putnak, 1990). All of those proteins orchestrate the production of new viruses one the virus gets inside the cell (Kuhn et al, 2002). E protein E envelope proteins is located at the surface of the virus and the size is about 51 KDa (Figure 2.3b) (Izabela et al.

E protein has three domains (Domain I – III) (Yorgo et al. Some molecules interact with the protein E virus (DC-SIGN, L- SIGN, the high affinity laminin receptor, the mannose receptor, and GRP78 have been shown to be important factors that mediate attachment and entry of the virus (Murphy and Whitehead, 2011). prM/M protein The DENV prM (membrane) protein, together with E envelope protein plays important role in the formation and maturation of the dengue viral particle. Both proteins are present on the surface of immature virions.

The prM protein (18 kDa) consists of seven antiparallel β-strands stabilized by three disulfide bonds.