## Tổng quan nghiên cứu

Bệnh sốt xuất huyết Dengue là một trong những vấn đề y tế toàn cầu nghiêm trọng, đặc biệt phổ biến ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới như Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm có khoảng 50-100 triệu người nhiễm bệnh, với khoảng 25.000 ca tử vong, chủ yếu là trẻ em. Bệnh do virus Dengue (DENV) gây ra, truyền qua muỗi Aedes spp, có thể gây ra các triệu chứng từ sốt Dengue nhẹ đến sốt xuất huyết Dengue nặng và sốc Dengue. Hiện nay, việc phát triển vaccine phòng bệnh là cấp thiết nhằm kiểm soát sự lây lan của dịch bệnh.

Mục tiêu nghiên cứu là tinh sạch hạt giống virus Dengue dạng hạt giống virus-like particle (VLP) từ môi trường nuôi cấy tế bào côn trùng, nhằm phục vụ cho phát triển vaccine Dengue an toàn và hiệu quả. Nghiên cứu tập trung vào việc so sánh hiệu quả của ba phương pháp tinh sạch: sắc ký cột ái lực, lọc chéo dòng (tangential flow filtration) và hệ thống pha hai nước (ATPS). Phạm vi nghiên cứu thực hiện trên tế bào Sf9 được chuyển gen ổn định, nuôi cấy trong môi trường TNMFH bổ sung 10% huyết thanh bò bào thai (FBS) tại Đại học Nông Lâm Thái Nguyên trong giai đoạn 2012-2016.

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chất lượng và hiệu quả sản xuất vaccine Dengue, góp phần giảm thiểu tỷ lệ mắc và tử vong do bệnh sốt xuất huyết, đồng thời mở rộng ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất vaccine dưới điều kiện an toàn sinh học cao.

## Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

### Khung lý thuyết áp dụng

- **Virus Dengue và cấu trúc**: Virus Dengue là virus RNA đơn sợi thuộc họ Flaviviridae, gồm 5 kiểu huyết thanh (DENV-1 đến DENV-5). Hạt virus có đường kính khoảng 50 nm, bao gồm các protein cấu trúc như capsid (C), prM (tiền thân màng), và E (vỏ bọc), cùng các protein không cấu trúc NS1 đến NS5. Protein E đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập tế bào chủ và kích thích đáp ứng miễn dịch.

- **Virus-like particles (VLPs)**: VLP là các hạt virus giả có cấu trúc tương tự virus thật nhưng không chứa vật liệu di truyền, do đó an toàn và có khả năng kích thích miễn dịch mạnh mẽ. VLP được xem là ứng viên vaccine tiềm năng, đặc biệt trong các vaccine dưới dạng tiểu đơn vị.

- **Phương pháp tinh sạch protein**: Dựa trên các tính chất vật lý và hóa học của protein, các kỹ thuật như sắc ký ái lực, lọc chéo dòng và hệ thống pha hai nước được sử dụng để tách chiết và tinh sạch VLP khỏi các tạp chất như albumin trong môi trường nuôi cấy.

### Phương pháp nghiên cứu

- **Nguồn dữ liệu**: Mẫu nghiên cứu là dịch nuôi cấy tế bào Sf9 côn trùng được chuyển gen ổn định biểu hiện protein prM và E của virus Dengue, nuôi trong môi trường TNMFH bổ sung 10% FBS.

- **Phương pháp phân tích**: Ba kỹ thuật tinh sạch được áp dụng gồm:

  1. **Sắc ký cột ái lực HiTrap™ Blue**: Dựa trên khả năng liên kết chọn lọc của ligand Cibacron Blue F3G-A với albumin để loại bỏ tạp chất.
  
  2. **Lọc chéo dòng (ÄKTA™ flux)**: Sử dụng màng lọc có kích thước cắt 10 kDa và 50 kDa để phân tách protein dựa trên kích thước phân tử.
  
  3. **Hệ thống pha hai nước (ATPS)**: Sử dụng pha PEG và muối để tách protein dựa trên tính chất phân cực và trọng lượng phân tử.

- **Timeline nghiên cứu**: Quá trình thu thập mẫu, tinh sạch và phân tích kéo dài trong giai đoạn 2012-2016, với các bước chuẩn bị mẫu, tinh sạch, cô đặc và phân tích bằng SDS-PAGE, nhuộm Coomassie, nhuộm bạc, Western blot và Dot blot.

- **Cỡ mẫu**: Mẫu dịch nuôi cấy được thu thập từ nhiều lần nuôi cấy tế bào Sf9 ổn định, đảm bảo tính đại diện và độ tin cậy của kết quả.

## Kết quả nghiên cứu và thảo luận

### Những phát hiện chính

1. **Hiệu quả của sắc ký cột HiTrap™ Blue**: Phương pháp này có khả năng liên kết albumin trong môi trường nuôi cấy, tuy nhiên do nồng độ albumin quá cao vượt quá khả năng hấp phụ của cột, albumin vẫn còn tồn tại trong mẫu tinh sạch. Protein E (~50 kDa) và prM (~20 kDa) được phát hiện chủ yếu trong phần dòng chảy qua cột, chứng tỏ VLP không bị giữ lại. Kết quả Western blot xác nhận sự hiện diện của protein E trong dòng chảy qua.

2. **Lọc chéo dòng với màng 10 kDa và 50 kDa**: Kết quả cho thấy VLP tồn tại trong phần giữ lại và rửa màng, nhưng albumin vẫn xuất hiện trong tất cả các phần, cho thấy màng lọc có kích thước cắt chưa đủ lớn để tách biệt hoàn toàn VLP và albumin.

3. **Hệ thống pha hai nước (ATPS)**: Phương pháp này cho thấy khả năng tách biệt tốt hơn giữa VLP và albumin. VLP chủ yếu tập trung ở pha giàu PEG (pha trên), trong khi albumin tập trung ở pha trung gian và pha đáy. Dot blot và nhuộm bạc cho thấy sự hiện diện rõ ràng của protein E trong pha trên, đặc biệt ở pH 8.0, cho thấy điều kiện này tối ưu cho quá trình tinh sạch.

### Thảo luận kết quả

- Nguyên nhân chính khiến sắc ký HiTrap™ Blue không loại bỏ hoàn toàn albumin là do nồng độ albumin trong môi trường nuôi cấy quá cao, vượt quá khả năng hấp phụ của cột. Điều này làm giảm hiệu quả tinh sạch VLP.

- Lọc chéo dòng với màng 10 kDa và 50 kDa không đủ phân biệt kích thước giữa albumin và VLP, do đó cần thử nghiệm màng có kích thước cắt lớn hơn (100 kDa hoặc 500 kDa) để cải thiện hiệu quả.

- ATPS cung cấp môi trường nhẹ nhàng, nhanh chóng và hiệu quả trong việc tách VLP khỏi các tạp chất protein lớn như albumin. Việc điều chỉnh pH và nồng độ muối, PEG có thể tối ưu hóa thêm hiệu suất thu hồi VLP.

- Kết quả phù hợp với các nghiên cứu trước đây về ứng dụng ATPS trong tinh sạch protein và virus-like particles, đồng thời mở ra hướng đi mới cho sản xuất vaccine Dengue an toàn và hiệu quả.

- Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh tỷ lệ thu hồi VLP và loại bỏ albumin giữa ba phương pháp, cũng như bảng phân tích định lượng protein trong từng pha/tầng.

## Đề xuất và khuyến nghị

1. **Tối ưu hóa pH và nồng độ trong sắc ký HiTrap™ Blue**: Điều chỉnh pH của dung dịch đệm gắn và rửa để tăng khả năng liên kết albumin, đồng thời giảm nồng độ huyết thanh trong môi trường nuôi cấy để tránh quá tải cột.

2. **Sử dụng màng lọc có kích thước cắt lớn hơn trong lọc chéo dòng**: Áp dụng màng 100 kDa hoặc 500 kDa để phân tách hiệu quả hơn giữa VLP và albumin, nâng cao độ tinh khiết sản phẩm.

3. **Tối ưu hóa hệ thống pha hai nước (ATPS)**: Thay đổi trọng lượng phân tử và nồng độ PEG, muối, cũng như điều chỉnh pH để tăng tỷ lệ thu hồi VLP và loại bỏ tạp chất.

4. **Phát triển quy trình kết hợp đa bước**: Kết hợp các phương pháp tinh sạch như ATPS trước, sau đó sử dụng lọc chéo dòng hoặc sắc ký để đạt độ tinh khiết cao nhất, phù hợp cho sản xuất vaccine quy mô lớn.

5. **Thời gian thực hiện**: Các đề xuất trên nên được triển khai trong vòng 1-2 năm tiếp theo để hoàn thiện quy trình sản xuất.

6. **Chủ thể thực hiện**: Các phòng thí nghiệm nghiên cứu vaccine, các công ty công nghệ sinh học và các viện nghiên cứu y sinh.

## Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. **Nhà nghiên cứu vaccine và công nghệ sinh học**: Nghiên cứu về sản xuất và tinh sạch các hạt virus-like particles, phát triển vaccine mới.

2. **Cơ sở sản xuất vaccine**: Áp dụng quy trình tinh sạch hiệu quả để nâng cao chất lượng sản phẩm, giảm chi phí sản xuất.

3. **Sinh viên và học giả ngành công nghệ sinh học, y sinh**: Tìm hiểu về kỹ thuật tinh sạch protein và ứng dụng trong sản xuất vaccine.

4. **Cơ quan quản lý y tế và chính sách**: Đánh giá các công nghệ mới trong phòng chống dịch bệnh sốt xuất huyết, hỗ trợ quyết định đầu tư nghiên cứu và phát triển vaccine.

## Câu hỏi thường gặp

1. **Virus-like particles (VLP) là gì và tại sao chúng quan trọng trong vaccine?**  
VLP là các hạt virus giả có cấu trúc giống virus thật nhưng không chứa vật liệu di truyền, do đó an toàn và có khả năng kích thích miễn dịch mạnh mẽ. Chúng giúp tạo ra vaccine hiệu quả mà không gây bệnh.

2. **Tại sao việc tinh sạch VLP từ môi trường nuôi cấy tế bào côn trùng lại khó khăn?**  
Môi trường nuôi cấy chứa nhiều protein tạp như albumin với nồng độ cao, gây khó khăn trong việc tách biệt VLP khỏi các tạp chất này, đòi hỏi kỹ thuật tinh sạch phức tạp và hiệu quả cao.

3. **Phương pháp nào trong nghiên cứu cho hiệu quả tinh sạch VLP tốt nhất?**  
Hệ thống pha hai nước (ATPS) cho kết quả tốt nhất trong việc tách biệt VLP khỏi albumin và các tạp chất lớn, đặc biệt khi điều chỉnh pH ở mức 8.0.

4. **Lọc chéo dòng có ưu điểm gì trong tinh sạch VLP?**  
Lọc chéo dòng giúp cô đặc và loại bỏ các phân tử nhỏ hơn kích thước màng lọc, giữ lại các phân tử lớn như VLP, tuy nhiên cần lựa chọn màng có kích thước cắt phù hợp để đạt hiệu quả cao.

5. **Làm thế nào để tối ưu hóa quy trình tinh sạch VLP cho sản xuất vaccine?**  
Cần kết hợp các phương pháp tinh sạch, điều chỉnh các thông số kỹ thuật như pH, nồng độ muối, trọng lượng phân tử của polymer, và lựa chọn màng lọc phù hợp để tăng hiệu quả thu hồi và độ tinh khiết của VLP.

## Kết luận

- Đã sản xuất thành công hạt virus-like particle Dengue từ tế bào côn trùng Sf9 ổn định trong môi trường TNMFH bổ sung 10% FBS.  
- Ba phương pháp tinh sạch được đánh giá gồm sắc ký cột HiTrap™ Blue, lọc chéo dòng ÄKTA™ flux và hệ thống pha hai nước (ATPS).  
- ATPS cho hiệu quả tinh sạch tốt nhất, tách biệt rõ ràng VLP khỏi albumin và tạp chất, đặc biệt ở pH 8.0.  
- Cần tối ưu hóa các thông số kỹ thuật và kết hợp các phương pháp để nâng cao hiệu quả tinh sạch trong sản xuất vaccine.  
- Đề xuất triển khai nghiên cứu tiếp theo trong 1-2 năm tới nhằm hoàn thiện quy trình sản xuất vaccine Dengue an toàn và hiệu quả.

**Hành động tiếp theo**: Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học áp dụng và phát triển quy trình tinh sạch VLP dựa trên kết quả nghiên cứu này để thúc đẩy sản xuất vaccine Dengue quy mô công nghiệp.