PHÂN TÍCH VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC CỦA MELANIN

Luận án tiến sĩ về phân tích vật lý và hóa học melanin. Nghiên cứu cấu trúc, tính chất, khả năng liên kết kim loại và phản ứng quang học của melanin từ các nguồn khác nhau.

• Tác giả: Lian Hong
• Người hướng dẫn: Simon, Supervisor
• Trường học: Duke University
• Chuyên ngành: Chemistry
• Đề tài: Physical And Chemical Analyses Of Melanins
• Loại tài liệu: Dissertation
• Năm xuất bản: 2006
• Địa điểm: Ann Arbor

Tóm tắt

I. Melanin Tổng Quan Nghiên Cứu Cấu Trúc Ứng Dụng Thực Tế

Melanin là một thuật ngữ chung mô tả một loạt các sắc tố phenolic-quinonoid tự nhiên và tổng hợp. Nghiên cứu này tập trung vào việc mô tả các loại melanin tự nhiên. Các melanin tự nhiên được phân loại thành hai nhóm chính dựa trên cấu trúc hóa học và tiền chất phân tử: eumelanin không hòa tan màu đen hoặc nâu có nguồn gốc từ dihydroxyphenylalanine (DOPA) và pheomelanin hòa tan trong kiềm màu vàng có nguồn gốc từ DOPA và cysteine. Eumelanin phổ biến trong thế giới sinh học, được tìm thấy trong não, da và lông của động vật có vú, lông của chim và da của một số loài lưỡng cư. Ngược lại, pheomelanin chủ yếu được tìm thấy trong lông của chim và lông/tóc của động vật có vú. Melanin đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi tác hại của tia UV, cũng như đóng vai trò là kho chứa kim loại. Các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc, tính chất và tương tác của melanin có thể mở ra những ứng dụng mới trong y học và công nghệ vật liệu.

1.1. Melanogenesis Quá trình hình thành sắc tố Melanin

Sự hình thành sắc tố melanin xảy ra trong một bào quan chuyên biệt, melanosome. Ngoài hàm lượng melanin, melanosome còn chứa protein cấu trúc, enzyme và kim loại. Eumelanosome, với eumelanin là sắc tố chính, thường là các hạt tích hợp, đồng nhất và đặc sít với sắc tố. Pheomelanosome, tuy nhiên, với pheomelanin là sắc tố chính, không được đóng gói đồng đều với sắc tố và các hạt nhỏ được tập hợp lỏng lẻo. Sự hình thành eumelanin và pheomelanin phụ thuộc chủ yếu vào khả năng tiếp cận cysteine của tế bào hắc tố.

1.2. Cấu trúc hóa học cơ bản của Eumelanin và Pheomelanin

Melanin không hòa tan, mờ đục và vô định hình. Do đó, việc phân tích melanin bằng các phương pháp phân tích thông thường gặp nhiều khó khăn. Để nghiên cứu thành phần hóa học của sắc tố, các phương pháp thoái hóa nhóm đã được phát triển để phân tích các mảnh có trọng lượng phân tử thấp. Một lượng đáng kể các đơn vị pyrrole được thay thế carboxyl (2,3,5-pyrroletricarboxylic (PTCA)) và thiazole-4,5-dicarboxyl (TDCA) với số lượng thiazoles khác đã được xác định từ các sản phẩm oxy hóa permanganat của eumelanin và pheomelanin.

II. Phân Tích Vật Lý Melanin Spectroscopy Microscopy Cách Tiếp Cận

Melanin sở hữu một loạt các tính chất lý hóa hấp dẫn: hấp thụ dải rộng, trao đổi ion, quang hoạt, oxy hóa khử và khả năng loại bỏ gốc tự do. Các chức năng sinh học của melanin phụ thuộc rất nhiều vào các tính chất lý hóa này. Phân tích vật lý giúp xác định các tính chất như hấp thụ ánh sáng, cấu trúc hạt và tương tác điện từ của melanin. Các kỹ thuật như spectroscopy (UV-Vis, IR, Raman), nhiễu xạ tia X, kính hiển vi (SEM, TEM, AFM) và Electron paramagnetic resonance (EPR) cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc và chức năng của melanin.

2.1. Spectroscopy Melanin Hấp thụ và Phát xạ ánh sáng

Melanin hấp thụ trên một dải quang phổ rộng. Sự hấp thụ melanin không đặc trưng, tăng đơn điệu khi giảm bước sóng trong phạm vi UV-Vis. Do bản chất dạng hạt của melanin, quang phổ hấp thụ là sự kết hợp của sự hấp thụ, phản xạ và tán xạ. Sự hấp thụ phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tập của melanin trong dung dịch. Dải hấp thụ rộng và mạnh trong vùng UV giúp melanin có khả năng bảo vệ da khỏi tác hại của tia UV.

2.2. Microscopy Melanin Quan sát cấu trúc nano

Kính hiển vi cho phép quan sát cấu trúc và hình thái của melanin ở cấp độ nano. Các kỹ thuật như kính hiển vi lực nguyên tử (AFM) cung cấp hình ảnh độ phân giải cao về bề mặt melanin, cho phép nghiên cứu sự phân bố và kích thước của các hạt melanin. Kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cung cấp thông tin về cấu trúc bên trong của melanin và sự sắp xếp của các phân tử melanin.

2.3. Electron paramagnetic resonance EPR Melanin Nghiên cứu gốc tự do

EPR (hay còn gọi là Electron Spin Resonance (ESR)) là một kỹ thuật nhạy cảm với các chất chứa electron không ghép cặp, chẳng hạn như các gốc tự do. Vì melanin có đặc tính bán dẫn và chứa các gốc tự do, EPR là một công cụ mạnh mẽ để nghiên cứu các đặc tính điện tử và gốc tự do của nó. Các tín hiệu EPR có thể cung cấp thông tin về nồng độ gốc tự do, môi trường xung quanh chúng và động lực học của các gốc tự do trong melanin.

III. Phân Tích Hóa Học Melanin Degradation Liên Kết Kim Loại Chi Tiết

Do tính không hòa tan và phức tạp của melanin, phân tích hóa học thường dựa vào các phương pháp thoái hóa để xác định thành phần và cấu trúc của nó. Phân tích hóa học cũng tập trung vào khả năng liên kết kim loại của melanin, điều này ảnh hưởng đến chức năng sinh học của nó. Các kỹ thuật như sắc ký, phân tích nguyên tố và các phương pháp xác định nhóm chức cung cấp thông tin chi tiết về thành phần hóa học của melanin.

3.1. Phân tích Degradation Melanin Xác định thành phần hóa học

Các phương pháp thoái hóa hóa học như oxy hóa permanganat hoặc thủy phân acid được sử dụng để phân hủy melanin thành các mảnh nhỏ hơn, có thể được phân tích bằng sắc ký (ví dụ: HPLC, GC-MS). Các sản phẩm thoái hóa cung cấp thông tin về các đơn vị cấu trúc cơ bản của melanin, chẳng hạn như DHI, DHICA và các dẫn xuất cysteine-DOPA.

3.2. Liên Kết Kim Loại Melanin Vai trò và cơ chế

Melanin, đặc biệt là eumelanin, có khả năng liên kết với nhiều kim loại như Na(I), Mg(II), Ca(II), Zn(II) và Cu(II). Việc liên kết kim loại liên quan đến sự phối hợp với các nhóm carboxyl, hydroxyl phenolic và amine trong melanin. Khả năng liên kết kim loại phụ thuộc vào các điều kiện phản ứng khác nhau, chẳng hạn như nồng độ kim loại và melanin, pH, cường độ của dung dịch phản ứng, thời gian phản ứng và nhiệt độ.

3.3. Ảnh hưởng của kim loại chuyển tiếp đến tính chất melanin

Sự liên kết của các ion kim loại chuyển tiếp như đồng (Cu) và sắt (Fe) với melanin có thể ảnh hưởng đến các tính chất hóa học và vật lý của sắc tố. Ví dụ, sự liên kết với Cu(II) có thể làm tăng khả năng tạo ra các gốc tự do, trong khi sự liên kết với Fe(III) có thể ảnh hưởng đến quang hoạt của melanin.

IV. Phản Ứng Quang Học Melanin Photodegradation và Photoprotection

Melanin có thể hấp thụ ánh sáng và chuyển đổi năng lượng, nhưng cũng có thể bị photodegradation (phân hủy do ánh sáng) và tạo ra các gốc tự do. Khả năng photoprotection của melanin bảo vệ da khỏi tác hại của tia UV, nhưng quá trình quang hóa cũng có thể gây ra các phản ứng có hại. Nghiên cứu về phản ứng quang học của melanin là rất quan trọng để hiểu đầy đủ vai trò của nó trong bảo vệ và gây hại cho tế bào.

4.1. Photodegradation Melanin Cơ chế và yếu tố ảnh hưởng

Khi melanin tiếp xúc với ánh sáng, đặc biệt là tia UV, nó có thể trải qua quá trình photodegradation, dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc và sự hình thành các sản phẩm phân hủy. Các yếu tố ảnh hưởng đến photodegradation bao gồm cường độ ánh sáng, bước sóng, thành phần của melanin (tỷ lệ eumelanin và pheomelanin) và sự hiện diện của các chất nhạy cảm quang khác.

4.2. Photoprotection Melanin Bảo vệ da khỏi tia UV

Một trong những chức năng sinh học quan trọng nhất của melanin là photoprotection, bảo vệ da khỏi tác hại của tia UV. Melanin hấp thụ tia UV và chuyển đổi năng lượng thành nhiệt, giảm thiểu tổn thương DNA và các phân tử sinh học khác. Khả năng photoprotection của melanin phụ thuộc vào nồng độ và sự phân bố của nó trong da.

4.3. Vai trò của Melanin trong tạo và loại bỏ gốc tự do

Melanin có thể vừa tạo ra vừa loại bỏ các gốc tự do khi tiếp xúc với ánh sáng. Eumelanin thường được coi là có khả năng loại bỏ gốc tự do tốt hơn, trong khi pheomelanin có thể tạo ra nhiều gốc tự do hơn. Sự cân bằng giữa việc tạo và loại bỏ gốc tự do quyết định vai trò tổng thể của melanin trong việc bảo vệ hoặc gây hại cho tế bào.

V. Ứng Dụng Melanin Từ Y Học Đến Công Nghệ Vật Liệu Tiềm Năng

Các tính chất độc đáo của melanin đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học và kỹ sư trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Ứng dụng của melanin bao gồm mỹ phẩm, dược phẩm, vật liệu sinh học, cảm biến và điện tử. Nghiên cứu sâu hơn về melanin có thể mở ra những ứng dụng mới và thú vị hơn nữa.

5.1. Melanin trong mỹ phẩm Chống nắng và làm đẹp da

Melanin được sử dụng trong các sản phẩm chống nắng để bảo vệ da khỏi tác hại của tia UV. Các sản phẩm mỹ phẩm khác có thể chứa melanin để cải thiện tông màu da, giảm các đốm đồi mồi và bảo vệ da khỏi các tác nhân gây hại từ môi trường.

5.2. Melanin trong y học Điều trị các bệnh về da và thần kinh

Các nghiên cứu đang khám phá tiềm năng của melanin trong điều trị các bệnh về da, chẳng hạn như bạch biến và ung thư da. Melanin cũng có thể có ứng dụng trong điều trị các bệnh thần kinh, chẳng hạn như bệnh Parkinson, do khả năng liên kết với kim loại và loại bỏ gốc tự do.

5.3. Melanin trong công nghệ vật liệu Cảm biến và điện tử sinh học

Melanin đang được nghiên cứu như một vật liệu tiềm năng cho các cảm biến sinh học, thiết bị lưu trữ năng lượng và các thiết bị điện tử sinh học. Tính dẫn điện và khả năng liên kết với các phân tử sinh học khác làm cho melanin trở thành một vật liệu hấp dẫn cho các ứng dụng này.

VI. Nghiên Cứu Tương Lai về Melanin Hướng đi và thách thức

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong việc nghiên cứu melanin, vẫn còn nhiều câu hỏi chưa được trả lời và nhiều thách thức cần vượt qua. Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc hiểu rõ hơn về cấu trúc, chức năng và tương tác của melanin trong các hệ thống sinh học khác nhau. Các phương pháp phân tích tiên tiến và các mô hình tính toán có thể giúp giải quyết những thách thức này và mở ra những ứng dụng mới của melanin.

6.1. Phát triển các phương pháp phân tích melanin tiên tiến hơn

Cần phát triển các phương pháp phân tích melanin tiên tiến hơn để cung cấp thông tin chi tiết hơn về cấu trúc, thành phần và tính chất của nó. Các kỹ thuật như phổ khối lượng phân giải cao, cộng hưởng từ hạt nhân trong trạng thái rắn và kính hiển vi điện tử cryo có thể giúp giải quyết những thách thức này.

6.2. Nghiên cứu về sự tương tác giữa Melanin và các phân tử sinh học khác

Cần nghiên cứu sâu hơn về sự tương tác giữa melanin và các phân tử sinh học khác, chẳng hạn như protein, lipid và DNA. Hiểu rõ hơn về các tương tác này có thể giúp hiểu rõ hơn về vai trò của melanin trong các quá trình sinh học và bệnh lý.

6.3. Phát triển các ứng dụng Melanin mới và sáng tạo

Cần tiếp tục khám phá các ứng dụng mới và sáng tạo của melanin trong các lĩnh vực khác nhau, chẳng hạn như y học, công nghệ vật liệu và năng lượng. Các nghiên cứu về melanin tổng hợp và các vật liệu dựa trên melanin có thể mở ra những cơ hội mới cho các ứng dụng này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

PHYSICAL AND CHEMICAL ANALYSES OF MELANINS By Lian Hong Department of Chemistry Duke University Date:_ April 24 2006 Approved: l£-=. Simon, Supervisor ⁄2 322 Dissertation submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in the Department of Chemistry in the Graduate School of Duke University 2006 UMI Number: 3244835 INFORMATION TO USERS The quality of this reproduction is dependent upon the quality of the copy submitted. Broken or indistinct print, colored or poor quality illustrations and photographs, print bleed-through, substandard margins, and improper alignment can adversely affect reproduction. In the unlikely event that the author did not send a complete manuscript and there are missing pages, these will be noted.

Also, if unauthorized copyright material had to be removed, a note will indicate the deletion. ® UMI UMI Microform 3244835 Copyright 2007 by ProQuest Information and Learning Company. All rights reserved. This microform edition is protected against unauthorized copying under Title 17, United States Code.

ProQuest Information and Learning Company 300 North Zeeb Road P. Box 1346 Ann Arbor, MI 48106-1346 ABSTRACT PHYSICAL AND CHEMICAL ANALYSES OF MELANINS By Lian Hong Department of Chemistry Duke University Date:__ April 24 2006 Approved: An abstract of a dissertation submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in the Department of Chemistry in the Graduate School of Duke University 2006 Abstract Melanin is a pigment that is ubiquitous in the biological world. In addition to its obvious function of adornment, melanin is believed to serve as a metal reservoir and sunscreen. This work examined the metal binding behavior, the chemical structures and the interaction with light of natural melanins isolated from several different sources.

Sepia eumelanin was used as a model to study the metal binding behavior of eumelanins. Infrared spectroscopic analysis suggests that Mg(II), Ca(II) and Zn(II) are mainly bound to carboxyl groups and Cu(II) binds to hydroxyl groups at pH ~4. The effect of metal content on the aerobic reactivity was examined by analyzing the ability of melanin to nick DNA. Of the metals studied, Cu(II)- and Fe(III)-loaded melanin showed the most damaging effects to DNA.

The photoreactivity of melanin is most important in two parts of the body: the skin and the eye. We first studied melanosomes from hair, which correlate well with the pigment in the skin. Chemical analysis showed that eumelanin was the major pigment in the melanosomes in black hair, while the melanosomes from red hair contained both pheomelanin and eumelanin. Photoelectron emission microscopic (PEEM) analyses on the two melanosomes revealed that the photoionization threshold of eumelanin was 4.4 eV and that pheomelanin was 3.

The low threshold of pheomelanin may contribute to the high incidence of skin cancer in redheads. 11 We then examined the physical and chemical properties of bovine ocular melanosomes. The collective data showed that iris melanosomes had a higher degree of crosslinking and conjugation than choroid and RPE melanosomes of the same age group. The content of carboxyl groups and the degree of conjugation in melanosomes were smaller in older samples.

These tissue and age-related differences are likely to result in variation of efficiency in melanin functions such as metal binding and light absorption. Finally, we examined the photoionization properties of human RPE melanosomes and lipofuscin, another important pigment in the RPE. RPE melanosomes became more pro-oxidant with aging and lipofuscins were more pro- oxidant than melanosomes. iv Contents Page Abstract ili List of Tables vi List of Figures Vii Abbreviations 1X Acknowledgements xii Chapter One: Background Chapter Two: Insights to the Metal Binding to Melanin and its Effects on the 11 Aerobic Reactivity of Melanin Chapter Three: Physiochemical Analysis of Melanosomes Extracted from 35 Human Black and Red Hair Chapter Four: Physiochemical Analysis of Melanosomes Extracted from 57 Bovine Choroid, Iris and Retinal Pigment Epithelium Chapter Five: Age-Dependent Ionization Potentials of Melanosomes and 99 Lipofuscin Isolated from Human Retinal Pigment Epithelium Cells References 121 Biography 132 List of Tables Table Description Page The pH values of salt solutions after suspension of EDTA-washed 19 melanin.

2-2 Summary of the changes in the IR spectra of melanin upon loading of 22 different metals. 3-1 Chemical degradation analyses of human hair melanosomes. 47 3-2 Metal ion contents of human hair melanosomes. 49 Summary of the size analysis of the melanosomes isolated from 68 mature bovine eyes.

Summary of the size analysis of the melanosomes isolated from 69 newborn bovine eyes. 4-3 The contents of Na(I), Mg(II), K(I), Ca(ID and Zn(II) in bovine ocular 72 melanosomes determined by ICP-MS. 4-4 Summary of amino acid analyses for bovine ocular melanosomes. 74 4-5 Summary of chemical degradation analyses of bovine ocular 76 melanosomes.

4-6 C, N and H mass percentages in melanosomes obtained by elemental 78 analysis are corrected according to their amino acid and metal contents. 4-7 C/N and O/N molar ratios on the surface of bovine ocular 82 melanosomes determined by XPS. 4-8 Composition of carbon functional groups. 85 Composition of oxygen functional groups.

86 4-10 Composition of nitrogen functional groups. 87 4-11 The peak positions of the aromatic rings and carbonyls in the IR 91 spectra of bovine ocular melanosomes. Summary of the size analysis of human RPE melanosomes from three 107 vi different patients. List of Figures Description Page An abbreviated illustration of biogenesis of eumelanin and pheomelanin.

1-2 Proposed typical structures of eumelanin and pheomelanin based on biosynthetic pathway and chemical degradation analysis of melanin. IR spectrum of Ca(II)-enriched melanin as a function of the solution 23 concentration of Ca(ID). IR spectrum of Zn(I])-enriched melanin as a function of the solution 25 concentration of Zn(II) in the spectral region of a) 900-1900 cm” and b) 2000-4000 cm”. 2-3 IR spectrum of Cu(II)-enriched melanin as a function of the solution 26 concentration of Cu(II) in the spectral region of a) 900-1900 cm” and b) 2000-4000 cm”.

2-4 Image of a typical gel of pUC18 DNA with bands of two forms. 30 Aerobic reactivity of melanins loaded with different metal ions in a) 31 dark and b) light reactions. 2-6 The effects of [Fe(III] on the ability of melanin to break supercoiled 33 DNA in a dark reaction. 3-1 AFM images of melanosomes isolated from a) black hair and b) red 44 hair.

3-2 High magnification AFM images of black-hair melanosomes (a, b) 45 and red-hair melanosomes (c, d). 3-3 Integrated wavelength-dependent FEL-PEEM data for a) human black 51 hair and b) human red hair melanosomes. 3-4 Time-dependent absorption of Fe(II)-Cyt ¢ following the mixing of 33 Fe(II)-Cyt c with equal masses of eumelanosomes and pheomelanosomes. vii SEM images of melanosomes isolated from a) mature bovine RPE, b) newborn bovine RPE, c) mature bovine choroid, d) newborn bovine choroid, e) mature bovine iris and f) newborn bovine iris.

The distributions of the lengths of the long axis of a) newborn bovine 66 RPE melanosomes and b) mature bovine RPE melanosomes. The high-resolution X-ray photoelectron spectra of Cls in (a) 83 newborn choroid and (b) mature choroid melanosomes. 4-4 The high-resolution X-ray photoelectron spectra of Ols in (a) 84 newborn choroid and (b) mature choroid melanosomes. 4-5 IR spectra of a) newborn bovine choroid, iris and RPE melanosomes 90 b) mature bovine choroid, iris and RPE melanosomes in the range of 800-2000 cm `.

4-6 The !C CP/MAS solid-state NMR spectra of a) mature choroid 95 melanosomes, b) EDTA-washed mature iris melanosomes, c) EDTA- washed mature choroid melanosomes, d) EDTA-washed newborn iris melanosomes and e) EDTA-washed newborn choroid melanosomes. 5-1 SEM images of RPE melanosomes from patients a) 14, b) 59, and c) 105 76, years old, respectively. AFM micrographs of RPE melanosomes: a, b) a smooth granule and 109 c, d) a granule with a rough surface and e, f) a “transient” granule. 5-3 SEM images of lipofuscin granules from donors a) 14, b) 59, and c) 110 76 years old.

5-4 The emission spectra of RPE lipofuscin granules from donors a) 14, b) 112 59, and c) 76 years old. 5-5 Integrated wavelength-dependent FEL-PEEM data for bovine ovoid 115 and rod-shaped melanosomes. 5-6 Integrated wavelength-dependent FEL-PEEM data for melanosomes 116 isolated from human RPE cells from a) 14- and b) 76-year-old specimens. 5-7 Integrated wavelength-dependent FEL-PEEM data for lipofuscin 117 isolated from human RPE cells from a) 14- and b) 76-year-old specimens.

Vili Abbreviations AEM atomic force microscopy aminohydroxyphenylalanine age-related macular degeneration ChNS chloroform-insoluble ChS chloroform-soluble COOH carboxyl CP/MAS cross-polarization magic angle spinning CV coefficient of variation Cyt Cytochrome DHI 5,6-dihydroxylindole DHICA 5,6-dihydroxylindole-2-carboxylic acid DOPA dihydroxylphenylalanine DTT dithiothreitol EB ethidium bromide EDTA ethylenediaminetetraacetic acid FEL free electron laser HI hydriodic acid HPLC high performance liquid chromatography ICP-MS inductively coupled plasma mass spectrometry IPE iris pigment epithelium infrared 1X the length of the long axis minimal erythemal dose amine normal hydrogen electrode national institute of standards and technology nuclear magnetic resonance neuromelanin OH hydroxyl PBS phosphate buffered saline PBSA Dulbecco’s phosphate buffered saline without calcium and magnesium PD Parkinson’s disease PEEM photoelectron emission microscopy PTCA 2,3,5-pyrroletricarboxylic acid ROS reactive oxygen specie RPE retinal pigment epithelium RSF relative sensitivity factor the length of the short axis SEM scanning electron microscopy SN substantia nigra TEM transmission electron microscopy TDCA thiazole-4,5-dicarboxyl acid ™ total melanin X TMS tetramethylsilane XPS X-ray photoelectron spectroscopy xi Acknowledgements First I would like to thank my thesis advisor Dr. Simon for his guidance, support, encouragement and training throughout these past years. His broad connections with research groups and scientists outside Duke are essential for the completion of my dissertation. I gratefully acknowledge our collaborators: Prof.

Kazumasa Wakamatsu, and Shosuke Ito for carrying out chemical degradation analysis; Bhavin B. Adhyaru, Chi- Yuan Cheng and Prof. Bowers for collecting '3C solid state NMR spectra; and Jacob Garguilo, Robert J. Nemanich and Glenn S.

Edwards for performing photoelectron emission microscopic analyses. I also appreciate the past and current members of the Simon Lab. In particular, I would like to thank Dr. Yan liu for stimulating discussions, help of experiments and sharing of her experience and knowledge with me.

I acknowledge her invaluable help and her important inputs in chapter 2 and chapter 3 of this thesis. Alexander Samokhvalov for employing PEEM and analyzing black/red hair melanosomes and Laura Anzaldi for help on the size analysis of human RPE melanosomes. I also thank Jenny Perry, Laura Lamb, Valerie Kempf, William Derek Bush, Weslyn Ward and Jean Hatcher for various help. I owe special thanks to my husband Xiangqian for his patience, love, and encouragement during these years of my studies.

Finally, I would like to thank my family and friends for their support. xii Chapter One. Background Occurrence of Melanin and Melanogenesis Melanin is an omnibus term describing a large range of natural and synthetic phenolic-quinonoid pigments. Since this current work is focusing on the characterization of natural melanins, only the properties of natural melanins will be discussed in this section.

Natural melanins are classified into two groups according to their chemical structures and molecular precursors: the insoluble black to brown eumelanin derived from dihydroxyphenylalanine (DOPA), and the alkaline-soluble yellow to red pheomelanin derived from DOPA and cysteine (Crippa 1989; Ito 1993; Riley 1997; Ito 1998). Eumelanin is widespread in the biological world. It occurs in the skin, hair, eye, brain and inner ear of mammals, the feathers of birds, the ink sac of cuttlefish, and in some reptiles, amphibians and fungi. Pheomelanin, on the other hand, is mainly found in the feathers of birds and the hair and skin of mammals.

Melanin pigmentation occurs in a specialized organelle, the melanosome, in most pigment generating cells (Prota 1992). In addition to the melanin content, melanosomes contain structural proteins, enzymes, lipids, and metals (Prota 1992). Eumelanosomes, with eumelanin as the major pigment, are mostly integrated granules, uniformly and densely packed with pigments (Parakkal 1967). Pheomelanosomes, however, with pheomelanin as the major pigment, are unevenly packed with pigments and are loosely aggregated small granules (Parakkal 1967).