Khóa luận: Xây dựng phương pháp phân tích Corticoid trong TPBVSK bằng LC-HRMS

Khóa luận Dược sĩ trình bày phương pháp LC-HRMS giúp phân tích và phát hiện corticoid bị trộn trái phép trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

• Tác giả: Nguyễn Tiến Dũng
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Thị Thanh Hà
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Xây dựng phương pháp phân tích corticoid trộn trái phép trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phân Tích Corticoid Trái Phép Trong TPBVSK

Phân tích Corticoid trái phép trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) là một vấn đề cấp bách trong lĩnh vực kiểm nghiệm và an toàn vệ sinh thực phẩm. Corticoid là nhóm chất glucocorticoid được sử dụng rộng rãi trong điều trị viêm, dị ứng và các bệnh tự miễn, nhưng việc trộn trái phép vào TPBVSK gây ra những nguy hiểm nghiêm trọng cho sức khỏe người tiêu dùng. Phương pháp LC-HRMS (Sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao) đã trở thành công cụ hiệu quả để phát hiện và định lượng các chất corticoid với độ nhạy và đặc hiệu cao. Công nghệ này cho phép các nhà khoa học xác định chính xác cấu trúc phân tử và nồng độ của các chất này trong các mẫu phức tạp. Việc xây dựng phương pháp phân tích tiêu chuẩn không chỉ giúp bảo vệ người tiêu dùng mà còn đóng góp quan trọng vào công tác giám sát chất lượng sản phẩm trên thị trường.

1.1. Đặc Điểm Của Corticoid Và Tác Động Sức Khỏe

Corticoid là hormone steroid tổng hợp có tác dụng kháng viêm mạnh, nhưng sử dụng lâu dài gây ra nhiều tác dụng phụ như loãng xương, suy giảm miễn dịch, tăng huyết áp. Việc trộn trái phép vào TPBVSK để tăng hiệu quả làm cho người dùng tiếp xúc với liều lượng không kiểm soát, gây hại sức khỏe. Thực trạng này đòi hỏi các phương pháp phân tích nhanh, chính xác để phát hiện và ngăn chặn.

1.2. Nhu Cầu Phát Triển Phương Pháp Phân Tích Hiệu Quả

Tại Việt Nam, tỷ lệ TPBVSK chứa corticoid trái phép vẫn ở mức đáng lo ngại. Các phương pháp phân tích truyền thống như HPLC tỏ ra hạn chế về độ đặc hiệu khi đối mặt với ma trận phức tạp của TPBVSK. Phương pháp LC-HRMS vượt trội nhờ khả năng phân giải cao, cho phép xác định đồng thời nhiều corticoid trong một mẫu với độ tin cậy cao.

II. Nguyên Lý Kỹ Thuật LC HRMS Trong Phân Tích Corticoid

LC-HRMS là sự kết hợp giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao (LC) và khối phổ phân giải cao (HRMS), tạo nên một công cụ mạnh mẽ cho phân tích hợp chất hữu cơ phức tạp. Hệ thống này sử dụng ion hóa điện tử (ESI) để chuyển đổi các phân tử corticoid thành các ion được phát hiện. Với khả năng phân giải khối lượng lên đến 100,000, LC-HRMS cho phép xác định công thức phân tử chính xác và cấu trúc của các chất phân tích. Quá trình sàng lọc (screening) được thực hiện dựa trên mảnh phổ đặc trưng của từng corticoid, cho phép phát hiện nhanh chóng ngay cả khi nồng độ rất thấp. Kỹ thuật này cũng hỗ trợ định lượng chính xác thông qua so sánh với tiêu chuẩn tham chiếu, đảm bảo kết quả độc lập với ảnh hưởng của nền mẫu.

2.1. Cấu Tạo Và Hoạt Động Của Hệ Thống LC HRMS

Hệ thống LC-HRMS Dionex Ultimate UHPLC + Q-Exactive Orbitrap MS gồm ba phần chính: cột phân tách, nguồn ion hóa (HESI) và bộ phân tích khối lượng Orbitrap. Sắc ký lỏng tách các thành phần TPBVSK trước khi chúng vào nguồn ionization. Khối phổ Orbitrap sử dụng trường từ từ tĩnh để quỹ đạo ion ổn định, cho phép đo đạc khối lượng chính xác đến độ phân giải cao.

2.2. Ưu Điểm Của Phương Pháp Sàng Lọc LC HRMS

Phương pháp sàng lọc bằng LC-HRMS vượt trội so với các kỹ thuật truyền thống bởi: (1) phát hiện đồng thời nhiều corticoid trong một lần chạy; (2) khả năng phát hiện độc lập với nền mẫu nhờ high resolution; (3) xác minh cấu trúc phân tử qua phân tích mảnh phổ; (4) giới hạn phát hiện (LOD) cực thấp, thường từ 1-10 ng/mL.

III. Quy Trình Xử Lý Mẫu Và Tối Ưu Hóa Phương Pháp

Xử lý mẫu TPBVSK là bước quan trọng quyết định chất lượng kết quả phân tích. Phương pháp chiết pha rắn phân tán (d-SPE) được ứng dụng để loại bỏ các chất cản trở trong ma trận mẫu, từ đó tăng tính đặc hiệu của phương pháp LC-HRMS. Quá trình tối ưu hóa liên quan đến lựa chọn dung môi chiết, các chất hấp phụ như carbon hoạt hóa (C18), PSA (Primary Secondary Amine) và Florisil, cùng với bột làm sạch phù hợp. Lựa chọn dung môi như methanol hoặc acetonitrile ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết corticoid. Việc loại bỏ mỡ bằng các chất hấp phụ không chỉ làm sạch mẫu mà còn giảm ảnh hưởng nền (matrix effect) trong quá trình ion hóa MS. Kết quả khảo sát cho thấy hiệu suất hồi phục (recovery) đạt 80-110% cho các corticoid chính như betamethasone và prednisolon.

3.1. Kỹ Thuật Chiết Pha Rắn Phân Tán d SPE

d-SPE là phương pháp chiết nhanh, hiệu quả sử dụng tấm hấp phụ để loại bỏ chất can xen từ TPBVSK. Mẫu được hoà tan trong dung môi rồi thêm vào hỗn hợp hấp phụ (C18, PSA, carbon hoạt hóa), ly tâm để tách phần dung dịch sạch. Phương pháp này tiết kiệm thời gian (15-20 phút) so với chiết truyền thống (2-4 giờ), đồng thời hiệu suất cao và chi phí thấp.

3.2. Điều Chỉnh Điều Kiện Phân Tích Sàng Lọc

Điều kiện sàng lọc LC sử dụng cột C18 với gradient hình nón từ nước-acetonitrile, cho phép phân tách các đồng phân corticoid có thời gian lưu khác nhau. Điều kiện MS được tối ưu bằng cách đo đạc khối lượng chính xác của ion phân tử (M+H) và các ion mảnh đặc trưng, xây dựng danh sách chất phân tích cho sàng lọc nhanh và chính xác.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Và Thẩm Định Phương Pháp

Thẩm định phương pháp là bước bắt buộc để đảm bảo tính chính xác, độ lặp lại và tính khả dụng của phương pháp LC-HRMS trước khi áp dụng vào kiểm nghiệm thực tế. Các tiêu chí thẩm định bao gồm: độ chính xác (accuracy), độ lặp lại (precision), giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), tuyến tính (linearity) và ổn định mẫu. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đạt hiệu suất hồi phục 85-110% cho các corticoid chính, RSD (độ lệch chuẩn tương đối) dưới 15%, LOD từ 1-5 ng/mL. Phân析 mẫu TPBVSK từ thị trường cho thấy 16-22% mẫu chứa corticoid trái phép, chủ yếu là betamethasone, prednisolon, dexamethasone với nồng độ vượt quá tiêu chuẩn cho phép. Kết quả này xác nhận giá trị thực tiễn của phương pháp LC-HRMS trong kiểm soát chất lượng TPBVSK.

4.1. Các Tiêu Chí Thẩm Định Phương Pháp Phân Tích

Thẩm định phương pháp tuân theo hướng dẫn AOAC với 6 tiêu chí chính: (1) Độ chính xác - mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 50%, 100%, 150%; (2) Độ lặp lại - chạy 5 lần mẫu cùng nồng độ; (3) Tuyến tính - kiểm tra từ 1-500 ng/mL; (4) LOD/LOQ - xác định tín hiệu gấp 3-10 lần nền; (5) Độ bền mẫu - kiểm tra tại nhiệt độ phòng, 4°C.

4.2. Kết Quả Phân Tích Mẫu Thực Và Ý Nghĩa Y Tế

Phân tích 150 mẫu TPBVSK từ thị trường Hà Nội cho thấy 33 mẫu dương tính với corticoid, bao gồm betamethasone (12 mẫu), prednisolon (14 mẫu), dexamethasone (7 mẫu), nồng độ từ 0.5-50 µg/mL. Phát hiện này cảnh báo nguy hiểm sức khỏe công cộng, đòi hỏi cường化 giám sát, xử phạt và hướng dẫn người tiêu dùng về rủi ro sử dụng TPBVSK chứa corticoid trái phép.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1. Dược động học, dược lực học Corticoid Corticoid là một nhóm hormon steroid được sản xuất tự nhiên bởi tuyến vỏ thượng thận, với cortisol là đại diện chính. Các corticoid tổng hợp, như prednisolon, dexamethason, và betamethason, thường được sử dụng trong y học vì tác dụng chống viêm, ức chế miễn dịch, và điều hòa chuyển hóa của chúng [5] Corticoid tác động lên cơ thể bằng cách gắn vào các thụ thể corticoid trong tế bào.

Khi liên kết với thụ thể, phức hợp này di chuyển vào nhân tế bào, nơi nó ảnh hưởng đến biểu hiện của một số gene, từ đó điều hòa quá trình viêm, điều chỉnh đáp ứng miễn dịch, và ảnh hưởng đến chuyển hóa đường, lipid, và protein [6] Corticoid có đặc tính hấp thu tốt qua đường tiêu hóa với sinh khả dụng cao, thường đạt từ 60% đến 100% sau khi uống, tùy thuộc vào loại thuốc cụ thể. Sau khi hấp thu, corticoid phân bố rộng rãi trong các mô, chủ yếu thông qua gắn kết với protein huyết tương, bao gồm transcortin và albumin. Transcortin có ái lực cao nhưng khả năng gắn kết thấp, trong khi albumin có ái lực thấp hơn nhưng dung lượng gắn kết lớn hơn. Khi transcortin bị bão hòa, tỷ lệ thuốc tự do trong huyết tương tăng, góp phần vào tác dụng dược lý cũng như độc tính của thuốc.

Về chuyển hóa, corticoid trải qua hai giai đoạn chính tại gan: bước đầu oxy hóa hoặc khử, tiếp theo là liên hợp (chủ yếu glucuronid hóa và sulfat hóa), tạo thành các chất chuyển hóa tan trong nước, dễ dàng đào thải qua thận [7]. Thực trạng sử dụng Corticoid tại Việt Nam và thế giới Tại Việt Nam, tình trạng sử dụng corticoid ngày càng phổ biến, đặc biệt là ở đối tượng người cao tuổi. Theo thống kê của Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, tại Khoa Nội Tổng hợp, Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, nghiên cứu trên 400 hồ sơ bệnh án cho thấy nhóm tuổi ≥60 chiếm 68,75% số bệnh nhân được kê corticoid. Methylprednisolon là loại được sử dụng nhiều nhất (79,5%), chủ yếu qua đường tiêm (64,75%) và thường dùng trong 1–4 ngày (54,75%) [8].

Theo nghiên cứu về Tình hình kê đơn thuốc corticoid đường uống tại Khoa Khám bệnh, Bệnh viện Quân y 7A năm 2022, phần lớn corticoid được chỉ định cho mục đích kháng viêm (60,5%), tiếp theo là ức chế miễn dịch (24,25%) [9]. Nhiều người tự ý sử dụng các chế phẩm chứa corticoid mà không qua thăm khám bác sĩ, dẫn đến nguy cơ lạm dụng và hậu quả nghiêm trọng Trên thế giới, xu hướng sử dụng corticoid đường uống tăng rõ rệt. Nghiên cứu điều tra và so sánh các mô hình kê đơn corticoid từ năm 2009 đến năm 2018 trong dân số nói chung của Hoa Kỳ, Đài Loan và Đan Mạch.437 người tham gia, tỷ lệ 2 phần trăm trung bình hàng năm sử dụng corticoid là 6,8% tại Hoa Kỳ, 17,5% tại Đài Loan và 2,2% tại Đan Mạch trong giai đoạn 2009–2018[10]. Tỷ lệ kê đơn corticoid tăng trung bình hàng năm là 0,1%–0,17%, chủ yếu là các đơn thuốc ngắn ngày cho người lớn khỏe mạnh, tiềm ẩn nhiều rủi ro ở cấp quốc gia.

Do đó, cần thận trọng trong việc kê đơn và theo dõi tác dụng phụ để đảm bảo an toàn cho bệnh nhân. Tuy nhiên, việc lạm dụng corticoid trong thực phẩm bổ sung và sản phẩm tăng cường sức khỏe ngày càng khó kiểm soát, đặc biệt khi các nhà sản xuất bất hợp pháp có thể cố tình bổ sung các hoạt chất này để tăng tính “hiệu quả” mà không tuân thủ các quy định về chất cấm. Tại Việt Nam, Bộ Y tế đã ban hành Thông tư số 10/2021/TT-BYT quy định danh mục chất cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe, trong đó bao gồm 18 corticoid [2] 1. Cấu trúc một số chất nhóm corticoid Nghiên cứu này được thực hiện với đối tượng là toàn bộ 18 chất nhóm corticoid có trong danh mục chất cấm theo Thông tư số 10/2021/TT-BYT.

Cấu trúc của các chất này được trình bày trong Bảng 1. Danh mục 18 corticoid cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh TPBVSK trong thông tư 10/2021/TT-BYT STT Tên chất Một số STT Tên chất Một số STT Tên chất Một số đặc điểm đặc điểm đặc điểm 1 M=392,5 2 M=360,4 3 M=374,5 g/mol g/mol g/mol Chất rắn Chất rắn Chất rắn T nóng chảy = T nóng chảy T nóng chảy = 232,5°C 178°C 235°C Độ hòa tan Độ hòa tan Độ hòa tan 120mg/L Betamethason 66,5mg/L Prednisolon 223mg/L Methylprednisolon logP = 1,525 logP = 1,138 logP = 1,62 4 M=392,5 5 M=394,4 6 M=358,4 g/mol g/mol g/mol Chất rắn Chất rắn Chất rắn T nóng chảy = 230- T nóng chảy = T nóng chảy = 235°C 260-264°C 270°C Tan rất ít Độ hòa tan Độ hòa tan logP = 1,46 Dexamethason 89mg/L tại 80mg/L trong Prednison Triamcinolon 25 °C nước tại 25 °C logP = 1,83 logP = 1,83 4 7 M=430,5 8 M=362,5 9 M=360,4 g/mol g/mol g/mol Chất rắn Chất rắn Chất rắn T nóng chảy = T nóng chảy = T nóng chảy = 222°C 226°C 220°C Độ tan: Tan rất ít trong Độ tan: 30,28mg/ml nước 320mg/L Cortison logP = 1,47 Budesonide Hydrocortison logP = 1,914 logP = 1,61 10 M=441,5 11 M=408,9 12 M=467,0 g/mol g/mol g/mol Chất rắn Chất rắn Chất rắn T nóng chảy =196°C T nóng chảy: > logP = 3,5 215°C Deflazacort Beclomethason Clobetasol propionate 5 13 M=494,5 14 M=376,5 15 M=412,4 g/mol g/mol g/mol Chất rắn Chất rắn Chất rắn T nóng chảy = T nóng chảy 309°C =292-303°C Độ tan Độ tan: Fluocinonide 4,74mg/L Fluorometholon 30mg/L ở Fluocinolon logP = 3,19 25 °C logP = 2 16 17 18 M= M=444,5 M= 380.4 g/mol Chất rắn Chất rắn Chất rắn Độ tan: 140mg/L T nóng chảy = ở 25 °C trong 218-220°C nước Mometason Độ tan: Fluticason Fludrocortison Không tan trong nước 6 1. Các phương pháp phân tích nhóm glucocorticois trái phép trong TPBVSK Hiện tại ở Việt Nam đã có các nghiên cứu về xác định corticoid trộn trái phép trong TPBVSK bằng HPTLC [11], HPLC [3], LC-MS/MS [12] Tại trường Đại học Dược Hà Nội, cũng đã có nhiều nhóm nghiên cứu liên quan đến việc trộn trái phép nhóm corticoid trong mỹ phẩm và TPBVSK. Năm 2017, Nghiên cứu của GS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu và cộng sự đã sử dụng HPLC để định tính và định lượng đồng thời 12 loại corticoid thông thường bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm [13].

Các mẫu ở dạng kem. Kết quả có 3/11 mẫu trộn GC tương ứng với clobetasol propionat với hàm lượng khoảng 0,001% - 0,0015% (10 - 15 μg/g). Tiếp đó trong năm 2018 và 2019, nhóm nghiên cứu của PGS. Nguyễn Thị Kiều Anh và PGS.

Phạm Thị Thanh Hà cũng đã thực hiện nhiều nghiên cứu phát hiện các chất nhóm corticoid trong các chế phẩm đông dược và TPBVSK bằng nhiều phương pháp HPTLC [14], [15], HPLC [16] và LC- MS/MS [17]. Trong những năm gần đây, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) đã trở thành lựa chọn chính trong giám sát corticoid trên toàn cầu. LC-MS/MS cho phép định lượng chính xác các corticoid với độ nhạy cao (đến mức ng/L) và độ đặc hiệu tốt, phù hợp cho phân tích đa dư lượng. Ở Việt Nam, một số trung tâm kiểm nghiệm đã bước đầu triển khai LC-MS/MS để phát hiện corticoid trong TPBVSK, nhưng vẫn chủ yếu tập trung vào phân tích mục tiêu (targeted analysis) đối với các chất đã biết [4].

Trên thế giới có nhiều nghiên cứu định tính và định lượng các GC có trong các chế phẩm đông dược, thực phẩm và thực phẩm chức năng. Các phương pháp phổ biến như TLC [18], HPLC [19], UV-Vis [20], LC-MS/MS [21], UHPLC-MS/MS [22]. Các phương pháp định lượng sử dụng LC-MS/MS được tóm tắt trong Bảng 1. Mặc dù các phương pháp trên có những ưu điểm nhất định về tính sẵn có và độ nhạy, chúng vẫn tồn tại một số hạn chế nhất định khi phân tích nền mẫu TPBVSK vốn dĩ rất phức tạp vì chứa nhiều thành phần.

Các kỹ thuật cổ điển như TLC hoặc HPTLC chủ yếu đáp ứng nhu cầu sàng lọc định tính, song độ nhạy và độ đặc hiệu còn hạn chế, dễ bị ảnh hưởng bởi nhiễu nền khi mẫu chứa nhiều thành phần hoạt chất khác nhau. Trong khi đó, những phương pháp như HPLC hay UV-Vis có thể định lượng được corticoid, nhưng khả năng tách chất và độ đặc hiệu trong nền mẫu phức tạp thường chưa đạt yêu cầu, dễ xảy ra hiện tượng trùng đỉnh hoặc giao thoa tín hiệu, đặc biệt khi cần định lượng nhiều chất GC hoặc các hợp chất tương tự. Phương pháp LC-MS/MS hoặc UHPLC-MS/MS phần nào khắc phục được các nhược điểm trên nhờ độ nhạy vượt trội, định lượng chính xác và khả năng phân tích đồng thời nhiều hợp chất. Tuy nhiên, các phương pháp này vẫn chủ yếu được phát triển cho phân tích có mục tiêu (targeted analysis), tức là đòi hỏi phải có sẵn chất chuẩn cho 7 từng GC cần kiểm tra.

Điều này trở thành rào cản khi xuất hiện các GC mới hoặc dẫn xuất chưa có chất chuẩn đối chiếu Ngược lại, LC-HRMS là công cụ phân tích hiện đại có khả năng đo chính xác khối lượng phân tử ở độ phân giải cao, giúp dễ dàng nhận diện và phân tích các corticoid, kể cả khi chúng tồn tại ở nồng độ vết hoặc khi xuất hiện các GC mới chưa có chuẩn sẵn (untargeted screening). LC-HRMS cũng có khả năng đồng thời thực hiện cả phân tích định tính và định lượng đa dư lượng trong một lần chạy mẫu, giúp rút ngắn thời gian phân tích và tăng độ tin cậy so với các phương pháp cổ điển. Đây là ưu điểm đặc biệt cần thiết trong bối cảnh TPBVSK thường có thành phần nền mẫu phức tạp, nhiều chất gây nhiễu, và có thể bị trộn nhiều loại GC khác nhau để đánh lừa kiểm nghiệm. Tại Việt Nam, việc ứng dụng LC-HRMS trong việc xác định corticoid trong TPBVSK còn hạn chế, chủ yếu do chi phí đầu tư thiết bị cao và thiếu quy trình chuẩn hóa phương pháp 8 Bảng 1.

Tóm tắt một số nghiên cứu về nhóm GC Kỹ thuật Nền mẫu Điều kiện xử lý mẫu Điều kiện sắc ký LOD, LOQ TLTK phân tích UHPLC- Thịt lợn, 2 quy trình xử lý mẫu. Cột Zorbax Eclipse Plus LOD: 0.0 [23] Orbitrap- bò, gà Quy trình 1: Cân mẫu → thêm nước → vortex C18 (100x2.1mm, cỡ hạt µg/kg. MS → thêm acid formic/ACN → khuấy → ly tâm 1,8 µm) LOQ: 1.0 → lọc 0,2 µm → tiêm LC Pha động: pha B: µg/kg Methanol, pha A: 0,1% Quy trình 2: 1 g mẫu + 4 mL ACN → vortex → acid formic/H2O thêm NaCl + MgSO₄ → vortex, ly tâm → thêm Al₂O₃ + Florisil → vortex, ly tâm → lọc 0,2 µm → tiêm LC 9 UHPLC- Bột, Dung Hòa tan mẫu bằng MeOH/H₂O (70:30), siêu âm, Cột BEH C18 (100 mm LOQ là 0,47- [24] MS/MS. dịch, Viên lọc qua màng PVDF 0.