Tổng quan luận án

Đề tài luận án tiến sĩ: “Phân lập một số hợp chất taxoid từ lá Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng ở Lâm Đồng, định hướng thiết lập chất đối chiếu” thuộc chuyên ngành Dược học (chuyên sâu Hóa dược liệu và Kiểm nghiệm thuốc). Nghiên cứu được thực hiện theo hướng thực nghiệm hóa học các hợp chất thiên nhiên kết hợp phân tích kiểm nghiệm dược phẩm.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Các loài Thông đỏ (Taxus sp.) chứa nhóm hoạt chất chính là diterpenoid khung taxan (taxoid), tiêu biểu là paclitaxel (Taxol®) và 10-deacetylbaccatin III (10-DAB, tiền chất bán tổng hợp paclitaxel) dùng trong điều trị nhiều loại ung thư như ung thư buồng trứng, ung thư vú và ung thư phổi. Trên thế giới, việc khai thác taxol ban đầu chủ yếu từ vỏ cây tự nhiên dẫn đến tàn phá nguồn tài nguyên thực vật; trung bình phải đốn hạ 6 đến 8 cây Thông đỏ 100 năm tuổi mới thu đủ lượng taxol điều trị cho một bệnh nhân. Năm 2011, Sách đỏ IUCN đã xếp Taxus wallichiana vào danh mục loài có nguy cơ tuyệt chủng.

Tại Việt Nam, Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) phân bố tự nhiên rất hạn chế tại vùng núi cao (chủ yếu ở Lâm Đồng với số lượng ước tính trên 250 cây, ngoài ra còn có ở Khánh Hòa, Hà Giang), được xếp vào cấp VU trong Sách đỏ Việt Nam (2007) và thuộc nhóm IA theo Nghị định 32/2006/NĐ-CP (nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại). Nhằm tạo nguồn nguyên liệu bền vững mà không xâm hại quần thể tự nhiên, Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã tiến hành trồng Thông đỏ lá dài. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu lá trồng tại Lâm Đồng chưa được nghiên cứu toàn diện về thành phần các hợp chất taxoid đi kèm, đồng thời tại Việt Nam còn thiếu các chất đối chiếu taxoid tinh khiết và quy trình kiểm nghiệm chuẩn hóa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng dược liệu.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 3 mục tiêu cụ thể:

  1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất taxoid từ lá Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng ở Lâm Đồng.
  2. Thiết lập một số chất đối chiếu được phân lập từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng phục vụ công tác kiểm nghiệm.
  3. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời taxol và một số taxoid phân lập được từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Bột lá Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) đã phơi khô trong mát, xay nhỏ kích thước $\le$ 2 mm, khối lượng 25 kg.
  • Nguồn gốc và thời gian thu mẫu: Mẫu lá mang ký hiệu T9-B7, thu hái ngày 30/9/2012 tại Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt - Vimedimex (tỉnh Lâm Đồng), được định danh thực vật bởi TS. Võ Văn Chi và lưu giữ tiêu bản tại Bộ môn Tài nguyên - Dược liệu, Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi nghiên cứu: Phân lập, tinh chế các hợp chất diterpenoid nhóm taxoid; xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại; đánh giá tiêu chuẩn chất đối chiếu theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và ASEAN; xây dựng, thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) định lượng đồng thời các taxoid.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước trong và ngoài nước

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu về thực vật học, thành phần hóa thực vật, hoạt tính sinh học và phương pháp phân tích chi Taxus:

  • Về phân loại thực vật và nguồn gốc: Spjut (1995, 2007, 2010) phân loại chi Taxus thành 24 loài và 55 thứ thuộc 3 nhóm chính (Baccata, Wallichiana, Sumatrana). Nhóm Wallichiana gồm 2 phân nhóm Chinensis và Wallichiana phân bố tại châu Á và Bắc Mỹ; Axelrod (1975) đề cập đến sự hình thành đặc điểm hình thái Taxus trong thời kỳ Neogene; Manchester (1994) công bố các hóa thạch hạt Taxaceae tại Oregon. Tại Việt Nam ghi nhận 2 loài là Taxus chinensis (Thông đỏ lá ngắn) và Taxus wallichiana Zucc. (Thông đỏ lá dài).
  • Về chiết xuất và phân lập taxoid:
    • Wani và cộng sự (1971) lần đầu tiên chiết xuất và phân lập paclitaxel từ vỏ Taxus brevifolia bằng kỹ thuật phân bố dung môi và sắc ký cột (Florisil, Sephadex LH-20, silica-gel).
    • Rao (1993) đề xuất quy trình chiết taxoid bằng các dung môi hữu cơ thông thường (ethanol, methanol, nước).
    • Jennings và cộng sự (1992) chiết taxoid bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn kết hợp 3% ethanol.
    • Mattina và cộng sự (1997) ứng dụng kỹ thuật chiết hỗ trợ vi sóng (MAE) trên lá Taxus.
    • Kikuchi (1997), Kawamura (1999) sử dụng phương pháp chiết xuất gia tốc dung môi (ASE) với hệ dung môi MeOH–H2O (90:10) trên Taxus cuspidata.
    • Nhóm nghiên cứu Đại học Bách khoa Virginia và Polysciences Inc. (1986) phát triển quy trình chiết quy mô lớn từ 650 kg vỏ T. brevifolia thu được 911 g taxol thô.
    • Yang và cộng sự (1998) dùng sắc ký lỏng điều chế công nghiệp (IPLC) với nhựa D956 để tinh chế taxol từ Taxus yunnanensis.
    • Xue và cộng sự (2000, 2001) phân lập quy mô lớn taxol, 7-epi-10-deacetyltaxol và cephalomannin trên cột pha đảo C18 từ vỏ T. yunnanensis.
    • Dorota và cộng sự (2009) so sánh 4 phương pháp chiết (siêu âm, vi sóng, chiết lỏng áp suất PLE, Soxhlet) trên lá Taxus.
    • Madhusudanan, Chattopadhyay và cộng sự (2002) phân tích dữ liệu taxoid vỏ thân T. wallichiana bằng LC-ESIMS và MS/MS; Atta-ur-Rahman và cộng sự (2003) phân lập dẫn xuất mới abeo-baccatin-VI từ T. wallichiana; Dang và cộng sự (2017) phân lập các hợp chất mới nhóm wallitaxan A–F từ vỏ T. wallichiana.
    • Tại Việt Nam: Mai Văn Trì và cộng sự (2001) phân lập biflavonoid 7,7″,4-tri-O-trimethylamentoflavon từ lá Thông đỏ Lâm Đồng; Nguyễn Hữu Toàn Phan và cộng sự (2007) khảo sát sự biến động hàm lượng 10-DAB III và 19-hydroxybaccatin III trong lá theo các tháng trong năm (đạt cao nhất vào tháng 6); Trần Công Luận và cộng sự (2008) khảo sát sơ bộ thành phần hóa học lá Thông đỏ; Nguyễn Thị Thanh Tâm và cộng sự (2009) phân lập taxinin B, taxuspin F, 10-deacetyltaxuspin F, 19-hydroxybaccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 7-(β-xylosyl)-10-deacetyltaxol; Trần Công Luận và Vương Chí Hùng (2015) nghiên cứu công nghệ chiết pilot CO2 siêu tới hạn; Lê Thị Kim Phụng và cộng sự (2016) đánh giá hiệu suất chiết taxol và 10-DAB III bằng vi sóng (MAE), siêu âm (UAE) và Soxhlet.
  • Về phương pháp phân tích và định lượng taxoid:
    • HPLC pha đảo với nhiều loại pha tĩnh: C18 và C8 (Vidensek 1990; Harvey 1991; Theodoridis 2001; Dong 2005; Yuangang Zu 2006); cột Phenyl (Castor & Tyler 1993); cột Cyano (Auriola 1992); cột Pentafluorophenyl - PFP (Richheimer 1992; Fu YJ 2009; Dược điển Mỹ USP 41);
    • Sắc ký mixel điện động / điện di mao quản MEKC/CZE (Chan 1994; Truus 2012);
    • Sắc ký lớp mỏng điều chế (Glowaniak & Mroczek 1999);
    • Sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC trên cột hạt nhỏ Acquity BEH Shield RP 18 (Zhang Jing 2011, 2012).
Dược liệu / Loài Hợp chất Taxoid phân tích Phương pháp và điều kiện sắc ký Tài liệu trích dẫn
T. media Taxol HPLC-C18; pha động MeOH – H2O (68:32) Vidensek và cs (1990)
T. cuspidata, T. chinensis, T. media 10-DAB III, baccatin III, cephalomannin, paclitaxel HPLC-PDA, cột HIQ SIL C18W; pha động ACN – H2O gradient Yuangang Zu và cs (2006)
T. x media Taxol, 10-DAT, 7-epi-10-DAT, cephalomannin, baccatin III HPLC, cột Phenyl; pha động ACN – MeOH – H2O (12:53:33) Castor và Tyler (1993)
T. cuspidata Taxol HPLC-MS, cột Cyano Zorbax; ACN – ammonium acetate 0,05 M Auriola và cs (1992)
T. cuspidata, T. media, T. chinensis Paclitaxel, 10-DAB III, 7-xyl-10-DAT, 10-DAT, cephalomannin, 7-epi-10-DAT HPLC, cột PFP; pha động ACN – H2O gradient Fu YJ và cs (2009)
Taxus sp. (Estonia) 10-DAB, baccatin III, cephalomannin, paclitaxel CZE, đệm dinatri tetraborat 50 mM pH 9; điện thế 20 kV Truus và cs (2012)
Taxus sp. Taxol, 10-DAB, cephalomannin UPLC, cột Acquity BEH Shield RP 18 (2,1 x 100 mm; 1,7 µm); pha động ACN – H2O Zhang Jing và cs (2011, 2012)

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù paclitaxel và 10-DAB III đã được quan tâm nghiên cứu, nhiều dẫn xuất taxoid tự nhiên khác tồn tại trong lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng chưa được phân lập đầy đủ với độ tinh khiết cao. Bên cạnh đó, các phòng kiểm nghiệm tại Việt Nam gặp khó khăn do thiếu nguồn chất chuẩn đối chiếu taxoid (ngoài paclitaxel thương mại) và thiếu phương pháp phân tích HPLC được thẩm định đầy đủ để định lượng đồng thời nhiều hợp chất taxoid trong nguồn nguyên liệu lá trồng. Luận án giải quyết khoảng trống này thông qua quy trình kết hợp sắc ký hiện đại để phân lập, tinh chế, thiết lập 4 chất đối chiếu taxoid và xây dựng quy trình HPLC định lượng đồng thời.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Cấu trúc hóa học nhóm Taxoid: Dẫn xuất diterpenoid có nguồn gốc sinh tổng hợp từ pyruvat và glyceraldehyd-3-phosphat qua con đường 2-C-methyl-D-erythritol phosphat tạo isopentenyl diphosphat và dimethylallyl diphosphat, tiếp tục ngưng tụ thành geranyl diphosphat và đóng vòng taxadien nhờ enzym taxadien synthetase. Khung cơ bản là hệ 6/8/6 (vòng 8 carbon kẹp giữa hai vòng 6 carbon), bên cạnh các dạng chuyển vị như 3,11-cyclotaxan (4 vòng), 11(15$\rightarrow$1)-abeo-taxan (khung 5/7/6), 2(3$\rightarrow$20)-abeo-taxan (khung 6/10/6), và 11(15$\rightarrow$1), 11(10$\rightarrow$9)-bisabeo-taxan.
  • Khung tiêu chuẩn thiết lập chất đối chiếu: Dựa trên hướng dẫn thiết lập chất đối chiếu hóa học của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Khối ASEAN, bao gồm các tiêu chí: độ tinh khiết sắc ký $> 95%$, khối lượng $> 150$ mg, kiểm tra tính đồng nhất lô, phân tích thống kê ANOVA một yếu tố và đánh giá liên phòng thí nghiệm.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quy trình nghiên cứu được triển khai tuần tự qua các giai đoạn thực nghiệm:

[25 kg bột lá Thông đỏ khô]
[Cao MeOH thô]
[Cao dicloromethan (CH2Cl2)]
[Phân đoạn cao MeOH 100%]
[Các phân đoạn giàu taxoid (Tw1, Tw2)]          [Khảo sát SKLM (Rf: 0,2 - 0,5)]
[Phân đoạn bán tinh khiết]               [HPLC điều chế Prep-HPLC C18]
        [Xác định cấu trúc hóa học]                                      [Thiết lập Chất đối chiếu & Định lượng]
  (1D/2D-NMR 500 MHz, MS, FT-IR, UV-Vis, [α]D)                     - Đánh giá độ tinh khiết HPLC-PDA, SKLM
                                                                   - Kiểm tra đồng nhất lô, ANOVA, liên PTN
                                                                   - Thẩm định quy trình HPLC định lượng đồng thời
  • Chiết xuất và phân đoạn thô: 25 kg bột lá khô được ngâm lạnh với MeOH (tỷ lệ 1:6, ngâm 24 giờ). Dịch chiết gom lại, cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao MeOH thô. Hòa cao MeOH thô vào nước rồi lắc phân bố lỏng - lỏng với dicloromethan (DCM), thu được cao CH2Cl2. Nạp cao CH2Cl2 lên cột Diaion HP-20, rửa giải lần lượt bằng nước, MeOH 20%, MeOH 40%, MeOH 60%, MeOH 80% và MeOH 100%. Phân đoạn cao MeOH 100% được chọn để phân lập taxoid.
  • Sắc ký cột cổ điển (SKC): Sử dụng cột thủy tinh kích thước $7 \times 100$ cm nạp silica gel Merck (cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, tỷ lệ nạp mẫu 75 g và 50 g), chiều cao cột 80 cm, tốc độ dòng 20 ml/phút, thể tích hứng 250 ml/phân đoạn, dung môi gradient tăng dần độ phân cực.
  • Sắc ký cột áp suất trung bình (MPLC): Hệ thống Combiflash Companion TS, cột RediSep ($30 \times 3$ cm) nạp 70 g silica gel ($40 - 63$ µm), mẫu nạp 100 mg/2 ml aceton, pha động gradient PE – aceton dựa trên kết quả thăm dò SKLM (chọn hệ có Rf từ 0,2 – 0,5), thể tích hứng 40 ml/bình.
  • HPLC điều chế (Preparative HPLC) và kết tinh lại: Hệ thống Preparative HPLC Merck Knauer, đầu dò UV K2600, cột Phenomenex Gemini C18 ($250 \times 21,20$ mm; 5 µm), pha động ACN – H2O (90:10), tốc độ dòng 3 ml/phút, bước sóng 280 nm. Kỹ thuật kết tinh lại sử dụng hệ dung môi DCM – PE (hòa tan lượng tối thiểu DCM, nhỏ từ từ PE, làm lạnh, lọc phễu xốp).
  • Phương pháp phổ nghiệm xác định cấu trúc:
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D ($^1$H-NMR, $^{13}$C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC) đo trên máy Bruker Avance 500 MHz (dung môi CDCl3).
    • Khối phổ đo trên máy MS-5989B Engine.
    • Phổ hồng ngoại đo trên máy quang phổ Nicolet iS50 FT-IR.
    • Phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis), đo điểm chảy và năng suất quay cực $[\alpha]_D$.
  • Phương pháp đánh giá chất đối chiếu:
    • Kiểm tra độ tinh khiết sắc ký trên 3 hệ dung môi SKLM khác nhau và HPLC-PDA quy về 100% diện tích pic.
    • Đánh giá độ đồng nhất lô, phân tích phương sai ANOVA một yếu tố và thử nghiệm liên phòng thí nghiệm (Khoa Thiết lập chất chuẩn - Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM, Bộ môn Hóa Phân tích - ĐH Y Dược TP.HCM, Phòng Kiểm tra chất lượng - Công ty CP Dược phẩm Cửu Long).
  • Phương pháp HPLC phân tích định lượng:
    • Hệ thống HPLC Shimadzu CBM 20A, autosampler SIL-20AC, đầu dò PDA SPD-M20A.
    • Cột phân tích Phenomenex Gemini-NX-5u C18 110 Å ($250 \times 4,6$ mm; 5 µm).
    • Thẩm định quy trình theo hướng dẫn: tính phù hợp hệ thống (%RSD), tính tuyến tính, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại, độ chính xác trung gian, và độ đúng ($n=9$).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện cơ sở lý luận và thực tiễn liên quan đến đề tài:

  • Thực vật học: Mô tả chi tiết đặc điểm hình thái thân, cành, lá, nón đực, nón cái, hạt của loài Taxus wallichiana Zucc., vùng phân bố tự nhiên trên thế giới (Nepal, Myanmar, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Việt Nam) và tại Việt Nam (Lâm Đồng, Khánh Hòa, Hà Giang). Phân tích cấu trúc giải phẫu vi phẫu lá (tế bào biểu bì hình tứ giác/chữ nhật cao, dải lỗ khí, nhú papillose) và sự khác biệt hình thái với các loài châu Á khác (Taxus contorta, Taxus chinensis).
  • Thành phần hóa học: Trình bày chi tiết các nhóm hợp chất phân lập từ các bộ phận của Thông đỏ:
    • Diterpenoid khung taxan: Phân loại hơn 50 hợp chất diterpenoid đã biết (paclitaxel, baccatin III, 10-DAB III, cephalomannin, các dẫn xuất abeo-taxan, taxinin, taxuspin...).
    • Flavonoid: Các hợp chất biflavonoid đặc trưng của ngành Hạt trần (amentoflavon, sciadopitysin, ginkgetin, sequoiaflavon, 7,7″,4-tri-O-trimethylamentoflavon).
    • Tinh dầu: Thành phần alkan (n-eicosan, docosan), alcohol (geraniol, eugenol), aldehyd, acid hữu cơ, ester (geranyl tiglat, benzyl acetat), monoterpen ($\alpha$-pinen, $\beta$-pinen, camphor) và sesquiterpen ($\beta$-caryophyllen, $\alpha$-humulen).
    • Lignan: Texiresinol, isotaxiresinol, (-)-secoisolariciresinol, hydroxymatairesinol.
    • Phytosterol và phytoecdysteroid: $\beta$-sitosterol, daucosterol, ponasteron, ecdyson.
  • Tác dụng dược lý và độc tính: Tổng quan tác dụng y học cổ truyền (tiêu tích, giảm đau, điều kinh) và y học hiện đại (chống phân bào, kháng ung thư của paclitaxel và lignan; kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, hạ sốt trên mô hình động vật). Phân tích độc tính tim mạch của alkaloid taxin và tác dụng phụ gây suy tủy, đột biến gen của paclitaxel.
  • Kỹ thuật chiết xuất và phân tích: Tổng kết có hệ thống các phương pháp chiết (dung môi hữu cơ, siêu tới hạn, vi sóng, ASE, siêu âm, chiết công nghiệp) và các phương pháp sắc ký (HPLC, UPLC, MEKC, TLC điều chế) áp dụng trên nhóm hợp chất taxoid.

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và điều kiện trang thiết bị:

  • Xử lý nguyên liệu 25 kg bột lá Thông đỏ thu hái tại Đà Lạt (tháng 9/2012).
  • Hóa chất, dung môi phân tích (Merck, Chemsol, J.T. Baker) và chất chuẩn paclitaxel (Sigma, code T7402, độ tinh khiết 99%).
  • Thiết lập quy trình chiết ngâm lạnh MeOH, phân bố lỏng - lỏng với DCM, tinh chế qua cột Diaion HP-20 thu phân đoạn cao MeOH 100%.
  • Tối ưu hóa điều kiện sắc ký cột cổ điển (silica gel $40 - 63$ µm, $7 \times 100$ cm) và MPLC RediSep ($30 \times 3$ cm) với 3 hệ dung môi khảo sát: PE – EtOH (9:1), DCM – MeOH (9:1), PE – aceton (7:3).
  • Thiết lập thông số HPLC điều chế (cột Phenomenex Gemini C18, pha động ACN – H2O 90:10, tốc độ dòng 3 ml/phút, $\lambda = 280$ nm).
  • Phương pháp luận phổ nghiệm 1D/2D-NMR, MS, FT-IR, UV-Vis để giải mã cấu trúc hóa học.
  • Tiêu chí và phương pháp thống kê thiết lập chất đối chiếu theo hướng dẫn WHO/ASEAN.
  • Thiết kế thẩm định phương pháp định lượng HPLC trên cột Phenomenex Gemini-NX C18 ($250 \times 4,6$ mm; 5 µm), đầu dò PDA.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và bàn luận

Chương này công bố toàn bộ dữ liệu thực nghiệm và bàn luận kết quả:

  • Phân lập và xác định cấu trúc 5 hợp chất Taxoid:
    1. Hợp chất (1): Taxinin B — xác định cấu trúc dựa trên so sánh dữ liệu phổ $^1$H-NMR, $^{13}$C-NMR, tương quan COSY và HMBC.
    2. Hợp chất (2): Taxuspin F — xác định cấu trúc qua phổ NMR 1D/2D, phổ MS, UV-Vis và IR.
    3. Hợp chất (3): 10-Deacetyl taxinin B — làm sáng tỏ cấu trúc phổ tương quan HMBC, COSY và so sánh dữ liệu phổ NMR.
    4. Hợp chất (4): Taxuspin D — xác định cấu trúc dựa trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân và các dữ liệu phổ nghiệm đối chiếu.
    5. Hợp chất (5): Taxchinin B — xác định cấu trúc thông qua dữ liệu phổ $^1$H-NMR, $^{13}$C-NMR, tương quan HMBC, COSY.
  • Thiết lập 4 chất đối chiếu (CĐC):
    • Đã tinh chế và thiết lập hồ sơ chất đối chiếu cho 4 hợp chất: Taxinin B, Taxuspin F, 10-deacetyl taxinin B và Taxuspin D (mỗi chất đều đạt khối lượng $> 150$ mg và độ tinh khiết sắc ký HPLC $> 95%$).
    • Kiểm tra độ tinh khiết trên SKLM và HPLC-PDA 3D: xác nhận độ đồng nhất phổ pic (peak purity) và không có tạp chất đồng rửa giải.
    • Đánh giá độ lặp lại, độ đồng nhất lô và phân tích ANOVA một yếu tố: kết quả phân tích thống kê liên phòng thí nghiệm chứng minh sự đồng nhất và tin cậy của các lô chất đối chiếu.
    • Xác định giá trị ấn định hàm lượng cho từng chất đối chiếu: Taxinin B, Taxuspin F, 10-deacetyl taxinin B, Taxuspin D.
  • Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời bằng HPLC:
    • Khảo sát các điều kiện sắc ký: lựa chọn bước sóng phát hiện thích hợp (227 nm và 280 nm), tối ưu hóa hệ pha động ACN – H2O chạy theo chương trình rửa giải gradient, khảo sát tốc độ dòng (0,8 ml/phút, 1,0 ml/phút, 1,2 ml/phút).
    • Kết quả thẩm định phương pháp:
      • Tính phù hợp hệ thống: Độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) của diện tích pic và thời gian lưu đạt yêu cầu quy định.
      • Tính tuyến tính: Hệ số tương quan $R^2$ đạt độ tin cậy cao trên khoảng nồng độ khảo sát; xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) cho từng chất.
      • Độ lặp lại và độ chính xác trung gian: Khảo sát trên $n = 6$, %RSD đạt yêu cầu theo hướng dẫn kiểm nghiệm dược phẩm.
      • Độ đúng: Đánh giá qua phương pháp thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ ($n = 9$), tỷ lệ phục hồi nằm trong giới hạn cho phép.
    • Ứng dụng quy trình định lượng đồng thời hàm lượng các taxoid trong mẫu thử lá Thông đỏ Lâm Đồng (mẫu TW).

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

  1. Luận án đã xây dựng quy trình chiết xuất và phân lập hoàn chỉnh kết hợp giữa sắc ký cột cổ điển, sắc ký cột áp suất trung bình (MPLC) và HPLC điều chế để phân lập thành công 5 hợp chất diterpenoid nhóm taxoid từ lá Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng tại Lâm Đồng, gồm: taxinin B (1), taxuspin F (2), 10-deacetyl taxinin B (3), taxuspin D (4) và taxchinin B (5).
  2. Cung cấp bộ dữ liệu phổ nghiệm đầy đủ, có hệ thống ($^1$H-NMR, $^{13}$C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, MS, FT-IR, UV-Vis, điểm chảy, $[\alpha]_D$) của 5 hợp chất taxoid phân lập từ nguồn nguyên liệu trồng tại Việt Nam, góp phần bổ sung dữ liệu hóa thực vật cho loài Taxus wallichiana.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  1. Lần đầu tiên tại Việt Nam thiết lập thành công 4 chất đối chiếu nguồn gốc tự nhiên từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng gồm: taxinin B, taxuspin F, 10-deacetyl taxinin B và taxuspin D theo đúng các nguyên tắc và hướng dẫn của WHO và ASEAN (đạt độ tinh khiết $> 95%$, đầy đủ thử nghiệm độ đồng nhất, đánh giá liên phòng thí nghiệm và xác định giá trị ấn định).
  2. Xây dựng và thẩm định thành công quy trình phân tích HPLC pha đảo cho phép định lượng đồng thời paclitaxel cùng các hợp chất taxoid trong nguyên liệu lá Thông đỏ. Phương pháp có tính đặc hiệu cao, độ đúng, độ lặp lại và tính tương thích hệ thống đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm.
  3. Cung cấp cơ sở khoa học và công cụ kiểm nghiệm phục vụ việc kiểm soát chất lượng nguồn dược liệu Thông đỏ lá dài trồng tại Đà Lạt, hỗ trợ định hướng khai thác lá cây tái sinh bền vững phục vụ ngành công nghiệp chiết xuất hoạt chất chống ung thư, thay thế phương thức khai thác tận diệt vỏ cây tự nhiên.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

  • Đối tượng nghiên cứu tập trung trên lô mẫu lá thu hái tại một thời điểm nhất định (tháng 9/2012) tại vùng trồng Đà Lạt, Lâm Đồng; chưa mở rộng khảo sát hàm lượng taxoid theo các mùa khác nhau trong năm và các tiểu vùng sinh thái khác nhau.
  • Do trên thị trường quốc tế không có sẵn chất chuẩn thương mại đối với các hợp chất 10-deacetyl taxinin B, taxinin B, taxuspin F và taxuspin D, việc định lượng xác định độ tinh khiết ban đầu của nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu phải dựa trên phương pháp HPLC-PDA chuẩn hóa 100% diện tích pic.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Mở rộng nghiên cứu biến động hàm lượng của 5 hợp chất taxoid theo các tháng thu thái và độ tuổi của cây Thông đỏ trồng tại Lâm Đồng nhằm xác định thời điểm thu hoạch tối ưu.
  • Nghiên cứu công nghệ bán tổng hợp các dẫn xuất chống ung thư từ các taxoid không chứa nitơ phân lập được với hàm lượng lớn (như taxinin B, taxuspin F).
  • Ứng dụng các chất đối chiếu đã thiết lập để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và chuyên luận Dược điển cho dược liệu lá Thông đỏ lá dài và các chế phẩm chiết xuất liên quan.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn đối với các nhóm đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên ngành Hóa thực vật, Dược liệu, Hóa phân tích - Kiểm nghiệm thuốc: Tham khảo quy trình tách phân đoạn bằng Diaion HP-20, quy trình phân lập tinh chế kết hợp MPLC và HPLC điều chế, cùng phương pháp biện giải phổ 1D/2D-NMR để xác định cấu trúc các diterpenoid khung phức tạp.
  • Các viện, trung tâm kiểm nghiệm thuốc và cơ quan quản lý dược: Tham khảo quy trình và hồ sơ thực nghiệm thiết lập chất chuẩn/chất đối chiếu tự nhiên theo hướng dẫn WHO/ASEAN, cũng như quy trình HPLC-PDA định lượng đồng thời các taxoid trong kiểm soát chất lượng dược liệu.
  • Các đơn vị sản xuất, chế biến dược liệu và phát triển thuốc: Tham khảo thông số kỹ thuật chiết tách và định lượng để phát triển vùng trồng Thông đỏ lá dài tại Lâm Đồng, phục vụ định hướng tạo nguồn nguyên liệu bền vững chiết xuất hoạt chất điều trị ung thư.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc được những hợp chất taxoid cụ thể nào từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng?

Luận án đã chiết xuất, phân lập và xác định đầy đủ cấu trúc hóa học của 5 hợp chất taxoid diterpenoid:

  1. Hợp chất (1): Taxinin B
  2. Hợp chất (2): Taxuspin F
  3. Hợp chất (3): 10-Deacetyl taxinin B
  4. Hợp chất (4): Taxuspin D
  5. Hợp chất (5): Taxchinin B

Cấu trúc của các chất được xác định dựa trên dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D ($^1$H, $^{13}$C, DEPT, COSY, HSQC, HMBC), khối phổ MS, phổ hồng ngoại FT-IR, phổ UV-Vis, điểm chảy và năng suất quay cực.

2. Những hợp chất nào được lựa chọn để thiết lập chất đối chiếu và tiêu chuẩn lựa chọn là gì?

Luận án đã lựa chọn 4 hợp chất để thiết lập chất đối chiếu gồm: taxinin B, taxuspin F, 10-deacetyl taxinin B và taxuspin D. Tiêu chuẩn lựa chọn bao gồm:

  • Hợp chất đã được xác định cấu trúc hóa học rõ ràng.
  • Độ tinh khiết sắc ký trên HPLC đạt trên 95% (kiểm tra độ tinh khiết pic trên HPLC-PDA 3D và 3 hệ dung môi SKLM).
  • Khối lượng thu được sau tinh chế đạt trên 150 mg.
  • Quy trình phân lập và tinh chế có tính lặp lại và ổn định.

3. Quy trình chiết xuất và phân đoạn sơ bộ từ bột lá Thông đỏ được thực hiện như thế nào?

25 kg bột lá Thông đỏ khô ($\le$ 2 mm) được làm ẩm và ngâm lạnh với MeOH theo tỷ lệ 1:6 (ngâm 24 giờ). Dịch chiết gom lại và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao MeOH thô. Cao này được hòa tan trong nước và lắc phân bố lỏng - lỏng với dicloromethan (DCM) thu được cao CH2Cl2. Cao CH2Cl2 tiếp tục được nạp lên cột Diaion HP-20 và rửa giải phân đoạn bằng nước, MeOH 20%, 40%, 60%, 80% và MeOH 100%. Phân đoạn cao MeOH 100% là phân đoạn giàu taxoid nhất, được thu nhận để tiến hành sắc ký cột phân lập các chất tinh khiết.

4. Các kỹ thuật và thiết bị sắc ký nào được ứng dụng trong quá trình phân lập và tinh chế các taxoid?

Luận án đã kết hợp các kỹ thuật sắc ký từ cổ điển đến hiện đại:

  • Sắc ký cột cổ điển: Cột thủy tinh $7 \times 100$ cm, nạp chất hấp phụ silica gel Merck ($0,040 - 0,063$ mm), chiều cao lớp chất hấp phụ 80 cm.
  • Sắc ký cột áp suất trung bình (MPLC): Hệ thống Combiflash Companion TS, sử dụng cột RediSep ($30 \times 3$ cm) nạp silica gel $40 - 63$ µm, pha động gradient PE – aceton.
  • HPLC điều chế (Preparative HPLC): Hệ thống Merck Knauer với đầu dò UV K2600, sử dụng cột Phenomenex Gemini C18 ($250 \times 21,20$ mm; 5 µm), rửa giải bằng pha động ACN – H2O (90:10), tốc độ dòng 3 ml/phút ở bước sóng 280 nm.
  • Kỹ thuật kết tinh lại: Tinh chế trong hệ dung môi dicloromethan – ether dầu hỏa (DCM – PE).

5. Điều kiện sắc ký và các chỉ tiêu thẩm định quy trình định lượng đồng thời các taxoid bằng HPLC là gì?

Quy trình định lượng được thực hiện trên hệ thống HPLC Shimadzu CBM 20A, đầu dò PDA SPD-M20A, cột Phenomenex Gemini-NX-5u C18 110 Å ($250 \times 4,6$ mm; 5 µm). Pha động gồm Acetonitril (ACN) và Nước ($H_2O$) chạy theo chương trình rửa giải gradient, phát hiện ở hai bước sóng 227 nm và 280 nm. Quy trình được thẩm định đầy đủ theo các chỉ tiêu: tính phù hợp hệ thống (%RSD diện tích pic và thời gian lưu), tính tuyến tính ($R^2$), khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại và độ chính xác trung gian ($n = 6$, %RSD đạt yêu cầu), và độ đúng qua tỷ lệ phục hồi ở 3 mức nồng độ ($n = 9$).

Kết luận

Luận án đã giải quyết hoàn chỉnh các mục tiêu nghiên cứu từ thực nghiệm chiết xuất, phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc của 5 hợp chất diterpenoid nhóm taxoid từ lá Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng tại Lâm Đồng. Đề tài đã thiết lập thành công 4 chất đối chiếu taxoid (taxinin B, taxuspin F, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D) đạt chuẩn WHO/ASEAN và xây dựng quy trình sắc ký HPLC-PDA thẩm định đầy đủ để định lượng đồng thời các taxoid. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học, dữ liệu phổ học và phương tiện kiểm nghiệm tin cậy phục vụ việc tiêu chuẩn hóa và khai thác bền vững nguồn dược liệu Thông đỏ trồng tại Việt Nam.