Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Cây ổi (Psidium guajava L.), thuộc họ Sim (Myrtaceae), là loài thực vật nhiệt đới phân bố rộng rãi tại Việt Nam. Trong y học cổ truyền, lá ổi được sử dụng làm dược liệu điều trị tiêu chảy, kiết lỵ, viêm dạ dày, đau răng và sát trùng vết thương. Các công trình hóa thực vật và dược lý học hiện đại chỉ ra rằng lá ổi chứa nhiều nhóm hoạt chất có hoạt tính sinh học giá trị như flavonoid, tanin, polyphenol và đặc biệt là nhóm terpenoid (bao gồm monoterpen, sesquiterpen, triterpenoid và meroterpenoid). Các hợp chất terpenoid từ lá ổi đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học nổi trội như kháng khuẩn, kháng viêm, hạ đường huyết, bảo vệ gan và đặc biệt là khả năng ức chế sự tăng sinh của nhiều dòng tế bào ung thư.
Mặc dù các nhóm nghiên cứu quốc tế đã phân lập và xác định cấu trúc của nhiều hợp chất terpenoid đặc hữu từ lá ổi, tại Việt Nam, các công trình đi sâu vào việc chiết tách, phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc phổ học của nhóm chất này vẫn còn hạn chế. Nhằm xây dựng quy trình thực nghiệm và bổ sung dữ liệu khoa học phục vụ khai thác nguồn dược liệu sẵn có trong nước, đề tài "Nghiên cứu chiết xuất và phân lập một số hợp chất terpenoid từ lá ổi" được thực hiện với 2 mục tiêu cụ thể:
- Phân lập các hợp chất terpenoid tinh khiết từ cao chiết phân đoạn lá ổi.
- Xác định cấu trúc các hợp chất hóa học phân lập được.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng: Mẫu lá ổi (Psidium guajava L.) bánh tẻ, thu hái từ cây ổi từ 5 năm tuổi trở lên, không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trong vòng 1 năm trước khi thu mẫu. Nghiên cứu nằm trong khuôn khổ đề tài do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ (Mã số đề tài: 108).
- Phạm vi không gian: Mẫu dược liệu được thu hái tại xã Đông Hải, huyện Quỳnh Phụ, tỉnh Thái Bình (tọa độ địa lý: 20°35'52.5''E). Thực nghiệm chiết xuất, sắc ký và tinh chế được tiến hành tại Bộ môn Kỹ thuật Hóa dược và Chiết xuất – Khoa Công nghệ Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội.
- Phạm vi thời gian: Mẫu lá thu hái vào khung giờ 7:00 – 9:00 sáng trong các tháng 9 và 10 dương lịch; khóa luận hoàn thành vào tháng 6 năm 2024.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Khung lý thuyết và phân loại hóa thực vật
Nghiên cứu dựa trên cơ sở phân loại và hóa học các hợp chất tự nhiên nhóm terpenoid (isoprenoid). Dựa trên số đơn vị isopren cấu thành, terpenoid được phân chia thành hemiterpenoid ($C_5$), monoterpenoid ($C_{10}$), sesquiterpenoid ($C_{15}$), diterpenoid ($C_{20}$), sesterterpenoid ($C_{25}$), triterpenoid ($C_{30}$), tetraterpenoid ($C_{40}$) và polyterpenoid. Trong lá ổi, các phân nhóm chính được ghi nhận gồm:
- Monoterpen và Sesquiterpen: Khung caryophyllan, aromadendren, p-menthan, pinan (như $\beta$-caryophyllen, $\alpha$-humulen, $\alpha$-pinen, 1,8-cineol).
- Triterpenoid: Khung ursan, oleanan, lupane (như acid ursolic, acid oleanolic, acid asiatic, acid 2$\alpha$-hydroxyursolic).
- Meroterpenoid: Hợp chất lai tạp giữa khung sesquiterpenoid hoặc monoterpenoid với dẫn xuất polyphenol (điển hình là cấu trúc benzyldiformylphloroglucinol), ví dụ: guajadial, psiguadial, guajamer, psidiguajon.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Phương pháp chiết xuất: Sử dụng phương pháp ngâm nóng (hầm) bột dược liệu khô với dung môi ethanol 96% ở nhiệt độ 60°C qua 3 lần chiết (tỷ lệ dung môi/dược liệu lần lượt là 10:1, 6:1 và 4:1 theo thể tích/khối lượng), gộp dịch chiết và cô quay chân không thu cao cắn toàn phần.
- Phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng: Phân tán cao toàn phần vào nước cất, sau đó chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: $n$-hexan và dicloromethan ($\text{CH}_2\text{Cl}_2$). Phân đoạn $\text{CH}_2\text{Cl}_2$ được thu hồi để phân lập terpenoid.
- Phương pháp sắc ký:
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng pha thuận Silica gel $60\text{ F}{254}$ (Merck) và bản mỏng pha đảo $\text{RP-18 F}{254\text{S}}$ nhằm khảo sát hệ dung môi giải ly và kiểm tra vết các phân đoạn; hiện màu bằng soi đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và phun thuốc thử $\text{H}_2\text{SO}_4$ 10% kết hợp gia nhiệt.
- Sắc ký cột (CC): Kết hợp sắc ký cột pha thuận (chất hấp phụ Silica gel 60, cỡ hạt 0,040–0,063 mm) và sắc ký cột pha đảo (chất hấp phụ $\text{RP-C}_{18}$) với các hệ dung môi rửa giải gradient ($n$-hexan, aceton, $\text{CH}_2\text{Cl}_2$, ethyl acetat, methanol, nước).
- Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Đo và phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ($^1\text{H-NMR}$ ở tần số 600 MHz, $^{13}\text{C-NMR}$ ở tần số 150 MHz) và phổ hai chiều (HSQC, HMBC) trên máy Bruker AM600 FT-NMR Spectrometer tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết hợp đối chiếu dữ liệu dịch chuyển hóa học ($\delta$), độ bội và hằng số tương tác ($J$) với các tài liệu chuẩn quốc tế đã công bố.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 hệ thống hóa các đặc điểm thực vật học của loài Psidium guajava L., tổng quan thành phần hóa học và tác dụng dược lý của nhóm terpenoid trong lá ổi:
- Đặc điểm thực vật và phân bố: Cây ổi thuộc chi Psidium, họ Myrtaceae, thân nhỡ cao 3–5 m, cành non vuông cạnh, lá mọc đối có túi tinh dầu trong suốt. Cây có nguồn gốc nhiệt đới châu Mỹ, mọc hoang dại và được trồng phổ biến khắp các vùng đồng bằng và trung du Việt Nam.
- Thành phần hóa học terpenoid: Tổng kết hơn 75 hợp chất meroterpenoid đã được phân lập trên thế giới từ năm 2007 đến 2022 (chia thành các nhóm cấu trúc bicyclogermacran, caryophyllen, cadinan, thujan, pinan) cùng các triterpenoid như acid ursolic, acid oleanolic, acid corosolic, acid maslinic.
- Tác dụng sinh học của terpenoid lá ổi:
- Tác dụng chống ung thư: Dịch chiết lá ổi và các chất tinh khiết (như guajadial, guajavadial A–C, $\beta$-caryophyllen) ức chế nhiều dòng tế bào ung thư (phổi A549, NCI-H460; vú MCF-7, MCF-7 BUS; ruột HT-29; gan SMMC-7721; tuyến tiền liệt PC-3; bạch cầu K562). Guajadial thể hiện nồng độ ức chế tăng sinh tế bào TGI lần lượt là 5,59 $\mu\text{g/mL}$ (MCF-7) và 2,27 $\mu\text{g/mL}$ (MCF-7 BUS), đồng thời có cơ chế kháng thụ thể estrogen tương tự thuốc tamoxifen.
- Tác dụng kháng khuẩn, giảm mụn: Dịch chiết ức chế Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Propionibacterium acnes (với nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết methanol là 526 $\mu\text{g/mL}$, dịch chiết nước là 7,5 $\text{mg/mL}$).
- Tác dụng hạ đường huyết, chống oxy hóa và bảo vệ gan: Các psidiguajadiol C, D, F ức chế enzym protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B) với giá trị $\text{IC}_{50}$ lần lượt là 9,83; 18,52 và 16,87 $\mu\text{mol/L}$; ức chế quá trình đường hóa LDL (ở nồng độ 0,01–0,625 $\text{mg/mL}$). Các triterpenoid làm giảm nồng độ AST, ALT trong huyết thanh chuột bị tổn thương gan do quá liều acetaminophen (APAP).
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Trình bày chi tiết tiêu chuẩn nguyên vật liệu, hóa chất, máy móc và quy trình thao tác:
- Tiêu chuẩn nguyên liệu: 2,0 kg lá ổi bánh tẻ khô, sạch. Danh mục 8 loại hóa chất kỹ thuật và tinh khiết gồm ethanol 96%, $n$-hexan, dicloromethan, ethyl acetat, aceton, methanol, nước cất và $\text{H}_2\text{SO}_4$ đậm đặc.
- Quy trình chiết xuất và phân bố lỏng - lỏng: Thiết lập thông số ngâm nóng 3 lần: lần 1 (20 L EtOH 96%, ngâm 12 giờ), lần 2 (12 L EtOH 96%, ngâm 8 giờ), lần 3 (8 L EtOH 96%, ngâm 8 giờ).
- Quy trình sắc ký: Hướng dẫn kỹ thuật chuẩn bị cột, nhồi cột silica gel ướt, kỹ thuật nạp mẫu khô (đối với mẫu khó tan trong pha động) và nạp mẫu ướt, thu hứng phân đoạn kết hợp theo dõi bằng bản mỏng TLC.
Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận
Trình bày diễn biến thực nghiệm, kết quả phân lập, giải phổ cấu trúc và bàn luận khoa học:
-
Kết quả chiết xuất và phân đoạn:
- Từ 2,0 kg lá ổi khô thu được 220 g cao đặc ethanol toàn phần.
- Chiết phân bố cao cắn thu được 52 g cao phân đoạn $\text{CH}_2\text{Cl}_2$.
-
Kết quả phân lập sắc ký:
- Chạy cột sắc ký silica gel phân đoạn $\text{CH}_2\text{Cl}_2$ (52 g) với gradient dung môi $n$-hexan:aceton (10:1 $\rightarrow$ 5:1 v/v) và $\text{CH}_2\text{Cl}_2\text{:MeOH}$ (10:1 $\rightarrow$ 0:1 v/v) thu được 7 phân đoạn chính ký hiệu từ A đến G.
- Phân lập hợp chất TO1: Phân đoạn A (600,0 mg) qua cột silica gel pha thuận thu phân đoạn A3 (140,2 mg) $\rightarrow$ sắc ký cột pha đảo $\text{RP-C}_{18}$ thu phân đoạn A3b (50,7 mg) $\rightarrow$ tinh chế qua cột silica gel pha thuận thu được 6,3 mg hợp chất TO1 dạng bột màu trắng.
- Phân lập hợp chất TO4: Phân đoạn C (832,0 mg) qua cột silica gel pha thuận thu phân đoạn C3 (260,5 mg) $\rightarrow$ sắc ký cột pha thuận hệ $\text{CH}_2\text{Cl}_2\text{:EtOAc}$ (5:1 v/v) thu phân đoạn C3b (70,2 mg) $\rightarrow$ tinh chế cột pha thuận hệ $n$-hexan:EtOAc:aceton (5:1:1 v/v/v) thu được 17,5 mg hợp chất TO4 dạng bột màu trắng.
-
Xác định cấu trúc hóa học:
- Hợp chất TO1 (Guajadial E): Khối lượng phân tử có cấu trúc meroterpenoid tạo bởi 1 khung benzyldiformylphloroglucinol và 1 khung sesquiterpenoid liên kết qua vị trí C-3 và C-4. Phổ $^1\text{H-NMR}$ ghi nhận 4 nhóm methyl [$\delta_\text{H}$ 0,57 (d, $J=6,6\text{ Hz}$); 0,91 (d, $J=6,6\text{ Hz}$); 0,97 (d, $J=7,2\text{ Hz}$); 1,54 (s)], 2 proton aldehyd [$\delta_\text{H}$ 10,19 (s) và 10,09 (s)], 1 proton olefin [$\delta_\text{H}$ 5,41 (s)] và 5 proton vòng thơm thế mono [$\delta_\text{H}$ 7,16–7,26]. Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ và tương tác HMBC/HSQC khẳng định độ dịch chuyển của 19 tín hiệu cacbon chính, hoàn toàn trùng khớp với dữ liệu công bố của Guajadial E.
- Hợp chất TO4 (Acid ursolic): Triterpenoid ngũ vòng khung ursan ($C_{30}\text{H}{48}\text{O}3$). Phổ $^1\text{H-NMR}$ cho thấy 7 nhóm methyl (gồm 2 nhóm methyl bậc hai tại $\delta\text{H}$ 0,92 và 0,89; 5 nhóm methyl bậc ba tại $\delta\text{H}$ 0,80; 0,85; 0,95; 1,00; 1,12), 1 proton cacbinol tại $\delta_\text{H}$ 3,21 (br.dd) và 1 proton olefin tại $\delta_\text{H}$ 5,26 (m, H-12). Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ ghi nhận 29 tín hiệu cacbon đặc trưng của khung urs-12-en, tương đồng với acid ursolic đối chiếu.
| Thông số thực nghiệm / Hợp chất | Hợp chất TO1 | Hợp chất TO4 |
|---|---|---|
| Tên khoa học xác định | Guajadial E | Acid ursolic |
| Phân loại cấu trúc | Meroterpenoid | Triterpenoid ngũ vòng khung ursan |
| Cảm quan | Bột màu trắng | Bột màu trắng |
| Khối lượng tinh chế thu được | 6,3 mg | 17,5 mg |
| Phân đoạn nguồn gốc | Phân đoạn A (600,0 mg) | Phân đoạn C (832,0 mg) |
| Dung môi đo phổ NMR | $\text{CD}_3\text{OD}$ | $\text{CD}_3\text{OD} + \text{CDCl}_3$ |
| Tín hiệu đặc trưng $^1\text{H-NMR}$ | $\delta_\text{H}$ 10,19; 10,09 (2-CHO); 5,41 (=CH-); 7,16–7,26 (Ar-H) | $\delta_\text{H}$ 5,26 (H-12); 3,21 (H-3); 2,22 (H-18); 7 nhóm $-\text{CH}_3$ |
| Tín hiệu đặc trưng $^{13}\text{C-NMR}$ | $\delta_\text{C}$ 193,7; 192,8 (C=O); 145,6; 128,2 (C=C); 81,6 (C-4) | $\delta_\text{C}$ 79,1 (C-3); 125,7 (C-12); 138,7 (C-13); 53,3 (C-18) |
- Bàn luận:
- Về phương pháp chiết xuất: Phương pháp ngâm nóng ở 60°C với ethanol 96% thực hiện 3 lần giúp chiết kiệt hoạt chất, quy trình dễ tiến hành, dung môi ít độc hại, tuy nhiên thao tác thủ công và dịch chiết có thể lẫn nhiều tạp chất.
- Về phương pháp phân lập: Kết hợp sắc ký cột silica gel pha thuận và pha đảo $\text{RP-C}_{18}$ cùng TLC cho hiệu quả tách phân đoạn tốt, phù hợp quy mô phòng thí nghiệm.
- Về các chất thu được: Guajadial E là meroterpenoid hiếm có hoạt tính ức chế 5 dòng tế bào ung thư ở người (MCF-7, A549, SMMC-7721, SW480, HL-60). Acid ursolic là hợp chất có hoạt tính sinh học đa dạng (kháng viêm, chống ung thư, hạ đường huyết) nhưng thuộc nhóm IV trong Hệ thống Phân loại Dược phẩm Sinh học do độ tan và độ thấm qua màng thấp.
Kết quả và đóng góp
Kết quả chính
- Xây dựng hoàn chỉnh quy trình chiết ngâm nóng từ 2,0 kg lá ổi Thái Bình, thu hồi được 220 g cao cắn ethanol toàn phần và 52 g cao phân đoạn diclomethan.
- Triển khai sắc ký phân tách thành công 7 phân đoạn chính (A–G) từ phân đoạn diclomethan.
- Phân lập thành công 2 hợp chất terpenoid tinh khiết:
- Hợp chất TO1 (6,3 mg) từ phân đoạn A.
- Hợp chất TO4 (17,5 mg) từ phân đoạn C.
- Xác định chính xác cấu trúc hóa học của 2 hợp chất dựa trên tổ hợp phổ 1D và 2D-NMR: TO1 là guajadial E và TO4 là acid ursolic.
Đóng góp khoa học và kiến nghị
- Đóng góp: Khóa luận cung cấp quy trình phân lập chi tiết từng bước (hệ dung môi, loại cột, tỷ lệ giải ly) và bộ thông số phổ NMR chuẩn của guajadial E và acid ursolic từ nguồn lá ổi thu hái tại Việt Nam. Nghiên cứu bổ sung dẫn liệu khoa học về thành phần meroterpenoid và triterpenoid cho nguồn dược liệu lá ổi trong nước.
- Kiến nghị tác giả tự nêu:
- Tiếp tục nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất trong các phân đoạn còn lại gồm B, D, E, F và G.
- Triển khai thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được, đặc biệt là hoạt tính chống ung thư của hợp chất guajadial E.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế: Do giới hạn về mặt thời gian của khóa luận tốt nghiệp, nghiên cứu mới chỉ tập trung phân lập các chất tại 2 phân đoạn (A và C), chưa tiến hành khảo sát thành phần hóa học ở 5 phân đoạn sắc ký còn lại (B, D, E, F, G). Nghiên cứu dừng lại ở mức độ phân lập và giải cấu trúc phổ học, chưa thực hiện các thử nghiệm sinh học in vitro hoặc in vivo đối với các chất sau khi tinh chế.
- Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng sắc ký tinh chế các phân đoạn B, D, E, F, G để tìm kiếm thêm các meroterpenoid và triterpenoid khác; đồng thời tiến hành các phép thử hoạt tính độc tế bào ung thư và nghiên cứu cải thiện đặc tính hòa tan sinh dược học cho acid ursolic.
Giá trị tham khảo
Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho:
- Sinh viên, học viên và nghiên cứu viên: Chuyên ngành Dược học, Hóa dược, Hóa hợp chất thiên nhiên và Công nghệ Hóa học làm việc với các đề tài chiết tách hoạt chất từ thực vật.
- Nội dung tham khảo trọng tâm:
- Quy trình chiết phân bố lỏng - lỏng thu phân đoạn diclomethan từ dược liệu giàu polyphenol/terpenoid.
- Các hệ dung môi chạy cột pha thuận và pha đảo chuyên biệt cho meroterpenoid và triterpenoid ($n$-hexan : aceton; $n$-hexan : $\text{CH}_2\text{Cl}_2$ : MeOH; MeOH : aceton : $\text{H}_2\text{O}$).
- Bảng dữ liệu quy kết độ dịch chuyển hóa học phổ $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, tương tác HSQC và HMBC của guajadial E và acid ursolic.
Câu hỏi thường gặp
1. Dược liệu lá ổi sử dụng trong nghiên cứu được thu hái ở đâu và có tiêu chuẩn gì?
Mẫu lá ổi được thu hái tại xã Đông Hải, huyện Quỳnh Phụ, tỉnh Thái Bình (tọa độ 20°35'52.5''E). Mẫu nghiên cứu là lá bánh tẻ lấy từ cây ổi từ 5 năm tuổi trở lên, không phun thuốc bảo vệ thực vật trong vòng 1 năm trước khi thu hái. Thời gian thu mẫu diễn ra từ 7:00 đến 9:00 sáng trong các tháng 9–10 dương lịch.
2. Khối lượng nguyên liệu và hiệu suất thu nhận các phân đoạn chiết xuất ban đầu là bao nhiêu?
Từ 2,0 kg lá ổi khô ban đầu, qua quá trình chiết ngâm nóng 3 lần với ethanol 96% ở 60°C và cô quay chân không, nghiên cứu thu được 220 g cao đặc ethanol toàn phần. Sau khi phân tán lượng cao này vào nước và chiết phân bố lần lượt với $n$-hexan và dicloromethan, tác giả thu được 52 g cao chiết phân đoạn diclomethan.
3. Hai hợp chất TO1 và TO4 được phân lập từ những phân đoạn nào và có khối lượng bao nhiêu?
- Hợp chất TO1 được phân lập từ phân đoạn A (600,0 mg) thông qua 3 lần sắc ký cột (silica gel pha thuận $\rightarrow$ $\text{RP-C}_{18}$ pha đảo $\rightarrow$ silica gel pha thuận), thu được 6,3 mg tinh chất.
- Hợp chất TO4 được phân lập từ phân đoạn C (832,0 mg) thông qua 3 lần sắc ký cột silica gel pha thuận, thu được 17,5 mg tinh chất.
4. Cấu trúc hóa học của hợp chất TO1 và TO4 được xác định là gì?
- TO1 được xác định là guajadial E, một hợp chất meroterpenoid gồm khung benzyldiformylphloroglucinol liên kết với khung sesquiterpenoid tại C-3 và C-4.
- TO4 được xác định là acid ursolic (acid 3$\beta$-hydroxyurs-12-en-28-oic), một triterpenoid ngũ vòng thuộc khung ursan.
5. Tại sao nghiên cứu lại tập trung phân lập các hợp chất terpenoid từ phân đoạn diclomethan của lá ổi?
Dịch chiết phân đoạn diclomethan là phân đoạn có độ phân cực trung bình, tập trung chủ yếu các hợp chất terpenoid kém phân cực và phân cực trung bình (như meroterpenoid và triterpenoid). Việc loại bỏ phân đoạn $n$-hexan kém phân cực (chứa nhiều chất béo, diệp lục) và phân đoạn nước phân cực cao giúp làm giàu hàm lượng terpenoid, tạo thuận lợi cho việc phân tách bằng sắc ký cột.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Thơm đã thực hiện thành công quy trình chiết xuất từ 2,0 kg lá ổi thu hái tại Thái Bình, thu nhận 220 g cao ethanol toàn phần và 52 g cao phân đoạn diclomethan. Bằng phương pháp sắc ký cột pha thuận và pha đảo kết hợp sắc ký lớp mỏng, đề tài đã phân lập được 2 hợp chất tinh khiết gồm 6,3 mg hợp chất TO1 và 17,5 mg hợp chất TO4. Phân tích dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, HMBC) đã xác định chính xác cấu trúc hóa học của TO1 là guajadial E và TO4 là acid ursolic, góp phần cung cấp dẫn liệu thực nghiệm cho các nghiên cứu khai thác hoạt chất tự nhiên từ nguồn dược liệu Việt Nam.